郭碧林，陳效民，景 峰，張曉玲，楊之江，劉 巍，劉文心

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

鎘（Cd）是毒性極大的重金屬，具有較強(qiáng)的潛伏性、隱蔽性、滯后性、積累性、不可逆轉(zhuǎn)性及降解、治理難度大等特點(diǎn)，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為強(qiáng)致癌物質(zhì)之一。相關(guān)研究已證實(shí)[1]：低濃度的Cd也會(huì)危害人體健康，即使Cd含量未達(dá)到毒害植物的濃度，也會(huì)使植物可食部分的Cd含量超出人類的可食用標(biāo)準(zhǔn)。目前我國(guó)總耕地面積約為1.2億hm2，而我國(guó)受重金屬污染的耕地面積高達(dá)5000萬(wàn)hm2，其中，中、重度耕地污染面積相當(dāng)于全國(guó)耕地總面積的1/40[2]，因此，對(duì)我國(guó)耕地土壤進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)及污染修復(fù)的行動(dòng)迫在眉睫。

土壤微生物和土壤酶是生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的部分[3]，其中土壤微生物不僅可以促進(jìn)土壤養(yǎng)分和土壤有機(jī)質(zhì)的循環(huán)與轉(zhuǎn)化，而且還參與土壤有機(jī)質(zhì)的礦化和土壤腐殖質(zhì)的形成，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。而土壤酶活性易受到土壤物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)及這三種性質(zhì)共同影響，其活性變化明顯，因此可直接反映土壤生物化學(xué)過(guò)程的方向和強(qiáng)度，可作為評(píng)價(jià)土壤肥力的一個(gè)靈敏性生物指標(biāo)[4]。有研究表明，土壤微生物生物量和土壤酶活性與重金屬污染程度存在顯著的負(fù)相關(guān)[5-6]。段學(xué)軍等[7]的研究表明，適量濃度的Cd含量可以刺激土壤微生物生長(zhǎng)，提高土壤酶活性。

紅壤是我國(guó)亞熱帶地區(qū)的主要土壤類型，而水稻土又是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的土壤種類之一，由于過(guò)量施用化肥農(nóng)藥以及一些不當(dāng)?shù)霓r(nóng)事操作造成了土壤中重金屬含量超標(biāo)[8-9]，從而降低了土壤質(zhì)量和作物品質(zhì)及產(chǎn)量，嚴(yán)重影響了整個(gè)紅壤地區(qū)農(nóng)業(yè)及經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者也對(duì)重金屬污染進(jìn)行了大量研究，但大部分的研究主要針對(duì)礦區(qū)土壤及旱地土壤，而關(guān)于重金屬污染導(dǎo)致紅壤性水稻土中土壤微生物學(xué)特性發(fā)生變化的研究報(bào)道較少。因此本文以湖南紅壤性水稻土為研究對(duì)象，通過(guò)野外采集土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)模擬試驗(yàn)，研究了外源Cd脅迫濃度對(duì)紅壤性水稻土中土壤微生物生物量碳、氮和土壤酶活性的影響，探討了外源Cd脅迫濃度與土壤微生物學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系，以期為紅壤性水稻土重金屬污染研究提供生物學(xué)指標(biāo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集及實(shí)驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)區(qū)位于湖南省長(zhǎng)沙縣北山鎮(zhèn)榮合橋社區(qū)長(zhǎng)沙春雷農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司試驗(yàn)基地（28°26′12″N，113°3′33″E），氣候條件優(yōu)越，年降雨量 1 422.4 mm，年蒸發(fā)量1 382.2 mm，無(wú)霜期275 d，年積溫6 480℃，年平均氣溫16.8～17.2℃，日照時(shí)數(shù)1 677.1 h。該地區(qū)土壤是由第四紀(jì)紅色黏土發(fā)育而來(lái)的紅壤性水稻土。于2017年4月17日按5點(diǎn)取樣法采集土壤0～15 cm深度的新鮮土樣，混合均勻后裝入無(wú)菌塑料袋中密封帶回實(shí)驗(yàn)室備用。對(duì)采集的土樣進(jìn)行風(fēng)干處理，一部分用于測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)，一部分用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使用。

稱取18份過(guò)2 mm篩的風(fēng)干土，每份300 g；再分別配制 0、1、3、5、7、10 mg·kg-1濃度梯度的 CdCl2·2.5H2O水溶液500 mL，將土樣分別與不同濃度的CdCl2·2.5H2O水溶液混合均勻，每個(gè)處理重復(fù)3次，使土壤含水量為田間最大持水量的60%（即每份土樣添加101.52 mL的CdCl2·2.5H2O水溶液），使添加Cd濃度分別為0、1、3、5、7、10 mg·kg-1，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，每日定時(shí)取出，用稱重法來(lái)控制土樣的含水量，30 d后將土樣風(fēng)干，進(jìn)行各項(xiàng)目的測(cè)定。

1.2 分析方法

土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定參照《土壤農(nóng)化分析》[10]，土壤全量Cd的測(cè)定采用氫氟酸-硝酸-高氯酸消煮，ICP-MS測(cè)定；土壤微生物生物量碳、氮含量，測(cè)定方法采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法；脲酶、蔗糖酶和過(guò)氧化氫酶活性分別采用靛酚藍(lán)比色法、3，5-二硝基水楊酸比色法和高錳酸鉀滴定法測(cè)定[11]。結(jié)果見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行通徑分析，顯著性水平設(shè)為α=0.05。通徑分析即：將相關(guān)系數(shù)分為直接通徑系數(shù)和間接通徑系數(shù)，更直觀地了解它們的作用方式。其計(jì)算原理：設(shè)在p個(gè)自變量x1，x2，…，xp中，每?jī)蓚€(gè)變量之間和應(yīng)變量y之間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)能夠組成求解通徑系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化正規(guī)方程，即：

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

式中：T1，T2，…，Tp為直接通徑系數(shù)。直接通徑系數(shù)可以通過(guò)上述相關(guān)矩陣的逆矩陣計(jì)算獲得。

間接通徑系數(shù)能夠通過(guò)相關(guān)系數(shù)和直接通徑系數(shù)的乘積來(lái)計(jì)算[12]；決定系數(shù)可通過(guò)相關(guān)系數(shù)、直接通徑系數(shù)與間接通徑系數(shù)總和三者來(lái)計(jì)算，即：決定系數(shù)=相關(guān)系數(shù)×直接通徑系數(shù)+間接通徑系數(shù)總和×直接通徑系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Cd脅迫對(duì)紅壤性水稻土微生物生物量碳、氮的影響

圖1外源Cd脅迫對(duì)水稻土微生物生物量碳、氮的影響Figure 1 Effects of cadmium stress on microbial biomass carbon，nitrogen in paddy soil

圖1 顯示了外源Cd脅迫對(duì)紅壤性水稻土微生物生物量碳、氮的影響。隨著外源Cd濃度的增加，土壤微生物生物量碳、氮含量較對(duì)照均呈先增加后減少的趨勢(shì)。在外源Cd脅迫濃度為1 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物生物量碳、氮含量呈增加的趨勢(shì)，其中土壤微生物生物量氮含量較對(duì)照顯著增加（P＜0.05），增幅為22.85%；隨著外源Cd脅迫濃度的繼續(xù)上升，土壤微生物生物量碳、氮含量逐漸下降，且外源Cd脅迫濃度越高，下降趨勢(shì)越明顯。在外源Cd脅迫濃度分別為7 mg·kg-1和10 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物生物量碳含量較對(duì)照分別降低了36.96%和41.32%；而在外源Cd脅迫濃度分別為3、5、7 mg·kg-1和10 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物生物量氮含量顯著降低，較對(duì)照分別降低了43.99%、57.37%、67.07%和74.42%。

2.2 外源Cd脅迫對(duì)紅壤性水稻土酶活性的影響

土壤酶活性是反映土壤肥力狀況、土壤自凈能力以及土壤重金屬污染程度的重要指標(biāo)。由表2可知，過(guò)氧化氫酶、脲酶和脫氫酶活性均隨外源Cd脅迫濃度的增加而減少，且外源Cd脅迫濃度越大下降趨勢(shì)越明顯；而蔗糖酶活性則表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)。在外源Cd脅迫濃度為1 mg·kg-1時(shí)，與對(duì)照相比，過(guò)氧化氫酶和脲酶活性均顯著降低（P＜0.05），較對(duì)照分別下降了6.70%和15.50%；當(dāng)外源Cd脅迫達(dá)到3 mg·kg-1時(shí)，與對(duì)照相比，過(guò)氧化氫酶、脲酶和脫氫酶活性均顯著降低，而蔗糖酶活性則顯著升高；當(dāng)外源Cd脅迫濃度為7 mg·kg-1時(shí)，蔗糖酶活性達(dá)最大值，較對(duì)照增加了12.74%；當(dāng)外源Cd脅迫濃度為10 mg·kg-1時(shí)，過(guò)氧化氫酶、脲酶和脫氫酶活性均達(dá)最低值，較對(duì)照分別下降了25%、34.88%和14.52%，而蔗糖酶活性較對(duì)照增加了6.37%。

表2 Cd脅迫對(duì)水稻土酶活性的影響Table 2 Effects of cadmium stress on enzyme activities in paddy soil

2.3 Cd脅迫濃度與微生物學(xué)指標(biāo)之間的通徑分析

為了進(jìn)一步探討重金屬Cd對(duì)微生物學(xué)指標(biāo)影響，利用通徑分析統(tǒng)計(jì)方法將重金屬Cd與微生物學(xué)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)分為直接作用和間接作用。從表3可知，Cd脅迫對(duì)微生物生物量碳的直接作用最大（直接通徑系數(shù)為-1.110），其余按直接通徑系數(shù)大?。ń^對(duì)值）從大到小依次為脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、微生物生物量氮和脲酶。其中Cd脅迫對(duì)蔗糖酶的直接影響是正效應(yīng)，而對(duì)其他微生物學(xué)指標(biāo)的直接影響則是負(fù)效應(yīng)。外源Cd脅迫對(duì)微生物生物量碳、過(guò)氧化氫酶、脫氫酶這3個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的直接通徑系數(shù)均顯著大于各自間接通徑系數(shù)總和，且這3個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的間接作用系數(shù)總和很小，說(shuō)明了Cd脅迫對(duì)這3個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的影響主要是體現(xiàn)在直接作用上，與其他微生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)作用較弱，其余微生物學(xué)指標(biāo)與Cd脅迫濃度的直接通徑系數(shù)相關(guān)性較低，隨著Cd脅迫濃度的增加，過(guò)氧化氫酶和脫氫酶活性減少。通過(guò)表3中的間接通徑系數(shù)總和可知，微生物生物量氮和脲酶的間接通徑系數(shù)之和遠(yuǎn)大于其直接通徑系數(shù)，分別是-0.687和-0.587，與其他微生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)作用較強(qiáng)，說(shuō)明外源Cd主要通過(guò)影響其他微生物指標(biāo)活性間接影響該指標(biāo)的活性。其中蔗糖酶的直接通徑系數(shù)為0.675，間接通徑系數(shù)之和為-1.212，其間接通徑系數(shù)之和大于直接通徑系數(shù)，說(shuō)明外源Cd的加入通過(guò)影響土壤理化性質(zhì)和其他微生物學(xué)指標(biāo)來(lái)間接影響土壤蔗糖酶活性，并使間接作用略大于直接作用，從而導(dǎo)致了蔗糖酶的變化趨勢(shì)異于其他微生物學(xué)指標(biāo)的變化趨勢(shì)。

由表3可知，外源Cd脅迫與各微生物學(xué)指標(biāo)存在極顯著的相關(guān)性，其中Cd與脫氫酶的相關(guān)性最大，對(duì)其他微生物學(xué)指標(biāo)相關(guān)性（絕對(duì)值）從大到小依次為：過(guò)氧化氫酶、微生物生物量氮、微生物生物量碳、脲酶、蔗糖酶。而通過(guò)計(jì)算得出的決定系數(shù)表明，外源Cd脅迫對(duì)脫氫酶的綜合決定能力最大，對(duì)其他微生物學(xué)指標(biāo)的綜合決定能力大小（絕對(duì)值）依次是：過(guò)氧化氫酶、微生物生物量碳、蔗糖酶、微生物生物量氮和脲酶。

3 討論

3.1 Cd脅迫對(duì)土壤微生物生物量的影響

土壤微生物生物量碳是土壤中活性有機(jī)質(zhì)的重要組成部分，其含量?jī)H占土壤有機(jī)質(zhì)的1%～4%，但在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，而土壤微生物生物量氮含量是衡量土壤重金屬污染程度的重要指標(biāo)，可用于評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量，指示土壤生態(tài)系統(tǒng)變化狀況[13-14]。韓桂琪等[15]通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重金屬Cd、Zn、Cu和Pb復(fù)合污染對(duì)微生物生物量的影響與其濃度有關(guān)，在較低濃度時(shí)刺激微生物生物量的增加，而高濃度時(shí)則表現(xiàn)為抑制；趙輝等[16]通過(guò)以菜地土為盆栽試驗(yàn)的供試土壤進(jìn)行試驗(yàn)表明，低濃度Cd（≤2.0 mg·kg-1），可增加土壤中微生物生物量碳含量；而王秀麗等[17]研究則表明，銅鋅冶煉廠附近的水稻土中土壤微生物生物量碳、氮含量隨Cd脅迫濃度的增加而逐漸減少。由此可以得出，土壤重金屬污染對(duì)土壤微生物生物量的影響主要與重金屬的含量有關(guān)。在本研究中Cd脅迫對(duì)湖南紅壤性水稻土土壤微生物生物量碳、氮含量影響的變化趨勢(shì)基本相同，隨著Cd脅迫濃度的增加，與對(duì)照相比微生物生物量碳、氮含量均呈先增加后減少的趨勢(shì)，這與曾路生等[18]研究結(jié)果基本一致。由表3可知，微生物生物量碳含量主要是外源Cd的直接作用的結(jié)果，這可能是因?yàn)镃d是土壤微量元素的一種，低濃度時(shí)可以刺激土壤微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖[19]，加強(qiáng)微生物活動(dòng)，在一定程度下增加土壤微生物生物量碳含量，而隨著Cd脅迫濃度的增加，Cd的毒害作用大于刺激作用，進(jìn)而抑制了土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖，影響微生物種群的生存能力或競(jìng)爭(zhēng)能力，導(dǎo)致微生物生物量碳含量降低。從表3可得，微生物生物量氮含量變化主要是外源Cd的直接作用和間接作用的結(jié)果，其中外源Cd的間接作用占主導(dǎo)因素。外源Cd通過(guò)影響土壤微生物和土壤酶活性間接導(dǎo)致了土壤微生物生物量氮含量先增大后減小。

表3 Cd脅迫濃度與微生物學(xué)指標(biāo)之間的通徑分析Table 3 Path analysis between cadmium stress and microbiological indicators

3.2 Cd脅迫對(duì)土壤酶的影響

土壤酶主要源于土壤微生物的分泌，是土壤結(jié)構(gòu)中的重要組成部分[20]。在本研究中，隨著外源Cd脅迫濃度的增加，脫氫酶、過(guò)氧化氫酶和脲酶的活性逐漸降低，且與外源Cd脅迫濃度表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)，通過(guò)通徑分析可知，外源Cd對(duì)過(guò)氧化氫酶和脫氫酶活性的直接抑制作用（-1.008，-1.048）大于間接促進(jìn)作用（0.127，0.098）；外源Cd對(duì)脲酶活性的直接抑制作用（-0.161）和間接抑制作用（-0.587）均造成了土壤脲酶活性下降；而外源Cd對(duì)蔗糖酶的直接促進(jìn)作用（0.675）小于間接抑制作用（-1.212）。外源Cd抑制脫氫酶、過(guò)氧化氫酶和脲酶活性機(jī)理主要是因?yàn)镃d2+可以與酶分子中的活性部位-巰基和含咪唑的配位體等結(jié)合，形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而與底物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)作用，抑制酶活性；其次是由于重金屬污染土壤微生物的生存環(huán)境，抑制了土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖，從而減少了體內(nèi)酶的分泌和合成，最后導(dǎo)致土壤酶活性下降[21]；而蔗糖酶活性隨著外源Cd脅迫濃度的增加表現(xiàn)出先下降再上升后下降的趨勢(shì)，這與吳丹等[22]研究結(jié)果相似，因?yàn)镃d對(duì)蔗糖酶活性具有刺激作用，Cd的加入可以促進(jìn)酶的活性中心與底物間的配位結(jié)合，保持酶分子的專性結(jié)構(gòu)，同時(shí)改變了酶催化反應(yīng)的平衡條件，增加了蔗糖酶活性，而后隨著Cd脅迫濃度的增加，Cd占據(jù)了酶分子的活性中心，或與酶分子的羧基、巰基和氨基等相結(jié)合，導(dǎo)致酶活性降低[23]。

3.3 微生物生物量與土壤酶活性的相互作用

土壤酶主要來(lái)源于土壤微生物，而土壤酶活性與土壤微生物的數(shù)量、生物量、多樣性以及土壤動(dòng)物的數(shù)量呈顯著或極顯著正相關(guān)[24]。通徑分析表明，Cd脅迫對(duì)各個(gè)微生物學(xué)指標(biāo)的影響是相互的，Cd脅迫對(duì)微生物生物量氮、脲酶及蔗糖酶活性的影響除了其本身的直接作用外，主要還是通過(guò)Cd脅迫對(duì)其他微生物學(xué)指標(biāo)的影響來(lái)間接影響它們的活性，其間接作用大于直接作用；對(duì)于微生物生物量碳、過(guò)氧化氫酶及脫氫酶活性而言，Cd對(duì)其活性的影響是直接的，其中對(duì)微生物生物量碳的直接作用最大（-1.110）。在本研究中，土壤中各微生物學(xué)指標(biāo)（微生物生物量碳、氮、過(guò)氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶）都可衡量土壤重金屬污染程度，其中Cd脅迫與脫氫酶的相關(guān)系數(shù)最大（r=-0.952**）。因此，用脫氫酶活性衡量重金屬污染程度更為準(zhǔn)確，可作為湖南紅壤性水稻土Cd污染土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的靈敏指標(biāo)。

4 結(jié)論

（1）對(duì)湖南紅壤性水稻土進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)可知，土壤微生物量和酶活性隨外源Cd脅迫濃度的變化而相應(yīng)變化，微生物量和蔗糖酶活性隨外源Cd脅迫濃度的增加先增加后減少，而過(guò)氧化氫酶、脫氫酶和脲酶活性則隨著Cd脅迫濃度的增加而顯著降低。

（2）通徑分析表明土壤微生物生物量碳、氮、過(guò)氧化氫酶、脲酶和脫氫酶與Cd脅迫濃度存在極顯著（P＜0.01）的負(fù)相關(guān)，而蔗糖酶與Cd脅迫濃度存在極顯著（P＜0.01）的正相關(guān)；它們均可作為衡量土壤重金屬污染程度的敏感指標(biāo)，其中脫氫酶與Cd脅迫濃度的相關(guān)性最大，能夠更加準(zhǔn)確地衡量湖南紅壤性水稻土Cd污染程度；與微生物生物量碳的直接通徑系數(shù)最大，與脲酶的直接通徑系數(shù)最小。