許曉玲

【摘要】 目的：檢驗二甲雙胍應用是否影響T2DM患者外周血白細胞NF-κB和IL-1β的表達。方法：本研究募集汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，根據(jù)使用二甲雙胍與否分為對照組（未用二甲雙胍）和二甲雙胍組（口服二甲雙胍，500～2 000 mg/d）。收集所有患者的外周血標本以檢測外周血白細胞（PBLs）數(shù)量、生化參數(shù)和C肽。并從PBLs中分離取得總mRNA。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）用于檢測PBLs中NF-κB和IL-1β的表達。結(jié)果：二甲雙胍組空腹血糖、糖基化血紅蛋白、低密度脂蛋白膽固醇均明顯低于對照組，2小時C肽高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而兩組總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和PBLs比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。相比對照組，二甲雙胍組FBG、HbA1c和LDL-C水平較低，而2 h C肽較高（P<0.05）。二甲雙胍組NF-κB和IL-1βmRNA表達水平顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)果顯示二甲雙胍不止改善血糖、血脂及胰島素β細胞分泌功能，還通過抑制NF-κB/IL-1β信號通路而在T2DM患者中發(fā)揮抗炎作用，這為二甲雙胍在T2DM的抗炎益處提供了證據(jù)。

【關鍵詞】 2型糖尿病； NF-κB； IL-1β； 二甲雙胍

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.16.009 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）16-00-04

The Discussion about the Effect of Metformin on the Expression of NF-κB and IL-1β in Peripheral Blood Leukocytes from Patients with Type 2 Diabetes/XU Xiaoling.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（16）：-23

【Abstract】 Objective：To test whether metformin application affected peripheral blood leukocyte NF- B and il-1 in T2DM patients.Method：In this study，117 cases of T2DM patients in the department of endocrinology of the First Affiliated Hospital of Shantou University were collected from November 2015 to October 2016.According to the use of metformin，they were divided into the control group （without Metformin） and Metformin group （oral Metformin，500～2 000 mg/d）.

Peripheral blood samples were collected from all the patients for testing PBL counts，biochemicalparametersand C peptide.Total RNA was isolated from PBLs.RT-PCR was used to examine the expression of NF-κB and IL-1β in PBLs.Result：The fasting blood glucose，glycosylated hemoglobin and LDL cholesterol in metformin group were significantly lower than those in the control group，2 h C-peptide level was higher than that in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.The expression of NF- κ B and IL-1 β mRNA in metformin group was significantly lower than that in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The results showed that metformin not only improved blood glucose，blood lipid and insulin β cell secretion，but also played an anti-inflammatory role in T2DM patients by inhibiting NF- κ B/IL-1 β signaling pathway，which provided evidence for the anti-inflammatory benefits of metformin in T2DM.

【Key words】 Type 2 diabetes； NF-κB； IL-1β； Metformin

First-authors address：Shantou Chaonan Minsheng Hospital，Shantou 515144，China

研究顯示T2DM是一種自身炎癥性疾病[1]。NF-κB/IL-1β炎癥信號通路在T2DM中發(fā)揮重要作用[2]，可能成為T2DM抗感染治療的潛在靶點，然而以炎癥作為靶點的治療還未應用于臨床。有趣的是，現(xiàn)今用于降糖的藥物，一些具有抗炎活性，這可能有助于改善臨床結(jié)局。二甲雙胍是臨床治療T2DM的一線、基礎藥物，不止改善高血糖癥和胰島素抵抗，也具有抗炎、抗腫瘤和抗老化作用，并改善其他的心血管風險因素，如超重狀態(tài)或肥胖、致動脈粥樣硬化血脂異常、高血壓、促凝狀態(tài)和頸動脈內(nèi)膜厚度[3]。研究顯示二甲雙胍治療IGT患者能減少單核細胞和淋巴細胞各種促炎因子的釋放[4]。二甲雙胍應用是否影響T2DM患者細胞NF-κB和IL-1β的表達，這需要進一步印證。因此，筆者將T2DM患者分為二甲雙胍組及對照組，觀察二甲雙胍應用對T2DM患者外周血白血病NF-κB/IL-1β信號表達的作用，并闡述其潛在的抗炎作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究募集汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科2015年11月-2016年10月收住的T2DM患者117例，診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標準，排除糖尿病急性并發(fā)癥和其他嚴重的系統(tǒng)性疾病。根據(jù)使用二甲雙胍與否，分為對照組（未用二甲雙胍）及二甲雙胍組（二甲雙胍500～2 000 mg/d）。對照組54例，男28例，女26例，年齡22～71歲，平均（53.22±10.70歲）；二甲雙胍組63例，男27例，女36例，年齡42～80歲，平均（61.08±7.78歲）。兩組患者一般性資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本臨床研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 PBLs分離 取新鮮外周抗凝血3～15 ml離心管中，400～500 g離心5 min，棄上清。加入6～10倍細胞體積的紅細胞裂解液（KHCO3 1.0 g，NH4C 18.3 g，EDTA-Na 0.037 g，加水至1 000 ml），輕輕吹打混勻，裂解4～5 min。400～500 g離心5 min，棄紅色上清。重復裂解一次。加入適量PBS（至少為細胞沉淀體積的5倍）洗滌1～2次，重懸沉淀，400～500 g離心2～3 min，棄上清。得到白細胞沉淀，用于提取總mRNA。

1.2.2 PBLs內(nèi)總mRNA的提取 根據(jù)TaKaRa Total RNA提取試劑盒的要求和配置，提取白細胞總RNA，用于RT-PCR實驗。

1.2.3 RT-PCR檢測PBLs中NF-κB和IL-1βmRNA表達水平 用所提取的白細胞總RNA合成cDNA一鏈（EasyScript First-Stand cDNA Synthesis SuperMix Kit Promega Biotech），進行PCR擴增（2*Taq PCR MasterMix kit TIANGEN Biotech）。PCR循環(huán)：94 ℃，3 min；循環(huán)28次（94℃，30 s；59 ℃，30 s；72 ℃，1 min）；最后72 ℃，10 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity-one軟件分析計算條帶灰度值，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

1.3 觀察指標

比較兩組空腹血糖（FBG）、糖基化血紅蛋白（HbA1c）、2 h

C肽（2 h C-P）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）、外周血白細胞（PBLs），以及兩組NF-κB/GAPDH和IL-1β/GAPDH表達水平等。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩組非獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料檢查結(jié)果比較

二甲雙胍組空腹血糖、糖基化血紅蛋白、低密度脂蛋白-膽固醇均明顯低于對照組，2 h C肽高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而兩組總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白-膽固醇和PBLs比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.2 兩組NF-κB/GAPDH和IL-1β/GAPDH表達水平比較

二甲雙胍組NF-κB和IL-1βmRNA表達水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3、圖1。

3 討論

研究證明，炎癥在T2DM的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用[5]。橫斷面和前瞻性的研究顯示在肥胖和T2DM中具有高水平的急性時相標志物（包括C-反應蛋白、血清淀粉樣-A和唾液酸）、白細胞、血漿凝固因子（纖維蛋白和纖溶酶原活化劑抑制劑-1）、促炎因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和趨化因子[6]。在胰腺胰島，局部炎癥能減少胰島素釋放和觸發(fā)β-細胞凋亡，導致胰島質(zhì)量下降，而這在T2DM病情進展中發(fā)揮關鍵作用[7]。因此，炎癥在T2DM的病理機制中發(fā)揮重要作用。

NF-κB在調(diào)節(jié)炎癥中發(fā)揮重要作用。在靜息狀態(tài)，NF-κB通過結(jié)合于細胞中kappa輕鏈多肽基因增強子抑制劑a（IkBa）而定位于胞漿。當細胞受到炎癥等刺激時，kappa輕鏈多肽基因增強子抑制劑激酶b（IKKb）激活，磷酸化IkBa蛋白并使其降解，NF-κB得以被釋放并進入細胞核，通過結(jié)合特定的基因啟動子和增強子kB序列而轉(zhuǎn)錄激活一系列的炎癥基因[8]。研究顯示T2DM患者肌肉細胞IκBa含量降低，這提示增強的NF-κB信號[9]。NF-κB激活后，可增強TNF-a和IL-1β等的基因轉(zhuǎn)錄，促使其產(chǎn)生和釋放增加，后者又導致NF-κB的進一步激活，構(gòu)成一個正反饋回路，造成不斷惡化的促炎癥反應環(huán)境。

IL-1β是研究的最多的IL-1家族成員，因為其在介導自身炎癥性疾病中的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸包括油酸、棕櫚酸和硬脂酸等可以刺激胰島Beta細胞產(chǎn)生IL-1[11]。而且IL-1可以刺激自身的表達，構(gòu)成一個嚴重的惡性循環(huán)[12]。

綜上所述，NF-κB/IL-1炎癥信號通路在T2DM中發(fā)揮重要作用，使其可能成為潛在的治療靶點以對抗T2DM疾病炎癥誘導的損傷。

二甲雙胍是治療2型糖尿病的基礎、一線、全程藥物，主要通過抑制肝臟糖異生而改善高血糖癥，同時提高肝臟和外周組織的胰島素敏感性[13]。前期研究顯示，除了在糖代謝中的作用，二甲雙胍也調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和發(fā)揮抗炎作用。血管內(nèi)皮細胞實驗顯示二甲雙胍通過活化AMPK而抑制NF-κB活性，從而減輕細胞因子誘導的促炎因子和粘附分子基因的表達[14]。另外，在動脈粥樣硬化斑塊分離出的人類血管平滑肌細胞、巨噬細胞和上皮細胞中，二甲雙胍通過抑制NFκB 活性而抑制IL-1β誘導的IL-6和IL-8的釋放[15]。在實驗性動脈粥樣硬化家兔的大動脈血管壁細胞中，二甲雙胍抑制IκB磷酸化和NF-κB活化，提示其潛在的抗炎特性。

在本研究中，二甲雙胍顯著降低T2DM患者的FBG和LDL，提高2 h C肽水平，并抑制PBLs中NF-κB和IL-1β的mRNA表達水平，這與前期細胞和動物實驗中的研究結(jié)果是相符合的。研究提示二甲雙胍不止改善血糖、血脂及胰島素β細胞分泌功能，還通過抑制NF-κB/IL-1β信號通路而在T2DM患者中發(fā)揮抗炎作用，這為二甲雙胍在T2DM的抗炎益處提供了證據(jù)。

參考文獻

[1] Lontchi-Yimagou E，Sobngwi E，Matsha T E，et al.Diabetes mellitus and inflammation[J].Current diabetes reports，2013，13（3）：435-444.

[2] Kim J E，Lee M H，Nam D H，et al.Celastrol，an NF-kappaB inhibitor， improves insulin resistance and attenuates renal injury in db/db mice[J].Plos One，2013，8（4）：e62068.

[3] Saisho Y.Metformin and inflammation：its potential beyond glucoselowering effect[J].EndocrMetab Immune Disord Drug Targets，2015，15（3）：196-205.

[4] Krysiak R，Okopien B.The effect of metformin on monocyte secretory function in simvastatin-treated patients with impaired fasting glucose[J].Metab Clin Exp，2013，62（1）：39-43.

[5] Wellen K E，Hotamisligil G S.Inflammation，stress，and diabetes[J].J Clin Invest，2005，115（5）：1111-1119.

[6] King G L.The role of inflammatory cytokines in diabetes and its complications.J Periodontol. 2008；79 （8 Suppl）：1527-1534.

[7] Cernea S，Dobreanu M.Diabetes and beta cell function：from mechanisms to evaluation and clinical implications[J].Biochem Med （Zagreb），2013，23（3）：266-280.

[8] Lee B C，Lee J.Cellular and molecular players in adipose tissue inflammation in the development of obesity-induced insulin resistance[J].Biochim Biophys Acta，2014，1842（3）：446-462.

[9] Sriwijitkamol A，Christ-Roberts C，Berria R，et al.Reduced skeletal muscle inhibitor of kappaB beta content is associated with insulin resistance in subjects with type 2 diabetes：reversal by exercise training[J].Diabetes，2006，55（3）：760-767.

[10] Boni-Schnetzler M，Boller S，Debray S，et al.Free fatty acids induce a pro-inflammatory response in islets via the abundantly expressed interleukin-1 receptor I[J].Endocrinology，2009，150（12）：5218-5229.

[11] Larsen C M，F(xiàn)aulenbach M，Vaag A，et al.Interleukin-1-receptor antagonist in type 2 diabetes mellitus[J].The New England Journal of Medicine，2007，356（15）：1517-1526.

[12] Isoda K，Young J L，Zirlik A，et al.Metformin inhibits proinflammatory responses and nuclear factor-kappaB in human vascular wall cells[J].Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology，2006，26（3）：611-617.

[13] Huang N L，Chiang S H，Hsueh C H，et al.Metformin inhibits TNF-alpha-induced IkappaB kinase phosphorylation，IkappaB-alpha degradation and IL-6 production in endothelial cells through PI3K-dependent AMPK phosphorylation[J].International Journal of Cardiology，2009，134（2）：169-175.

[14] Tan X L，Bhattacharyya K K，Dutta S K，et al.Metformin suppresses pancreatic tumor growth with inhibition of NFκB/STAT3 inflammatory signaling[J].Pancreas，2015，44（4）：636-647.

[15] Li S N，Wang X，Zeng Q T，et al.Metformin inhibits nuclear factor kappaB activation and decreases serum high-sensitivity C-reactive protein level in experimental atherogenesis of rabbits[J].Heart and Vessels，2009，24（6）：446-453.

（收稿日期：2017-11-28）