趙靜 唐懷志

【摘 要】本文以食源性致病微生物作為目標(biāo)菌，利用PCR技術(shù)，建立一種快速高效檢測(cè)凍肉中致病微生物的PCR反應(yīng)體系。并對(duì)反應(yīng)體系的靈敏度和特異性進(jìn)行檢測(cè)分析，得到最適合的快速檢測(cè)食物中致病微生物的方法。

【關(guān)鍵詞】食源性致病微生物;PCR;靈敏度;特異性

1 前言

伴隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，食品工業(yè)規(guī)模在不斷擴(kuò)大。但是近年來(lái)食源性致病菌是引起食源性疾病的屢見(jiàn)不鮮[1]，以微生物性暴發(fā)事件數(shù)和發(fā)病人數(shù)最多，分別為總食源性疾病數(shù)的40.93%和56.39%[2]。我國(guó)是肉制品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，肉制品易受各種微生物的污染，滋生多種致病菌[3]。大腸桿菌是肉類中較為常見(jiàn)的食源性致病菌，可污染各種肉制品。長(zhǎng)期以來(lái)，這種病原菌的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法，步驟繁瑣且需要數(shù)日才能得出結(jié)論[4]。免疫學(xué)檢測(cè)方法是一種能夠?qū)⒏叨葘Ｒ恍缘目乖?抗體反應(yīng)與高度敏感性的酶催化作用結(jié)合，但免疫學(xué)檢測(cè)方法一般需要合適數(shù)量的純化細(xì)菌，或者對(duì)樣品進(jìn)行濃縮用來(lái)提高菌液的濃度，所以一般需要進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的前期增菌[5]。近年來(lái)，聚合酶鏈反應(yīng)是應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)，以其高度保守的核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，用凝膠電泳和紫外核酸檢測(cè)儀觀察結(jié)果[6]。

本研究旨在基于PCR技術(shù)，用于檢測(cè)市場(chǎng)中凍肉食品內(nèi)含有的大腸桿菌的含量，建立一套對(duì)凍肉食品中的大腸桿菌進(jìn)行快速、高效、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，為食源性致病微生物快速檢測(cè)提供參考。主要內(nèi)容包括三部分：大腸桿菌的PCR反應(yīng)體系建立;對(duì)大腸桿菌PCR退火溫度的反應(yīng)條件的優(yōu)化;實(shí)例樣品檢測(cè)，確定PCR方法的靈敏度及PCR的特異性分析。

2 材料與方法

2.1 材料及設(shè)備

大腸桿菌（由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離菌株）;Taq酶、DNA Marker DL5000均購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司;凍肉;SW-079PCR分析儀（寶生物工程大連有限公司）、JY600t電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、 LAS 500生物分子成像儀（北京綠綿科技有限公司 ）、FA1004A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）、SW-073雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）、HZQ-X10CA恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、 FMB20制冰機(jī)（上海比朗有限公司）、5424R（冷凍）艾本德臺(tái)式高速離心機(jī)（上海昆士蘭生物科技發(fā)展有限公司）、PHB-10塞里多斯酸度計(jì)（上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司）等;其它化學(xué)試劑均為化學(xué)純。

2.2 方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì) 選擇大腸桿菌的編碼溶血素基因（hlyA）作為目的基因。用Primer 5.0分析軟件分別設(shè)計(jì)引物，上游引物為F 5`-GCATCATCAAGCGTACGTTCC-3`，下游引物為R 5`-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGC-3`。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.2.2 菌種的培養(yǎng) 將保存的菌種取出，37℃水浴快速解凍，取100 μl再接種到100 ml LB液體培養(yǎng)基。37℃，搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取培養(yǎng)液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，分離出單菌落。挑取平板上的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 基因組DNA的提取 采用郭新梅，康冀川[7]等人的改良CTAB法。提取1 mL對(duì)數(shù)期菌液，12000 r/min離心5 min，向細(xì)菌沉淀中依次加入10 % SDS 30 μL，CTAB提取緩沖液（Tris- HCl 50 mmol/L，pH值8.0，EDTA 10 mmol/L;NaCl 0.7 mol/L;CTAB 1.5%）150 μL，加蛋白酶K 5 μL， CTAB/NaCl 80 μL，于60℃條件下水浴 40 min;加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），輕輕混勻，在4℃條件下以轉(zhuǎn)速12000 r/min離心5 min;取上清液，加入400 μL異丙醇混勻，在4℃條件下用轉(zhuǎn)速12000 r/min離心5 min;棄上清液，加入70%的乙醇洗滌沉淀，自然晾干，用100 μL含RNA酶A（20 mg/mL）的TE溶解DNA，于-20℃條件下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 食品樣品前處理和模板DNA的提取 （1）樣品處理：無(wú)菌條件下取25 g或25 mL食品樣品，放入225 mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成10倍梯度稀釋液。（2）增菌培養(yǎng)：將菌液接入7.5% NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)半小時(shí)。（3）取菌液4℃條件下4000 r/min離心10 min，取上清液加入另一滅菌離心管中以10000 rpm離心20 min，沉淀依據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取步驟進(jìn)行提取，利用已經(jīng)建立的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行檢測(cè)。取PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2.2.5 靈敏度及特異性分析 將致病微生物培養(yǎng)增菌后接種于食品樣品中，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，將已測(cè)濃度的菌液用生理鹽水稀釋，得到稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍的稀釋液，取2 mL提取DNA，以各自提取DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果，為了選擇最佳的退火溫度，參照查閱的文獻(xiàn)，分別選擇47.3 ℃、48.4℃、50.0℃、51.7 ℃、53.3℃、54℃進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。隨著退火溫度的升高，條帶有明顯變亮的趨勢(shì)，但到53.3℃時(shí)已變化不大，因此確定53.3 ℃為多重PCR的最佳的退火溫度。

3.2 人工污染樣品的檢測(cè)

按照2.2.4的方法將食品進(jìn)行處理，并提取檢測(cè)樣品的DNA，將提取的凍肉中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。觀察結(jié)果如圖2所示，圖中出現(xiàn)所需菌種的擴(kuò)增的特異性條帶，并且條帶清晰明亮，表明食品中存在大腸桿菌存在，并能成功擴(kuò)增出結(jié)果。

3.3 樣品PCR靈敏度檢測(cè)

將大腸桿菌人工感染凍肉處理液，經(jīng)培養(yǎng)直接提取DNA，以DNA為模板，進(jìn)行10倍梯度稀釋然后進(jìn)行PCR檢測(cè)，從圖3可以看出大腸桿菌的最低檢測(cè)限為2×10-4 ng/μL。

4 結(jié)論與討論

根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果表明，選擇大腸桿菌的編碼溶血素基因（hlyA）作為目的基因設(shè)計(jì)的特異性引物，引物的特異性較強(qiáng)且互不干擾，可以用于PCR檢測(cè)大腸桿菌。在PCR反應(yīng)體系的退火溫度的條件優(yōu)化中確立了53.3℃是最優(yōu)的退火溫度。在凍肉的檢測(cè)樣品中大腸桿菌的最低檢測(cè)含量為2×10-4ng/μL。本研究在凍肉中檢出大腸桿菌具有較強(qiáng)特異性。

本研究中特異性引物的設(shè)計(jì)存在些問(wèn)題，在PCR的大腸桿菌的陰性對(duì)照中，存在一條不是預(yù)估的條帶，但是并不影響大腸桿菌的鑒定。所以特異性目的基因的選擇顯得尤為重要，本試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌的靈敏度最低檢測(cè)限較低，通過(guò)討論分析：影響因素大致分為兩個(gè)，一是檢測(cè)樣品的基因組DNA濃度與含量較低，二是凍肉中脂肪和蛋白質(zhì)的含量較多，介質(zhì)成分干擾PCR結(jié)果。但大多數(shù)的肉制品的致病菌的感染劑量均大于103CFU/ml[8]。所以本試驗(yàn)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果對(duì)實(shí)際的應(yīng)用具有參考意義。

本試驗(yàn)建立了凍肉中大腸

桿菌的PCR檢測(cè)方法，大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間與檢驗(yàn)成本。檢測(cè)出凍肉中的兩種致病菌具有很高的特異性、較高的靈敏度、成本低的特點(diǎn)，與實(shí)驗(yàn)室中傳統(tǒng)的食品中致病菌的檢測(cè)相比，極大的節(jié)省時(shí)間，在食品安全檢測(cè)中具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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