石 峰，魏曉雪，馮劍豐，朱 琳

（南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染過程與環(huán)境基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)試驗(yàn)室，天津300071）

在海洋環(huán)境中，氮是浮游植物賴以生存的必需元素之一，氮循環(huán)調(diào)控著海洋中氮營養(yǎng)物的可利用性和生物生產(chǎn)力，對(duì)于海洋生態(tài)系統(tǒng)的功能至關(guān)重要。自20世紀(jì)中期以來，人類經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的飛速發(fā)展，將各種生活污水和工業(yè)廢水大量排入江河湖海，近海水體中無機(jī)氮含量的快速增長(zhǎng)，改變了浮游植物的群落組成和演替規(guī)律，打破了水體中原有的氮素轉(zhuǎn)化平衡，造成了近海河口區(qū)域的富營養(yǎng)化及有害藻華頻發(fā)[1]。因此有害藻華的防治工作已經(jīng)成為全世界鄰海國家亟待解決的生態(tài)環(huán)境問題，氮素營養(yǎng)與浮游植物的關(guān)系也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

海洋生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)模型作為定量地認(rèn)識(shí)和分析海洋生態(tài)系統(tǒng)現(xiàn)象的有力工具，近年來得到了長(zhǎng)足發(fā)展。用生態(tài)動(dòng)力學(xué)模型的方法定量研究浮游植物種群動(dòng)力學(xué)與營養(yǎng)鹽吸收動(dòng)力學(xué)的耦合關(guān)系是一個(gè)非常重要的方向，Malerba等[11]以Quota模型為基礎(chǔ)，模擬了不同形態(tài)的銨-硝氮源、饑餓時(shí)間等因素對(duì)小球藻（Chlorellɑ sp.）生長(zhǎng)的影響。Alijani等[12]則是基于生態(tài)化學(xué)計(jì)量比理論構(gòu)建模型，用于模擬光強(qiáng)和碳、磷等營養(yǎng)鹽對(duì)藻菌關(guān)系的影響，該模型較好地模擬了浮游植物和細(xì)菌對(duì)多變的營養(yǎng)鹽和光照條件的響應(yīng)。Daines等[13]基于藻類生理功能特征和資源分配平衡角度構(gòu)建模型，深入分析了藻細(xì)胞內(nèi)氮、磷元素的流向，使動(dòng)力學(xué)模型和生物化學(xué)過程得到有機(jī)的結(jié)合。這些模型都在一定程度上很好地描述和分析了營養(yǎng)鹽與浮游植物之間的相互關(guān)系。海洋生物與環(huán)境之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，隨著我們對(duì)海洋環(huán)境認(rèn)識(shí)的不斷深入，解決這些難題的必要性也日益提升，通過現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)合模型預(yù)測(cè)的方法為研究這些復(fù)雜機(jī)制提供新思路。

本文通過分析我國渤海代表性硅藻——三角褐指藻在不同形態(tài)、不同濃度無機(jī)氮源培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和氮吸收動(dòng)力學(xué)特征，為理解浮游植物銨-硝氮源吸收動(dòng)力學(xué)機(jī)制提供一種可能的解釋和補(bǔ)充，為防治有害藻華和探索富營養(yǎng)化條件下優(yōu)勢(shì)藻的形成機(jī)理提供理論依據(jù)。同時(shí)，通過構(gòu)建簡(jiǎn)單有效的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)所得動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)，力求為相關(guān)研究提供一種可行的輔助分析手段。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

三角褐指藻（Phɑeodɑctylum tricornutum）購自中科院海洋研究所微藻種質(zhì)庫。所購藻種在本試驗(yàn)室經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)3次以后，即可作為受試藻種。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)基礎(chǔ)介質(zhì)為人工海水[14]（鹽度約為3.5%，初始pH為7.06），培養(yǎng)基選用f/2改良培養(yǎng)基[15]，其中氮源及其濃度根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)整。藻種置于1000 mL三角瓶，在光照培養(yǎng)箱（LRH-250-GS II人工氣候箱，廣東省醫(yī)療器械廠）中進(jìn)行一次性培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為800 mL，初始藻密度約為2×104cells·mL-1，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行組，培養(yǎng)溫度為（22±1）°C，光暗比為12L∶12D，光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1，每天定時(shí)搖瓶3～4次，并隨機(jī)變換三角瓶的位置。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)試驗(yàn)需要，設(shè)置3個(gè)氮濃度，分別為40、60 μmol·L-1和 500 μmol·L-1。其中 40 μmol·L-1和 60 μmol·L-1為接近自然海水中的無機(jī)氮濃度，另外為觀察在差異明顯的高濃度氮培養(yǎng)條件下三角褐指藻的生長(zhǎng)情況、氮吸收動(dòng)力學(xué)特征、兩種無機(jī)氮源的相互關(guān)系，以及為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的適用范圍，同時(shí)為觀察較高的氨氮濃度是否對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生毒性抑制效應(yīng)[16]，我們依據(jù)樊娟[17]的研究結(jié)果，選擇 500 μmol·L-1為高氮濃度組。同時(shí)設(shè)置3種氮源添加方式，Ⅰ組為單加-N試驗(yàn)組，Ⅱ組為單加-N試驗(yàn)組，Ⅲ組為-N和-N混合試驗(yàn)組，具體詳見表1。試驗(yàn)從接種初始日起，測(cè)定初始藻細(xì)胞密度、藻細(xì)胞內(nèi)氮素含量和培養(yǎng)基中兩種無機(jī)氮濃度，之后每48 h測(cè)定一次，直至氮源耗盡，停止試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 The scheme of experimental design

1.4 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

利用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)藻細(xì)胞數(shù)量。采集約3 mL水樣于低溫保存管中，用終濃度為1%的戊二醛固定，混合均勻后室溫下靜置15 min，液氮冰凍后于-80℃保存?zhèn)溆?，樣品后續(xù)進(jìn)行批量檢測(cè)。將固定樣品于37℃下水浴解凍，用SYBR Green I染料染色，室溫下黑暗處理15 min，上流式細(xì)胞儀（BD C6plus）（設(shè)定488 nm，15 mW氬激光），并在530/30 nm測(cè)量，根據(jù)不同的坐標(biāo)參數(shù)（FITC、SSC、PerCP-Cy5-5-H等）對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)[18]。

1.5 培養(yǎng)液中-N-N濃度的測(cè)定

藻液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液，用次溴酸鈉氧化法測(cè)定-N，鋅鎘還原法測(cè)定-N[19]。

1.6 藻細(xì)胞內(nèi)氮含量的測(cè)定

取50 mL三角褐指藻藻液，將藻細(xì)胞過濾在0.7 μm Whatman GF/F濾膜（濾膜需預(yù)先經(jīng)450℃煅燒12 h）上，60℃烘干后用元素分析儀（EURO EA3000）測(cè)定藻細(xì)胞內(nèi)的N含量（單位為g·50 mL-1）。該部分?jǐn)?shù)據(jù)主要應(yīng)用于模型擬合過程，詳見1.7。

1.7 模型方程的建立與參數(shù)估計(jì)

本文所構(gòu)建模型是在參考了Lawson等[20]所建立的一個(gè)經(jīng)典的海洋生態(tài)系統(tǒng)模型的基礎(chǔ)上，通過對(duì)原模型中一些理化因素（如浮游動(dòng)物捕食、光照等）進(jìn)行簡(jiǎn)化而得到。不同氮培養(yǎng)條件下模型方程的主要形式如下所示。

（3）混合氮源試驗(yàn)組

式中：CNH4代表培養(yǎng)基中-N的底物濃度，μmol·L-1；CNO3代表培養(yǎng)基中-N的底物濃度，μmol·L-1；k代表氮的半飽和吸收常數(shù)，μmol·L-1；μ代表藻的最大比生長(zhǎng)速率，d-1；P代表每升溶液中所有藻體內(nèi)氮含量，μmol·L-1；γ代表-N對(duì)-N的抑制常數(shù)；β代表藻類死亡后再生為-N的比例系數(shù)；ε代表藻細(xì)胞的死亡率，d-1。

其中，P的換算公式為：50 mL溶液中所有藻體內(nèi)氮含量（μg）×20÷14

模型擬合所需參數(shù)是在參考大量前人相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上[7，21-24]，初步選定初始值（遵循的原則為：優(yōu)先考慮三角褐指藻相關(guān)的參數(shù)，其次考慮與三角褐指藻相近種屬藻類的參數(shù)），然后運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)中40 μmol·L-1氮培養(yǎng)條件下3組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過下山單純形法（Nelder-Mead）優(yōu)化得到試驗(yàn)參數(shù)值。接下來，進(jìn)一步通過該參數(shù)對(duì)60 μmol·L-1及500 μmol·L-1濃度試驗(yàn)組進(jìn)行模型擬合，驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)效果。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用SigmaPlot 10.0和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型擬合采用R 3.4.3進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻在不同氮培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況

圖1 不同氮源培養(yǎng)條件下三角褐指藻生長(zhǎng)曲線Figure 1 The growth curve of Phɑeodɑctylum tricornutum under different nitrogen culture conditions

由圖1可知，本試驗(yàn)三角褐指藻在各種氮濃度和形態(tài)的培養(yǎng)條件下，均能正常生長(zhǎng)，且均在第10 d左右進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，但不同濃度下，藻類到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)的生物量有所差別。3種氮濃度條件下能達(dá)到的最大藻密度分別為 40 μmol·L-1培養(yǎng)時(shí)為 1.59×106cells·mL-1，60 μmol·L-1培養(yǎng)時(shí)為1.82×106cells·mL-1，500 μmol·L-1培養(yǎng)時(shí)為4.72×106cells·mL-1。統(tǒng)計(jì)分析表明，相同濃度不同形態(tài)氮培養(yǎng)條件下，三角褐指藻的生長(zhǎng)均沒有顯著差異（P＞0.05），同形態(tài)不同濃度下，三角褐指藻生長(zhǎng)存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 三角褐指藻在不同培養(yǎng)條件下的氮吸收動(dòng)力學(xué)特征

圖2 不同氮源培養(yǎng)條件下三角褐指藻培養(yǎng)基中氮濃度變化趨勢(shì)Figure 2 Changes of the nitrogen concentration in medium for Phɑeodɑctylum tricornutum under different nitrogen culture conditions

由圖2中A、C、D、F、G、I 6圖可以看出，在不同氮濃度培養(yǎng)條件下添加-N的I、III處理組中，-N均能被迅速地吸收利用。而N的情況則不同，在圖2的B、E、H 3圖中，不存在-N的情況下，-N能被迅速的吸收利用，甚至在低濃度氮源條件下（40 μmol·L-1和 60 μmol·L-1）-N作為唯一氮源時(shí)其消耗比-N作為唯一氮源時(shí)更加快速。但當(dāng)兩種氮源同時(shí)存在時(shí)，-N的吸收在前期均出現(xiàn)了不同程度的延遲現(xiàn)象，且延遲時(shí)間隨培養(yǎng)環(huán)境中-N濃度的增加而增加，說明-N的吸收受到了-N的影響，這一階段-N是藻類吸收的主要氮源形式。

2.3 模型參數(shù)優(yōu)化及擬合結(jié)果

通過40 μmol·L-1試驗(yàn)組數(shù)據(jù)優(yōu)化得到的模型參數(shù)如表2所示。在此濃度下，擬合I～I(xiàn)II各組中藻細(xì)胞內(nèi)氮濃度和培養(yǎng)基中氮濃度的試驗(yàn)觀測(cè)值和模型預(yù)測(cè)值的決定系數(shù)R2分別為0.953（圖 3A）、0.985（圖3B）；0.911（圖4A）、0.982（圖4B）；0.924（圖5A）、0.986（圖5B）、0.981（圖5C）。

2.4 不同培養(yǎng)條件下藻體內(nèi)氮濃度及培養(yǎng)基氮濃度的預(yù)測(cè)

進(jìn)一步用優(yōu)化后的模型對(duì)60 μmol·L-1及500 μmol·L-1試驗(yàn)組所得趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3～圖5所示。模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)觀測(cè)值均十分吻合，決定系數(shù)R2全部介于0.780～0.986之間，說明該模型能很好地預(yù)測(cè)三角褐指藻在各濃度、各形態(tài)氮源下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和氮吸收動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)。

表2 模型參數(shù)匯總Table 2 Summary table of model parameters

圖3 三角褐指藻在-N不同濃度培養(yǎng)條件下藻體內(nèi)總氮含量和培養(yǎng)基中氮濃度變化趨勢(shì)模型擬合結(jié)果Figure 3 Model fitting results for total intracellular nitrogen content and changes of nitrogen concentration in medium under different concentration of NH+4-N

圖4 三角褐指藻在-N不同濃度培養(yǎng)條件下藻體內(nèi)總氮含量和培養(yǎng)基中氮濃度變化趨勢(shì)模型擬合結(jié)果Figure 4 Model fitting results for total intracellular nitrogen content and changes of nitrogen concentration in medium under different concentration ofN

3 討論

氮是浮游植物細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和葉綠素等的基本元素之一，在浮游植物的生命活動(dòng)中占有非常重要的地位。自然界中除少數(shù)藍(lán)藻具有自身固氮能力外，藻類必須從環(huán)境中吸收一定的氮源以滿足其生長(zhǎng)、繁殖的需要，同時(shí)不同種類的微藻對(duì)氮源的種類和濃度需求也不一樣[25]。從本試驗(yàn)中藻類生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果可以看出，氮濃度的改變對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)影響顯著，同形態(tài)不同濃度的氮培養(yǎng)條件下，藻類生物量均存在顯著差異（P＜0.05），證明了氮素營養(yǎng)是三角褐指藻生長(zhǎng)的一種非常重要的限制因子。與此同時(shí)，同濃度不同形態(tài)氮培養(yǎng)條件下，三角褐指藻的生長(zhǎng)卻沒有出現(xiàn)明顯差異（P＞0.05）。一般認(rèn)為微藻最容易利用-N，但是隨著-N被利用，培養(yǎng)液的pH逐漸下降，以至于抑制微藻的生長(zhǎng)，因而高濃度的N反而會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)[26]。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，500 μmol·L-1-N試驗(yàn)組中藻類的生長(zhǎng)與其他同濃度試驗(yàn)組沒有明顯差異，說明該濃度的-N并沒有對(duì)三角褐指藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)，這也證明一定濃度范圍內(nèi)，三角褐指藻均能很好地利用-N和-N兩種無機(jī)氮源，這與Yongmanitchai等[27]的研究結(jié)果是一致的。

另外，對(duì)藻類氮吸收動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，在3種不同氮濃度的培養(yǎng)條件下，單一添加-N或-N時(shí)，氮營養(yǎng)均能被藻類快速吸收，而兩種無機(jī)氮源同時(shí)存在時(shí)，則出現(xiàn)了明顯的-N吸收延遲現(xiàn)象。對(duì)于這樣的特征，目前有幾種可能的解釋：首先，藻類可能會(huì)根據(jù)所處環(huán)境中氮源的多少及形態(tài)對(duì)吸收氮源的策略進(jìn)行自我調(diào)整，對(duì)三角褐指藻而言，已有研究證明其對(duì)各種氮源均具有廣泛的利用性[27-28]，因此當(dāng)環(huán)境中存在-N或-N為唯一氮源時(shí)，其均能很好地吸收利用。而當(dāng)環(huán)境中同時(shí)存在-N和-N時(shí)，藻類則會(huì)改變吸收策略。由于吸收-N不需要轉(zhuǎn)換氮的價(jià)態(tài)并消耗相應(yīng)的能量，因此，藻類很可能優(yōu)先利用-N[29]。這一特征也在大量的室內(nèi)藻類培養(yǎng)及實(shí)際水體研究中得到了較充分的證實(shí)[7]。同時(shí)，除藻類對(duì)其偏好性吸收外，-N的存在也可能抑制硝酸鹽還原酶、轉(zhuǎn)運(yùn)酶等的活性，損害藻類吸收-N的能力[30-31]。另外，值得注意的是，由于不同種類的微藻對(duì)氮的種類和濃度需求不同，它們對(duì)于-N和-N的利用以及不同環(huán)境下氮吸收策略的差異在自然環(huán)境中具有重要意義。在河口及近岸海域，由于陸源輸入的影響，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)脈沖式營養(yǎng)鹽輸入，那些能更加快速適應(yīng)氮環(huán)境變化的藻類，很可能迅速成為優(yōu)勢(shì)種，進(jìn)而改變浮游植物的群落結(jié)構(gòu)，甚至進(jìn)一步引發(fā)藻華[11]。

圖5 三角褐指藻在混合氮源不同濃度培養(yǎng)條件下藻體內(nèi)總氮含量和培養(yǎng)基中氮濃度變化趨勢(shì)模型擬合結(jié)果Figure 5 Model fitting results for total intracellular nitrogen content and changes of nitrogen concentration in medium under different concentration of mixed nitrogen（-N and -N）

本文通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型模擬了三角褐指藻在不同氮源培養(yǎng)條件下的氮吸收動(dòng)力學(xué)特征。值得注意的是，模型中參數(shù)的取值大小很大程度上影響著計(jì)算結(jié)果，因此選取合適的參數(shù)值，對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。但在實(shí)際環(huán)境評(píng)價(jià)工作中，有些參數(shù)往往難以測(cè)定，同時(shí)由于有針對(duì)性的現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)和模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匱乏，致使無法向模型提供理想的參數(shù)，進(jìn)而降低了模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此在借鑒相關(guān)經(jīng)驗(yàn)值的基礎(chǔ)上對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的。自20世紀(jì)60年代開始，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的普及和迅速發(fā)展，參數(shù)自動(dòng)估計(jì)方法得到了普遍應(yīng)用，大幅加快了參數(shù)優(yōu)選的速度，增加了模擬結(jié)果的客觀性和可信度[32]。并且隨著參數(shù)自動(dòng)估計(jì)方法的發(fā)展，優(yōu)選算法也變得多種多樣[33]。單純形法，又稱之為下山單純形法，是一種經(jīng)典的直接搜索最優(yōu)解算法，由Nelder和Mead提出[34]。該方法由一組解構(gòu)成初始單純形，在每次迭代中，逐步剔除最差解，并尋求更好的解。該方法實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、性能良好、精度高，適合計(jì)算變量數(shù)不多的方程求極值。目前在不同研究領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用[35-37]，本文運(yùn)用單純形法對(duì)營養(yǎng)鹽吸收動(dòng)力學(xué)模型中的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化求解。通過優(yōu)化所得到的參數(shù)符合藻類生長(zhǎng)和營養(yǎng)鹽吸收動(dòng)力學(xué)相關(guān)性研究的常規(guī)經(jīng)驗(yàn)值，同時(shí)通過在兩種具有明顯差異的氮濃度培養(yǎng)條件下（60 μmol·L-1和500 μmol·L-1）對(duì)模型預(yù)測(cè)能力驗(yàn)證，其均可以較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，說明我們通過單純形法所優(yōu)化的模型參數(shù)基本符合本研究中微藻的真實(shí)生理特征。

4 結(jié)論

（1）三角褐指藻在各種氮濃度和形態(tài)的培養(yǎng)條件下，均能正常生長(zhǎng)。同濃度不同形態(tài)氮培養(yǎng)條件下，三角褐指藻的生長(zhǎng)均沒有顯著差異（P＞0.05），同形態(tài)不同濃度下，三角褐指藻生長(zhǎng)差異顯著（P＜0.05）。

（3）通過構(gòu)建營養(yǎng)鹽吸收動(dòng)力學(xué)模型模擬了三角褐指藻在不同氮源培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和氮吸收動(dòng)力學(xué)特征。模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)觀測(cè)值均十分吻合，決定系數(shù)R2全部介于0.780到0.986之間，該模型很好地預(yù)測(cè)了三角褐指藻在各濃度、各形態(tài)氮源下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和氮吸收動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)。