楊海偉， 王宗乾， 徐晶晶， 王明榮， 王鄧峰

安徽工程大學 紡織服裝學院， 安徽 蕪湖 241000)

蠶絲絲素蛋白含有18種α-氨基酸，其中酪氨酸成分的質量分數(shù)高達10.84%[1]，且酪氨酸殘基主要分布在絲素蛋白的無定形區(qū)和結構表面，易受化學試劑的進攻和作用[2-3]，具有較高的反應可及度，是絲素蛋白化學修飾的重要位點。目前，對絲素蛋白的化學修飾主要為對氨基、酚羥基結構的?；揎棧瑢Π被?、羧基結構的烷基化修飾，對酚羥基的氧化修飾，以及對殘基中芳香環(huán)的取代反應修飾[4-5]。其中，酪氨酸殘基結構中，因酚羥基的電子誘導效應，苯環(huán)酚羥基鄰位碳極易發(fā)生芳環(huán)取代反應，該芳環(huán)取代修飾是絲素蛋白典型的特征修飾反應，極少受到其他反應位點的影響[6]。若采用芳胺重氮鹽對絲素蛋白進行化學修飾將生成偶氮化合物，該修飾反應也被稱為偶合修飾反應，且該修飾反應主要針對酪氨酸殘基[7]。酪氨酸殘基的化學修飾現(xiàn)已被廣泛應用于蛋白質的標記與定量分析領域，如Cserep G. B.等[8]、Jakubowski等[9]等為標記和定量分析蛋白質樣品，分別采用Pd(II)、碘分子對不同蛋白質中的酪氨酸殘基進行化學修飾，并基于光譜特征實現(xiàn)了蛋白質的標記與分析；Pereira Navaza A等[10]通過IPy2BF4(二吡啶四氟硼化碘)試劑修飾酪氨酸殘基，實現(xiàn)了對蛋白質樣品的標記，并基于高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)檢測技術完成了對修飾蛋白質的定量分析。此外，Neel S. Joshi等基于了三組分曼尼希反應、重氮偶合反應機制對含酪氨酸殘基的小分子蛋白質及多肽進行了化學修飾和標記[11-12]。Chen W等[13]將酪氨酸殘基的偶合修飾應用在蠶絲纖維的染色領域，采用不同結構的芳胺化合物重氮鹽實現(xiàn)對蠶絲酪氨酸殘基的偶合修飾染色，修飾后蠶絲具有較高的耐洗和耐摩擦色牢度，豐富了蠶絲纖維的染色技術；同樣基于酪氨酸殘基偶合修飾反應性能，將紫外線吸收結構修飾到了蠶絲的酪氨酸殘基上，提高了蠶絲的耐光穩(wěn)定性能[14]。

綜上所述，絲素蛋白酪氨酸殘基的偶合化學修飾條件較為溫和，反應速率快，重氮組分與絲素蛋白之間形成共價修飾，具有較高的濕處理牢度，在蛋白的染色與功能化改性方面具有廣闊的應用前景。目前較少關于蠶絲絲素酪氨酸殘基參與偶合修飾的工藝因素與調控規(guī)律的研究報道，也缺少關于該修飾反應吸附速率曲線與吸附等溫線的相關報道。為此，本文以偶合修飾后蠶絲絲素的顏色深度K/S值為衡量指標，分析了堿預處理、重氮鹽組分的用量、時間、pH值、浴比等工藝參數(shù)對鄰硝基苯胺重氮鹽修飾酪氨酸殘基的影響規(guī)律，同時研究了重氮鹽對酪氨酸殘基偶合修飾的吸附速率曲線、吸附等溫線類型等內容，以期為絲素蛋白的化學修飾及其性能調控提供實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與化學藥劑

蠶絲織物(78 g/m2，淄博大染坊絲綢公司提供)。實驗前，該蠶絲織物經(jīng)質量分數(shù)為0.5%的Na2CO3溶液煮沸脫膠2次，每次各30 min，脫膠浴比為1∶50，脫膠后蠶絲視為蠶絲絲素纖維。

藥品：鄰硝基苯胺、亞硝酸鈉、無水碳酸鈉、36%濃鹽酸、尿素、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉(上海阿拉丁試劑有限公司)，均為分析純。

1.2 主要實驗儀器

Rapid L-12 A-1型水浴恒溫振蕩器(廈門瑞比精密機械有限公司)；HJ-5型多功能攪拌器(金壇市杰瑞爾有限公司)；UV2600型紫外-可見分光光度計(上海天美公司)；Datacolor650型測色配色儀(美國Datacolor公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90型粒度及電位分析儀(英國馬爾文公司)。

1.3 蠶絲絲素纖維織物的堿預處理

為對比測試堿預處理對蠶絲絲素蛋白偶合修飾的影響，偶合修飾實驗前1 h內，采用浸軋工藝對蠶絲絲素纖維進行堿預處理。具體工藝為：室溫下織物先經(jīng)10 g/L的Na2CO3溶液浸漬30 min，浴比為1∶100，之后進行浸軋，控制織物帶液率為100%。

1.4 蠶絲絲素的偶合修飾

參照文獻[15]制備鄰硝基苯胺重氮鹽，并配制不同pH值的緩沖溶液；然后在相同工藝條件下，分別對堿預處理與未處理的蠶絲絲素纖維進行偶合修飾，分析了堿預處理、重氮鹽組分用量、pH值、時間等工藝參數(shù)對偶合修飾蠶絲絲素纖維K/S值的影響規(guī)律。

1.5 鄰硝基苯胺重氮鹽標準曲線的建立

為測試蠶絲絲素蛋白偶合修飾的吸附速率曲線與吸附等溫線，首先建立了鄰硝基苯胺重氮鹽的標準曲線，如圖1所示。標準曲線的回歸方程式為Y=7.331 33X+0.008 93，線性相關系數(shù)R2為0.993 66，鄰硝基苯胺重氯鹽濃度范圍為0.03～0.18 mmol/L。式中：Y為波長278 nm下的光度值；X為鄰硝基苯胺重氮鹽的濃度，mmol/L。

1.6 測試方法

1.6.1修飾蠶絲絲素纖維的K/S值測試

采用測色配色儀測試修飾蠶絲絲素纖維的K/S值。測試條件：待測樣品2次對折，D65光源，2°角，采樣孔徑為5 mm，波段為350～700 nm，每塊樣品取5點處測試，取其平均值。

1.6.2蠶絲絲素纖維Zeta電位值測試

采用機械方法將蠶絲絲素纖維磨成粉末，然后分別稱取一定質量的纖維粉末，浸漬于不同pH值的水溶液中，磁力攪拌10 min，采用粒度及電位分析儀測試不同粉末樣品的Zeta電位值。

1.6.3偶合修飾的吸附過程測定

采用殘液吸光度法，測試不同反應時間后偶合修飾體系中鄰硝基苯胺重氮鹽在278 nm條件下的吸光度值，依據(jù)鄰硝基苯胺重氮鹽的標準曲線求不同時刻的濃度，并按照下式計算不同時刻鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附量，繪制偶合修飾的吸附量-時間曲線[16]。

式中：Qt為t時刻鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附量，mmol/g；c0為鄰硝基苯重氮鹽的初始濃度，mmol/L；ct為t時刻鄰硝基苯重氮鹽的濃度，mmol/L；V為反應溶液的體積,L；m為蠶絲絲素纖維的質量,g。

1.6.4吸附等溫線的繪制

配制不同濃度的重氮鹽反應液，然后將質量為1.00 g的蠶絲絲素纖維分別投入到上述各反應液中，控制偶合反應液pH值為6.8，反應浴比為1∶500，于5 ℃條件下進行偶合反應，待吸附平衡后，測定殘液的吸光度值。根據(jù)標準曲線計算平衡時殘液中的重氮鹽組分質量濃度Ds，按下式計算平衡時各纖維上的重氮鹽組分吸附量Df[17]。以Df對Ds作圖繪制吸附等溫線。

式中：C0為反應液的起始質量濃度，mg/L；Ceq為吸附平衡時反應液的質量濃度mg/L。

2 結果與討論

2.1 修飾蠶絲絲素K/S值的影響因素

2.1.1堿預處理對K/S值的影響

測試了堿預處理和未處理的蠶絲絲素纖維在偶合修飾后的K/S值，結果如圖2所示。

圖2 蠶絲絲素纖維的K/S值曲線Fig.2 K/S value curves of silk fibroin fiber

由圖可知，堿預處理工藝對蠶絲絲素纖維偶合修飾有較大的影響，在相同的偶合修飾工藝下，堿預處理蠶絲絲素纖維呈黃色，在350～500 nm波段具有較高的K/S值，且得色較深。修飾后蠶絲絲素蛋白分子與鄰硝基苯胺重氮鹽分子結構形成大共軛結構[13]，在可見光區(qū)產生特征吸收，吸收強度與參與反應的酪氨酸殘基數(shù)量成正比，即蠶絲絲素蛋白中越多的酪氨酸殘基參與修飾反應，則修飾后蠶絲絲素纖維得色越深，說明蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基偶合修飾反應率越高。

綜上，蠶絲絲素纖維經(jīng)堿預處理后，酪氨酸殘基參與偶合修飾的反應率增加。堿預處理后，蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基結構的酚羥基會發(fā)生電離形成苯氧基負離子，使其電子云密度增加，從而促進了偶合修飾反應的發(fā)生[4]，推測堿預處理對蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基電子云密度與偶合修飾反應的影響機制如圖3所示。

注：代表蠶絲絲素蛋白大分子。

為對比堿預處理后蠶絲絲素纖維Zeta電位值的變化，同時測試了不同酸堿環(huán)境下蠶絲絲素纖維的Zeta電位值，結果如圖4所示。

圖4 不同pH值條件下蠶絲絲素纖維Zeta電位值Fig.4 Zeta potential values of silk fibroin fiber at different pH values

由圖可知：蠶絲絲素纖維在強酸環(huán)境下帶正電荷，此時絲素蛋白發(fā)生堿式電離，且纖維的Zeta電位值隨pH值的升高而逐漸減?。恍Q絲絲素纖維的等電點處于pH值為4～4.1之間，等電點后，再隨pH值的升高，蠶絲絲素蛋白發(fā)生了酸式電離，且隨pH值的升高，絲素纖維的Zeta電位值的絕對值逐漸升高，表明纖維表面的負電荷效應更加顯著：因此，經(jīng)堿預處理后，蠶絲絲素纖維表面帶有較多負電荷，而未經(jīng)堿預處理的蠶絲絲素纖維在偶合體系(pH值為6.8)下，纖維表面的負電荷量相對較少，且絲素蛋白或處于尚未電離狀態(tài)，負電荷效應較低，對比之下，堿預處理后的蠶絲絲素纖維與重氮鹽正離子之間發(fā)生偶合修飾反應的速率和效率將更高。

綜上所述，蠶絲絲素纖維的堿預處理一方面增加了酪氨酸殘基結構中酚羥基鄰位碳的電子云密度，另一方面降低蠶絲絲素纖維的Zeta電位值，促使纖維帶有更多的負電荷，二者將有利于絲素蛋白酪氨酸殘基與重氮鹽發(fā)生偶合修飾反應。

2.1.2重氮鹽組分用量對K/S值的影響

依據(jù)鄰硝基苯胺重氮鹽與蠶絲絲素蛋白中酪氨酸成分的量比值，設定了8個反應梯度：1/6、1/4、1/2、2/3、1、1.5、2.3，并在5 ℃條件下反應30 min，浴比為1∶100，pH值為6。測試了在不同重氮鹽組分用量條件下偶合蠶絲絲素纖維的K/S值，結果如圖5所示。

圖5 重氮鹽用量對蠶絲絲素纖維K/S值的影響Fig.5 Effect of dosage of diazonium salt on K/S value of silk fibroin fiber

由圖5可知，隨著重氮組分用量的增加，修飾后蠶絲絲素纖維的K/S值逐漸升高，當n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3時，修飾纖維的K/S值趨于穩(wěn)定，再持續(xù)增加重氮組分用量，K/S值幾乎沒有提高，表明該用量下，蠶絲絲素蛋白中酪氨酸殘基的偶合修飾反應已達到平衡。當n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3時，絲素蛋白中酪氨酸殘基參與的偶合修飾反應已達到平衡，原因與絲素蛋白的結構直接相關，絲素蛋白由結晶區(qū)和無定形區(qū)組成，酪氨酸成分在蛋白結晶區(qū)也有分布[6]，但僅絲素蛋白無定形區(qū)中的酪氨酸殘基才有可能參與到與重氮鹽的偶合修飾反應中，且酪氨酸殘基參與修飾反應還可能與蛋白微結構及反應位阻有關[6]，具體影響仍有待進一步研究證明。

因酪氨酸殘基與重氮鹽之間的偶合修飾生成的是共價鍵連接，二者反應與物質的量比相關，在n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3的基礎上，再繼續(xù)增加重氮鹽用量已無必要，同時增加重氮鹽用量不利于調節(jié)反應浴的pH值；重氮鹽組分過量也將加重后續(xù)污水的處理難度。

2.1.3偶合反應的pH值對K/S值的影響

偶合修飾pH值對修飾蠶絲絲素纖維K/S值的影響規(guī)律如圖6所示。

圖6 偶合pH值對蠶絲絲素纖維K/S值的影響Fig.6 Effect of pH values of coupling reaction on K/S value of silk fibroin fiber

由圖6可知：當偶合反應的pH值在蠶絲絲素纖維等電點以下時其K/S值較低；當pH值在3～6.8之間時，隨著偶合pH值升高，蠶絲絲素纖維的K/S值也隨之增大。這是因為鄰硝基苯胺重氮鹽在強酸性條件下，反應活性較低，隨著pH值升高，其反應活性逐漸提升，因此重氮鹽與蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基發(fā)生偶合修飾反應的活性增強，同時有利于促進更多的酪氨酸殘基參與偶合修飾反應，但是當pH值超過6.8，繼續(xù)增大偶合反應的pH值時，蠶絲絲素纖維的K/S值不再增大反而降低，這是因為鄰硝基苯胺重氮鹽在較高的pH值條件下，重氮鹽結構將由順式逐漸向失去反應活性的反式結構轉變[18]，削弱了重氮鹽的偶合反應能力，造成偶合修飾蠶絲絲素纖維的K/S值降低。因此，本文實驗選取偶合pH值為6.8為蠶絲絲素纖維獲取最大K/S值的條件。

2.1.4修飾時間對K/S值的影響

偶合修飾反應時間對修飾蠶絲絲素纖維K/S值的影響規(guī)律如圖7所示。

圖7 偶合時間對蠶絲絲素纖維K/S值的影響Fig.7 Effect of coupling time on K/S value of silk fibroin fiber

由圖可知：當偶合反應時間不超過45 min時，隨著偶合反應時間的延長，蠶絲絲素纖維的K/S值逐漸升高，但增加速率較為緩慢；當偶合時間達到45 min時，蠶絲絲素纖維的K/S值最大，為20.47；隨后再延長偶合時間，蠶絲絲素纖維的K/S值將不再增加反而降低。為確?？煞磻睦野彼釟埢繀⑴c修飾反應，本文實驗選取偶合時間45 min為蠶絲絲素纖維獲取最大K/S值的條件。

2.1.5其他工藝因素對K/S值的影響

偶合修飾自身是溫和的反應體系，前期研究已證明提高偶合修飾溫度將導致重氮鹽分解變質，使其反應活性降低[19]，同時文獻[4,6]表明低溫下偶合反應可進一步提升修飾位點的專一性，減少酪氨酸殘基偶合修飾反應中副反應的發(fā)生。為此，可認為進一步探討提高偶合溫度對蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基偶合修飾的影響已經(jīng)沒有意義，因此，本文蠶絲絲素纖維的偶合修飾在5 ℃條件下進行。

2.2 酪氨酸殘基偶合修飾的吸附過程

依據(jù)1.6.3節(jié)方法，測試了鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上吸附量-時間曲線，結果如圖8所示。

圖8 鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附過程Fig.8 Adsorption process of o-nitroaniline diazonium salt on silk fibroin fiber

由圖可知，重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附時間短，吸附效率高，說明重氮鹽與蠶絲絲素纖維反應用時短，反應速率高；特別在該修飾反應的初期，吸附速率曲線具有較高的斜率。蠶絲絲素纖維的偶合修飾反應具有的高效率是由該修飾反應機制決定的，在偶合修飾條件下，堿預處理可促進絲素蛋白的酸式電離，纖維帶有負電荷，纖維與重氮鹽組分產生庫倫引力，重氮組分與蠶絲絲素纖維具有較強的親和力，蠶絲絲素纖維可在短時間內對重氮鹽組分產生強烈吸附，此時不存在傳統(tǒng)陰離子染料對蠶絲纖維染色過程中出現(xiàn)的雙電子層阻礙纖維對染料離子吸附的問題；吸附到蠶絲絲素纖維表面的重氮組分可與酪氨酸殘基中酚羥基的鄰位發(fā)生親電取代反應，堿預處理將使酚羥基發(fā)生電離形成苯氧基負離子，進一步增加酚羥基鄰位富電子不飽和碳的電子云密度，使偶合修飾反應進一步加速。

由圖8還可看出：在修飾反應初始階段，重氮鹽組分在蠶絲絲素纖維上強烈吸附并快速發(fā)生偶合反應；修飾反應20 min后，繼續(xù)延長反應時間，重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附量增加緩慢，反應時間達到45 min時，反應接近平衡，吸附量增加不再明顯。

2.3 酪氨酸殘基偶合修飾的吸附等溫線

依據(jù)1.6.4節(jié)方法，在0.03～0.18 mmol/L的濃度范圍內，采用6個不同起始濃度的鄰硝基苯胺重氮鹽分別對蠶絲素纖維進行偶合修飾，測試了鄰硝基苯胺重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附等溫線，結果如圖9所示。采用Origin9.0作圖軟件按照Langmuir型、Freundlich型2種吸附類型的公式進行擬合，擬合公式[20 ]分別為y=Qbx/(1+bx)，y=Qxb。其中：Q為重氮鹽在蠶絲絲素纖維上的吸附飽和值；b為吸附平衡常數(shù)，與吸附位點的親和力有關。

注：和分別為Langmuir型、Freundlich型2種擬合曲線的相關系數(shù)。

3 結 論

1) 堿預處理是影響蠶絲絲素蛋白酪氨酸殘基與鄰硝基苯胺重氮鹽發(fā)生偶合修飾反應的重要因素；堿預處理可促使酪氨酸殘基中酚羥基電離，增加酚羥基鄰位碳的電子云密度，同時堿預處理降低了絲素蛋白的Zeta電位值，二者作用均有助于絲素蛋白對鄰硝基苯胺重氮鹽的吸附并與其發(fā)生偶合修飾反應。

2) 經(jīng)單因素優(yōu)化，經(jīng)鄰硝基苯胺重氮鹽偶合修飾的蠶絲絲素纖維在n(重氮鹽)∶n(酪氨酸)=2∶3，pH值為6.8，溫度為5 ℃條件下反應45 min可獲得較高的K/S值；

3) 絲素蛋白酪氨酸殘基與鄰硝基苯胺重氮鹽的偶合修飾反應具有較高的反應速率，該修飾反應耗時短；分別采用Langmuir與Freundlich 模型反應的吸附等溫線進行擬合對比，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白的偶合修飾反應更符合Langmuir 模型。