呂 耀，王立立，徐智敏，李取生，林 欣，周 婷，葉漢杰，高 瓊

（暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣東省環(huán)境污染與健康重點實驗室，廣州 510632）

土壤中的磷、鉀主要以難溶態(tài)的形式存在，難以被植物吸收利用。為了提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，大量化肥被施加到土壤中，肥料的不合理使用不僅破壞了土壤性狀，降低了作物質(zhì)量，還會嚴重污染農(nóng)田和水體環(huán)境，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，研究既能給予農(nóng)作物充分的營養(yǎng)，又不污染農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的肥料是具有應(yīng)用前景的[1]。植物根際促生菌PGPR（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria）指存活于植物根際并且能夠直接或者間接地促進植物生長的有益微生物。目前已經(jīng)鑒定出多種PGPR菌株，其中主要種類包括假單胞菌屬（Pseudomonɑs）、芽孢桿菌屬（Bɑcillus）、固氮菌屬（Azotobɑcter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiellɑ）、慢生型根瘤菌屬（Brɑdyrhizobium）、產(chǎn)堿菌（Alcɑligenes）等[2-3]。根際促生菌通過產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素等生長物質(zhì)或者分泌有機酸釋放礦物中的磷、鉀等養(yǎng)分以促進植物生長[4]。

PGPR在植物根際的定殖對于其充分發(fā)揮促進植物生長的作用至關(guān)重要。細菌定殖過程主要包括趨化作用、群游運動和生物膜形成3個步驟，其中趨化作用指細菌在外界環(huán)境的化學(xué)物質(zhì)刺激下找尋最佳生長和生存環(huán)境所作出的趨向性反應(yīng)，群游運動是表示細菌能夠在表面快速移動的一種細菌運動學(xué)機制，它們是細菌在植物根部定殖的前提條件，生物膜形成過程是指細菌通過附著在植物根際周圍形成生物膜來保護植物抵抗病原菌侵害的過程，細菌能否在植物根際成功定殖取決于這3種作用的強弱[5]。植物根系分泌物是一種營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源，能夠促進細菌生長，同時也能夠作為一種化學(xué)誘導(dǎo)劑，促使土壤微生物在植物根部成功定殖[2]，其主要成分包括有機酸、氨基酸和多糖類物質(zhì)[6]。本研究先采用搖瓶試驗評估T29對難溶態(tài)磷和鉀的活化能力，然后通過趨化、群游、體外實驗以及盆栽實驗探究不同種類的有機酸和氨基酸對T29在菜心根際定殖的影響，從中找到對于T29具有較好定殖效果的有機酸或氨基酸，即為其信號分子。研究結(jié)果可為磷鉀貧瘠地區(qū)微生物肥料的施用提供依據(jù)，同時也能在一定程度上減少磷鉀化肥的施用。

1 材料與方法

1.1 菌種的篩選及鑒定

采集廣州市郊區(qū)菜園土，風(fēng)干，過100目篩。稱取10 g新鮮土樣于90 mL無菌水（內(nèi)含玻璃珠）中包扎好，轉(zhuǎn)移至搖床，于28 ℃、180 r·min-1振蕩20 min，制成菌懸液。吸取1 mL的菌懸液于9 mL無菌水中，吹洗3次，搖勻即為稀釋102倍的菌懸液，依次類推至107。用無菌移液管分別吸取0.1 mL稀釋倍數(shù)為104、105、106、107的菌懸液于相應(yīng)編號的平板內(nèi)，用滅菌冷卻后的三角刮刀在平板上旋轉(zhuǎn)涂布于篩選培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)3～5 d。待平板上長出單菌落后，挑取具有溶鉀圈的單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細菌并保存于斜面中，編號T29。篩選培養(yǎng)基[7]成分：NaCl 0.3 g；MgSO4·7H2O 0.534 3 g；MnSO4·H2O 0.022 7 g；（NH4）2SO40.5 g；FeSO4·7H2O 0.03 g；Na2HPO42 g；鉀長石 1.0 g；葡萄糖 10 g；瓊脂 18～20 g；去離子水1000 mL；pH 7.0～7.5。

菌株T29的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定參照蔡妙英等[8]報道的方法。同時對菌株進行16S rDNA鑒定，首先用試劑盒提取T29菌株總DNA，選用16S rDNA的PCR反應(yīng)通用引物（上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG；下游引物 1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括10.0 μL Taq酶，0.8 μL 27F引物，0.8 μL 1492R引物，1.0 μL DNA模板，7.4 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，最終樣品送至上海美吉生物公司測序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有基因進行比對，獲取同源性較高的相鄰屬、種的16S rDNA序列。

1.2 土壤桿菌的富集及溶磷和溶鉀實驗

從保存的斜面中挑取菌株T29，接種于LB培養(yǎng)基（液體）中，并于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h后取出，經(jīng)4000 r·min-1離心10 min，倒掉上清液，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌管底沉淀的菌體，再用無菌水重懸菌體得到菌懸液。將此菌懸液按2%（2 mL）的接種量加入至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基作為處理組，同時設(shè)不加菌為對照，分別設(shè)置3個平行，共6個樣品。將其轉(zhuǎn)移至搖床于28 ℃、150 r·min-1富集培養(yǎng)7 d后，定容至100 mL容量瓶。將定容后的溶液經(jīng)4000 r·min-1離心10 min后過0.22 μm濾膜，采用雷磁pH計、可見分光光度計和PE原子吸收分光光度儀分別測定濾液的pH、磷和鉀的含量。兩種培養(yǎng)基用于搖瓶中的溶磷和溶鉀實驗以及菌株的富集：（1）改良的pH為7.0～7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基[7-9]，成分為NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.534 3 g、MnSO4·H2O 0.022 7 g、（NH4）2SO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、Ca（3PO4）20.668 g、鉀長石0.3 g、葡萄糖1 g、去離子水1000 mL；（2）pH為7.0～7.5 的LB培養(yǎng)基[10]，成分為胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、去離子水1 L、瓊脂10 g。

1.3 趨化實驗

用移液槍和注射器分別吸取100 μL富集后的T29菌懸液和 200 μL 30 μmol·L-1的有機酸或氨基酸溶液，設(shè)定無菌水為對照。將注射器插入移液器槍頭后，靜置于超凈臺2 h，取出注射器中的有機酸溶液并用無菌水稀釋 10、102、103、104、105、106倍，涂布至 LB培養(yǎng)基，放置于生化培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)2 d。設(shè)置3個平行，并計算平均值作為每種處理對T29趨化作用的影響值[11]。

1.4 群游實驗

配制含30 μmol·L-1有機酸或氨基酸（對照為無菌水）的LB固體培養(yǎng)基。放置8 mm的無菌濾紙片于固體培養(yǎng)基的中心并吸取5 mL富集后的T29菌懸液于濾紙片中央，然后放置于生化培養(yǎng)箱中于28℃培養(yǎng)4 d，從3個不同方向測量菌落直徑。設(shè)置3個平行，并計算平均值作為每種處理對T29群游作用的影響值[11]。

1.5 體外實驗

配制1/4濃度的Hoagland營養(yǎng)液，每個組培瓶加入50 mL營養(yǎng)液與1%（0.5 g）的瓊脂制成固體培養(yǎng)基。將菜心種子用2%次氯酸鈉溶液浸泡30 min，放置于組培瓶中心處，培養(yǎng)2 d。待長出嫩葉后，吸取10 μL富集后的T29菌懸液于距植物根部2 mm處，并添加20 μL的 30 μmol·L-1有機酸溶液（對照為無菌水）在菜心根表面處。培養(yǎng)2周后，收集菜心，剪掉根部，用無菌水洗滌根組織表面，稱重，放入離心管中并加入1 mL無菌水于組織破碎儀中渦旋5 min，用無菌水稀釋10、102、103、104、105、106倍，涂布至LB培養(yǎng)基，然后放置于生化培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)4 d。設(shè)置3個平行，并計算平均值作為每種處理對T29體外作用的影響值[11]。

1.6 盆栽實驗

盆栽土壤采自廣州市郊區(qū)菜園0～20 cm深度的土壤。土壤基本理化性質(zhì)是pH為6.28、全磷含量為2.01 g·kg-1、速效磷含量為94.03 mg·kg-1、全鉀含量為2.52 g·kg-1、速效鉀含量為 98.44 mg·kg-1。由于課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)菜心根系分泌物中葡萄糖酸較多[12]，因而將菜心作為菌株定殖的研究材料。選取飽滿的菜心種子于2%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，播種于石英砂里并置于植物培養(yǎng)箱中，設(shè)定參數(shù)為白天25℃/16 h，黑夜18℃/8 h。待長出嫩葉后轉(zhuǎn)至裝有1.5 kg農(nóng)田土的塑料盆里，每盆4株，每株加入5 mL富集后的T29菌懸液，隔20 d添加1次菌液（OD600=1.0），設(shè)置不加菌為對照，定期澆水，60 d后收獲，測量株高及根、莖葉的干質(zhì)量。收集根際土經(jīng)6000 r·min-1離心10 min得到根際溶液，然后將離心后的根際土烘干測定含水量，將收集的菜心的根和莖葉烘干，分別稱取0.2 g根和莖葉的干樣，加入10 mL濃硝酸與樣品混勻，微波消解，同時消解過程中添加國家標準物質(zhì)（GSV-1）對實驗結(jié)果進行質(zhì)控，后定容至25 mL容量瓶，將定容后的溶液過0.45 μm濾膜，獲得濾液。采用PE火焰原子吸收光譜儀分別測定根際溶液與根、莖葉中鉀的含量。可見分光光度計測定磷的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010進行實驗數(shù)據(jù)處理，SPSS 23對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，OriginPro 8繪制圖形。菜心根際干土的速效磷、鉀含量計算公式如下所示：

式中：B為菜心根際干土中的速效磷、鉀濃度，mg·kg-1；C為根際溶液中的速效磷、鉀濃度，mg·L-1；V為根際土的含水量，mL；m為根際土的干質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定結(jié)果

形態(tài)及生理生化特征：T29菌落呈圓形，邊緣整齊，乳白色，表面光滑，菌體形狀呈桿狀，直徑約為1～2 μm，革蘭氏染色為陰性。生理生化特征如表1所示。

表1 菌株T29的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain T29

16S rDNA測序結(jié)果分析：將T29菌株的測序結(jié)果上傳到NCBI中。并與NCBI中的Genebank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)與根瘤菌屬（Rhizobium sp.）以及土壤桿菌屬（Agrobɑcterium sp.）相似性最高，都達到100%，結(jié)合其生理生化特性，可以確定該菌株為土壤桿菌屬（Agrobɑcterium sp.）。

2.2 T29對難溶礦物中的磷和鉀溶出量及培養(yǎng)液中pH的影響

如圖1所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種T29的培養(yǎng)液中速效鉀和速效磷含量與不加菌相比都顯著增大（P＜0.05），濃度分別為2.78 mg·L-1和15.53 mg·L-1，分別為不加菌的1.54倍和1.42倍，其溶磷率和溶鉀率分別為11.9%和6.6%。不加菌條件下，培養(yǎng)液的pH為6.47，而接種菌液后，培養(yǎng)液中的pH下降至6.17。推測T29通過分泌代謝產(chǎn)物，如有機酸、氨基酸等物質(zhì)，來活化礦物中的難溶態(tài)磷和難溶態(tài)鉀。

圖1 T29在鉀長石中的溶磷、溶鉀能力及接菌處理下培養(yǎng)液中的pH值Figure 1 The ability of T29 to mobilize phosphorus and potassium in K-feldspar and the pH value of the culture medium after inoculating bacteria

2.3 T29在不同有機酸誘導(dǎo)下的趨化響應(yīng)

如圖2所示：乳酸、反丁烯二酸、甲酸、甘氨酸、丙氨酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、草酸、谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、組氨酸吸引的菌落數(shù)與對照（水）相比均有顯著差異（P＜0.05），其中乳酸、反丁烯二酸、甲酸、甘氨酸、丙氨酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、草酸吸引的菌落數(shù)與對照相比顯著減少，表現(xiàn)出負趨化作用。而谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、組氨酸吸引的菌落數(shù)與對照相比顯著增大，其菌落數(shù)分別為2.45×106、3.23×106、3.65×106cfu·mL-1和 3.85×106cfu·mL-1，相比對照分別增加了54.7%、104.2%、130.5%、143.1%，表現(xiàn)出正趨化作用。

2.4 不同有機酸對T29群游運動的影響

圖2 不同有機酸對土壤桿菌趨化作用的影響Figure 2 Effect of different organic acids on the chemotaxis of Agrobɑcterium species

從趨化實驗結(jié)果篩選出對于T29具有正趨化作用的4種物質(zhì)進行群游實驗。如圖3所示：在α=0.05水平時，谷氨酸、亮氨酸、組氨酸誘導(dǎo)下T29生長的菌落直徑與對照相比均無明顯變化，而在葡萄糖酸的誘導(dǎo)下T29長勢良好，其菌落直徑為2.18 cm，相比對照增大了54.6%。

2.5 不同有機酸誘導(dǎo)下T29的體外作用的評估

從趨化和群游實驗結(jié)果得出葡萄糖酸對T29具有一定的吸引作用，進一步通過體外實驗來評估葡萄糖酸對T29在菜心根際定殖的影響。如圖4所示，添加了葡萄糖酸在菜心根際后，其根部吸引的菌落數(shù)目為2.98×106cfu·g-1，相比對照增加了29.1%。說明葡萄糖酸會促進T29在菜心根部表面形成生物膜。

2.6 T29在土培菜心根際的定殖

如圖5A和圖5B所示，加菌后菜心的生物量與不加菌相比顯著提高（P＜0.05），其中根干質(zhì)量為0.49 g，比不加菌增加了24.2%，莖葉干質(zhì)量為3.96 g，比不加菌增加了50.2%。同時加菌處理根際土壤中的速效磷、速效鉀含量也顯著高于不加菌（P＜0.05），其含量分別為0.11 mg·kg-1和0.22 mg·kg-1，與不加菌相比，分別增加了37.5%和52.8%。如圖5C所示，接菌后菜心根部的磷、鉀含量與不加菌相比沒有顯著變化，但是莖葉中的磷、鉀含量相比不加菌均有顯著提高（P＜0.05，其含量分別為6.36 g·kg-1和21.32 g·kg-1，與不加菌相比，分別增加了49.3%和56.4%。同時接菌條件下菜心的株高為37.9 cm，約為不加菌的1.48倍（圖5D）。

3 討論

圖3 不同有機酸對于土壤桿菌群游作用的影響Figure 3 Effect of different organic acids on the swarm of Agrobɑcterium species

圖4 葡萄糖酸作用下菜心根部吸引菌落的水平Figure 4 The population levels of colony recruited by Chinese flowering cabbages roots under the action of gluconic acid

本研究從農(nóng)田土中篩選出一株具有解鉀能力的細菌T29，經(jīng)過菌株形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，鑒定為土壤桿菌屬（Agrobɑcterium sp.）。搖瓶實驗結(jié)果表明T29活化難溶態(tài)磷和難溶態(tài)鉀的能力較強，具有作為微生物肥料的研究前景。另外有研究表明有機酸不僅能夠作為根際促生菌的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源，還能作為一種信號物質(zhì)吸引細菌在植物根際定殖[13]。因此我們采用趨化、群游、體外和盆栽實驗探究不同種類的有機酸和氨基酸對土壤桿菌在菜心根際定殖及其活化土壤中磷、鉀的影響，從而確定對于T29具有較好定殖效果的有機酸或氨基酸為其信號分子。

圖5 接菌處理下菜心根際干土的速效P和速效K含量、根與莖葉中的P和K含量及菜心的根與莖葉干質(zhì)量和株高Figure 5 The content of available phosphorus and potassium in dry Chinese flowering cabbages rhizosphere soil，the content of phosphorus and potassium in the dry root,stems and leaves，the dry weight of root and stems and leaves and the height after inoculating bacteria

趨化實驗結(jié)果表明谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、組氨酸吸引的T29菌落數(shù)顯著大于對照（P＜0.05），說明這幾種物質(zhì)能夠作為化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)T29作定向移動，對其具有一定的正趨化作用。趙大君等[14]也發(fā)現(xiàn)鳳眼蓮根分泌物中的組氨酸、甘氨酸等氨基酸對根際腸桿菌屬（Rhizosphere Enterobɑcter sp.）F2具有一定的正趨化作用。另外不同的有機酸和氨基酸誘導(dǎo)下T29的趨化效果呈現(xiàn)明顯差異，可能與細菌表面是否存在能夠感知這些化學(xué)物質(zhì)的受體蛋白有關(guān)，細菌通過受體蛋白來感知環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，并將收到的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號，從而控制鞭毛的運動方式，表現(xiàn)出相應(yīng)的趨化性[15]。Zhulin[16]也報道了大腸桿菌（Escherichiɑ coli）的Tar受體蛋白能夠感應(yīng)谷氨酸的刺激并轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的鞭毛馬達反應(yīng)。除趨化作用外，群游運動也是細菌在植物根系定殖的一個重要因素，它是一種促使細菌在表面快速移動的動力學(xué)機制，其能力的強弱被認為是細菌在根際定殖的重要前提[17]。實驗結(jié)果表明葡萄糖酸誘導(dǎo)下T29生長的菌落直徑與對照相比顯著增大，說明在葡萄糖酸的作用下，T29的群游運動能力得到了顯著提高（P＜0.05）。其主要原因可能是葡萄糖酸誘導(dǎo)下T29鞭毛數(shù)量的增加，一定程度上加強了其群游運動的能力。Park等[18]研究也發(fā)現(xiàn)桔霉素處理下鞭毛數(shù)量的增加促進了多黏類芽孢桿菌（P.polymyxɑ strain）E681群游能力的增強。趨化作用和群游運動只是細菌在植物根部表面定殖的先決條件，細菌在植物根部表面定殖時最終會形成生物膜，而生物膜作用是細菌附著和聚集在植物根際表面形成保護膜的過程。本研究通過體外實驗來評估土壤桿菌T29在菜心根系定殖形成生物膜的能力。通過外源添加一定濃度的葡萄糖酸在菜心根際，得到其根際表面細菌數(shù)量顯著高于對照（P＜0.05），這與葡萄糖酸的趨化和群游實驗結(jié)果也是一致的。說明葡萄糖酸能夠誘導(dǎo)T29在菜心根際定殖形成生物膜，其一定程度上促進了與生物膜形成有關(guān)的基因的表達。有研究表明生物膜形成過程中，epsD、yqxM是合成胞外多糖和TasA蛋白的關(guān)鍵的生物合成基因[19]，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)蘋果酸會通過提高生物膜操縱子yqxM的表達，促進枯草芽孢桿菌（Bɑcillus subtilis）的生物膜形成。Yuan等[21]也報道了富馬酸誘導(dǎo)下解淀粉芽孢桿菌生物膜的生物量出現(xiàn)顯著提高，同時epsD和yqxM這兩個與生物膜形成相關(guān)的基因的表達量也顯著上調(diào)（P＜0.05）。盆栽實驗中，接菌后菜心根際土中的速效磷和速效鉀含量相比不接菌顯著增加，其生物量與不加菌相比也顯著增長（P＜0.05）。由于菜心根系分泌物中含有葡萄糖酸[12]，并且綜合趨化、群游與體外實驗結(jié)果，推測葡萄糖酸作為一種信號分子能夠有效吸引T29在菜心根際定殖，其代謝產(chǎn)物有助于將土壤中的難溶態(tài)磷和難溶態(tài)鉀轉(zhuǎn)化為生物有效態(tài)以供菜心吸收利用，從而促進了菜心的生長。

4 結(jié)論

（1）本研究從農(nóng)田土中篩選出一株解鉀菌，結(jié)合其形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，鑒定為土壤桿菌屬（Agrobɑcterium sp.）。

（2）搖瓶實驗中，T29對難溶態(tài)磷和難溶態(tài)鉀的活化量分別為15.53 mg·L-1和2.78 mg·L-1，分別為對照的1.42倍和1.54倍，其溶磷率和溶鉀率分別為11.9%和6.6%，說明T29溶磷和溶鉀效果較好，具有作為菌肥的發(fā)展前景。

（3）趨化、群游、體外和盆栽實驗表明葡萄糖酸作為菌株T29的信號分子，能夠吸引其在菜心根際定殖，從而將土壤中的難溶態(tài)磷和難溶態(tài)鉀轉(zhuǎn)化為生物有效態(tài)以供菜心吸收利用，促進菜心的生長。