（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108）

隨著現(xiàn)代化設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步，蜜蜂等傳粉昆蟲為農(nóng)作物授粉增產(chǎn)的作用日益突出。然而，為防止各種農(nóng)作物的病蟲害，人們使用殺蟲劑等農(nóng)藥的種類和劑量正逐年遞增，不可避免地威脅著蜜蜂等有益昆蟲類群的生存安全。

新煙堿類殺蟲劑是世界范圍內(nèi)最有效、銷量最好的殺蟲劑，吡蟲啉則是此類殺蟲劑的典型代表，是第一個(gè)被合成的具有殺蟲活性的新煙堿類化合物[1]。吡蟲啉自引入市場以來發(fā)展迅速，在國內(nèi)被廣泛使用，有研究表明，它對蜜蜂的毒性屬于高毒級(jí)[2]，會(huì)破壞蜜蜂的記憶系統(tǒng)，使采集和學(xué)習(xí)能力下降[3,4]，影響蜜蜂的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)以及尋找和辨別食物的能力[5,6]，影響蜂群幼蟲的孵化率、化蛹率和羽化率[7,8]，對蜂王的生殖力和雄蜂的精子形成存在亞致死效應(yīng)[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）合稱昆蟲的保護(hù)酶系統(tǒng)[10]，這三者既有功能互補(bǔ)性又有定位互補(bǔ)性，共同構(gòu)成昆蟲有機(jī)體相互保護(hù)的防御系統(tǒng)[11]，其功能是清除機(jī)體內(nèi)過剩的活性氧，保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境脅迫的危害[12]。因此，當(dāng)蜜蜂處于受到殺蟲劑脅迫的逆境條件下，其體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)必然會(huì)對機(jī)體氧化應(yīng)激做出一定的反應(yīng)，以適應(yīng)不良環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室條件下的蜜蜂工蜂為研究對象，通過考察低劑量吡蟲啉對蜜蜂生長發(fā)育及各發(fā)育時(shí)期保護(hù)酶系活性的影響，以期揭示蜜蜂保護(hù)酶系統(tǒng)在吡蟲啉脅迫下的變化規(guī)律，為進(jìn)一步探討蜜蜂對新煙堿類殺蟲劑的抗性機(jī)制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

供試蜜蜂為實(shí)驗(yàn)室人工飼育的本地意大利蜜蜂（Apis melliferaL.）。參考劉光楠和曾志將[13]蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)配方，從1日齡幼蟲開始飼喂直至羽化出房，對照組（CK）飼喂基礎(chǔ)飼料，處理組1和處理組2進(jìn)行藥物的直接脅迫處理，分別在基礎(chǔ)飼料中添加LD10（0.01mg/ml）和LD50（0.1mg/ml）劑量殺蟲劑，每日觀察生長發(fā)育情況并記錄幼蟲成活率、化蛹率和羽化率。

1.2 試劑與儀器

總超氧化物氣化酶（T-SOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所；過氧化氫酶(CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；過氧化物酶(POD)試劑盒，南京建成生物工程研究所。Ultrospec 7000紫外可見分光光度計(jì)，英國柏楉有限公司；MGC-H人工氣候箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司。

1.3 樣品的制備

按照蜜蜂的不同發(fā)育時(shí)期采集各組樣品，分別是幼蟲期（5日齡蟲）、蛹期（5日齡蛹）和出房期（羽化出房時(shí)），收集樣品體內(nèi)的血淋巴液，-80℃保存，備用。

1.4 保護(hù)酶系活性測定

嚴(yán)格按照試劑盒的說明操作，計(jì)算得出各組樣品的SOD酶、CAT酶和POD酶的活力值。測定時(shí)每組樣品做3個(gè)平行處理，取平均數(shù)為酶活力值，所有待測樣本為同一批次樣本。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用數(shù)據(jù)分析中的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性測定，以P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低劑量吡蟲啉對蜜蜂生長發(fā)育的影響

吡蟲啉脅迫處理后，對蜜蜂幼蟲的成活率、化蛹率和羽化率的影響結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，隨著藥物脅迫處理劑量的升高，幼蟲成活率、化蛹率和羽化率呈下降趨勢。

圖1 吡蟲啉亞致死劑量對蜜蜂生長發(fā)育的影響

2.2 超氧化物歧化酶活性測定

低劑量吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時(shí)期SOD酶活性的影響見圖2，結(jié)果可知，對照組（CK）與處理組均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，飼喂吡蟲啉濃度越高，酶活力值越大，處理組2（LD50）中各發(fā)育期的酶活性明顯高于處理組1（LD10）和對照組（CK），其中蛹期SOD酶活性最高，其次是出房期和幼蟲期，且差異顯著（P＜0.05）。

圖2 吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時(shí)期SOD酶活性的影響

2.3 過氧化氫酶活性測定

低劑量吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時(shí)期CAT酶活性的影響見圖3，結(jié)果可知，對照組（CK）與處理組均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，對照組（CK）與處理組1（LD10）的變化曲線基本一致，處理組2（LD50）中各發(fā)育期的酶活性明顯高于處理組1（LD10）和對照組（CK），其中蛹期CAT活性最高，明顯高于幼蟲期和出房期，且差異顯著（P＜0.05）。

圖3 吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時(shí)期CAT酶活性的影響

2.4 過氧化物酶活性測定

低劑量吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時(shí)期POD酶活性的影響見圖4，結(jié)果可知，對照組（CK）與處理組均呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，飼喂吡蟲啉濃度越高，酶活力值越大，處理組2（LD50）中各發(fā)育期的酶活性明顯高于處理組1（LD10）和對照組（CK），其中蛹期POD酶活性最高，其次是幼蟲期和出房期，且差異顯著（P＜0.05）。

圖4 吡蟲啉對蜜蜂各發(fā)育時(shí)期POD酶活性的影響

3 討論

超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD是昆蟲體內(nèi)3種保護(hù)性酶系，三者協(xié)作調(diào)控增強(qiáng)機(jī)體的抗逆性，以應(yīng)對不良環(huán)境。對實(shí)驗(yàn)中保護(hù)酶系的酶活性測定表明，處理組中的SOD酶活性、CAT酶活性和POD酶活性均高于對照組的酶活性，且酶活力值與中毒程度呈正相關(guān)，說明吡蟲啉的脅迫對蜜蜂體內(nèi)保護(hù)酶系的生成起到激活作用，即機(jī)體本身能夠提高其保護(hù)酶系活性，以適應(yīng)外源毒素的侵入，降解毒性，減少危害。

低劑量吡蟲啉對蜜蜂生長發(fā)育的直接影響是出現(xiàn)了延緩滯育現(xiàn)象，我們在飼喂蜜蜂時(shí)觀察到處理組的化蛹日期與羽化日期較對照組延后1～2日，最多5日，表明吡蟲啉脅迫對蜜蜂幼蟲的正常發(fā)育存在抑制作用。從蜜蜂體內(nèi)保護(hù)酶系活性在不同生長發(fā)育時(shí)期的變化上看，經(jīng)吡蟲啉處理后體內(nèi)3種保護(hù)酶的酶活力變化均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在蛹期時(shí)達(dá)到最大，幼蟲期和出房期的保護(hù)酶系酶活力因種類不同稍有差異。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果說明，化蛹期是蜜蜂體內(nèi)保護(hù)酶系活性較高、解毒功能較強(qiáng)的階段，隨著日齡的增加，保護(hù)酶系活性逐漸降低。

目前國內(nèi)外關(guān)于新煙堿類殺蟲劑誘導(dǎo)的蜜蜂氧化損傷方面的研究重點(diǎn)集中在少數(shù)幾個(gè)蜜蜂種類及單一殺蟲劑，多在室內(nèi)暴露的效應(yīng)關(guān)系互作方面，且作用時(shí)間短，這與自然狀態(tài)下復(fù)雜的污染狀況不同。由于蜜蜂在現(xiàn)實(shí)生態(tài)環(huán)境中往往暴露于多種途徑的綜合污染[14]，因此怎樣有效的與野外實(shí)際相結(jié)合，研究不同殺蟲劑交互作用對保護(hù)酶系統(tǒng)協(xié)同作用的影響，科學(xué)的反應(yīng)保護(hù)酶系對蜜蜂的影響及抗性機(jī)理是今后應(yīng)深入開展的工作。