李瑞燕，來麗娜，楊雪，王軍霖

（長治醫(yī)學院藥學系，山西長治046000）

黨參是桔?？浦参稂h參的根，入藥時，洗凈泥沙后潤透去蘆、切片或切段[1]。古代以山西上黨地區(qū)出產的黨參為上品，具有補中益氣、健脾益肺的功能，可用于治療脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短、津傷口渴，內熱消渴[2]。蘆身擅長補氣血，而蘆頭則補氣之力稍小，有涌吐風痰的作用，因此“自古參蘆不入藥”，恐系古人誤以為參蘆有催吐作用[3]。而國內學者對人參蘆頭的研究發(fā)現(xiàn)涌吐、耗氣的記載缺乏理論依據(jù)，化學成分與主根相似，臨床也有與主根相同的補益作用[4]。黨參，作為特大宗藥食兩用品種，長期以來人們也是遵從藥典將黨參去蘆頭使用。而前期研究報道甘肅產黨參蘆頭中參炔苷含量不低于參體中的含量，和參尾中的含量也并無太大差異[5]。秦蕾[6]也報道黨參根和蘆頭所含化學成分相似，含量有所差異，證明了黨參蘆頭具有保健及營養(yǎng)價值，闡明了將黨參去蘆頭使用會造成黨參資源的極大浪費。

因此，本試驗擬首次通過研究潞城產多年野生黨參蘆頭與參尾的特征圖譜，同時對其中所含的多種活性成分的含量進行分析比較，旨在全面綜合評價黨參蘆頭和參尾的質量，為指導黨參蘆頭和參尾合理有效的利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多年野生黨參藥材采自山西省潞城市北莊村。洗凈曬干，切下蘆頭和參尾，采用3點法取樣，隨機分成3批。黨參藥材均由長治醫(yī)學院生藥教研室史琳婧老師鑒定，野生黨參蘆頭和參尾外觀見圖1。

圖1 野生黨參蘆頭和參尾外觀圖Fig.1 Appearance of rhizomes and sterns of wild Radix Codonopsis

黨參炔苷對照品（HPLC≥98%，批號：111732-201607）、5-羥甲基糠醛對照品（HPLC≥98%，批號：111626-201610）、蒼術內酯Ⅲ（批號：111978-201501）：中國食品藥品檢定研究院；D-無水葡萄糖：上海源葉生物科技有限公司；試驗用水為雙蒸水：由長治醫(yī)學院藥學系綜合實驗室自制；乙腈、甲醇：色譜純；其他試劑均為市售分析純。

Agilent 1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配備 Agilent G1311四元液相泵、手動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器）：美國安捷倫公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；BSA124S電子天平、FW80型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；AS-20500A超聲波清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；精密移液器：上海榮泰生化工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；流動相為乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10 min～40 min，10%～30%A；40 min～60 min，30%～50%A；60 min～70 min，50%～90%A；70 min～80 min，90%A）；進樣量：20 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱定黨參炔苷對照品12.3 mg，加甲醇溶解，轉移并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，制成質量濃度為1.23 mg/mL的黨參炔苷對照品儲備液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備

取過80目篩的野生黨參蘆頭和參尾粉末各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲輔助（40 kHz，500 W）提取 30 min，放冷過濾，藥渣重復提取1次，過濾，用甲醇少量多次潤洗錐形瓶，合并濾液，旋蒸濃縮，浸膏再用甲醇超聲溶解，定容至5 mL，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

1.2.4 方法學驗證

1.2.4.1 空白溶劑的考察

取甲醇溶劑，在“1.2.1”項下色譜條件進樣，結果表明空白溶劑無干擾。

1.2.4.2 精密度試驗

取“1.2.3”項下制備的黨參參尾供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以黨參炔苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各共有峰相對保留時間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于 0.95%，相對峰面積的RSD小于2.32%，表明儀器的精密度良好。

1.2.4.3 重復性試驗

取過80目篩的野生黨參參尾粉末適量，按“1.2.3”項下方法平行制備黨參參尾供試品溶液6份，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各共有峰相對保留時間RSD小于0.61%，相對峰面積的RSD小于1.78%，表明該方法重復性良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗

按“1.2.3”項下方法制備黨參參尾供試品溶液，分別在室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h 后按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，以黨參炔苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各共有峰相對保留時間RSD小于1.24%，相對峰面積的RSD小于2.95%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

1.2.5 多糖含量的測定

1.2.5.1 葡萄糖對照品溶液的制備

取事先在105℃下干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加適量水溶解，轉移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得476 μg/mL的溶液。

1.2.5.2 供試品溶液的制備

取黨參蘆頭和參尾粉末（過80目篩）各約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加80%乙醇50 mL，超聲（40 kHz，500 W）提取 30 min，抽濾，棄去濾液，殘渣及濾紙揮干乙醇后加蒸餾水80mL，超聲輔助提取30min，濾過，再加蒸餾水80 mL重復超聲輔助提取1次，過濾，殘渣及濾紙用水洗滌，洗液并入2次濾液定容至200 mL的容量瓶中，搖勻備用。

1.2.5.3 線性關系考察

精密吸取葡萄糖對照品溶液（476 μg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，分別加水稀釋定容至 2.0 mL，然后分別精密加入5%苯酚1.0 mL，搖勻，再垂直快速精密加入濃硫酸5.0 mL，混勻，置沸水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫。在490 nm處測定吸光度值[7]。以一系列不同濃度（μg/mL）的葡萄糖對照品溶液為橫坐標X，以吸光度值為縱坐標Y，繪制標準曲線。

1.2.5.4 方法學驗證

參照本文作者已發(fā)表文獻[7]的方法進行試驗，精密度、穩(wěn)定性、重復性RSD值均小于3%，加樣回收率試驗測得加樣回收率平均值為99.96%，RSD值為0.85%，均符合試驗要求。

1.2.6 黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛的含量同時測定

1.2.6.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱定黨參炔苷對照品12.3 mg，5-羥甲基糠醛對照品12.4 mg，蒼術內酯Ⅲ對照品26.9 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，分別制成質量濃度為1.23 mg/mL的黨參炔苷對照品儲備液、1.24 mg/mL的5-羥甲基糠醛對照品和2.69 mg/mL蒼術內酯Ⅲ對照品儲備液。用移液槍分別取3種對照品儲備液800、800、200 μL置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。

1.2.6.2 供試品溶液的制備同“1.2.3”項下方法

1.2.6.3 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液0.2、0.6、0.8、1.5 mL分別加甲醇定容至5 mL容量瓶中備用。平行取“1.2.6.1”項下原混合對照品溶液，5份溶液分別用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“1.2.1”項下色譜條件，測定黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛峰面積的積分值。以一系列不同濃度（μg/mL）的混合對照品溶液為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y進行線性回歸，即得三者回歸方程、線性關系（r）及線性范圍，結果見表2。

1.2.6.4 儀器精密度試驗

取混合對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，結果黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛峰面積RSD分別為0.68%、1.21%、1.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

1.2.6.5 重復性試驗

取黨參參尾粉末（過80目篩）適量，按“1.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，計算供試品中3種活性成分的含量，結果黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛RSD分別為1.80%、1.46%、1.75%（n=6）。表明本方法重復性良好。

1.2.6.6 穩(wěn)定性試驗

取“1.2.3”項下制備的一份黨參參尾供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24h 按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結果黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛峰面積RSD分別為1.30%、0.95%、1.12%（n=5），表明供試品在24 h內穩(wěn)定。

1.2.6.7 加樣回收率試驗

取已知含量的野生黨參參尾粉末各約1.0 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入相當于樣品含量100%的3種對照品，按“1.2.3”項下方法用甲醇25 mL超聲輔助提取2次，濾液濃縮得浸膏，然后用甲醇定容至10 mL得供試品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“1.2.1”項下色譜條件測定，計算各成分的加樣回收率。

2 結果與分析

2.1 HPLC特征圖譜的建立與分析

取過80目篩的野生黨參蘆頭和參尾粉末各適量，按“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，得HPLC特征圖譜，比較各樣品HPLC圖譜中共有峰的數(shù)目，結果見圖2。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2008版）”軟件，用中位數(shù)法多點校正，分別計算野生黨參蘆頭和參尾與生成的對照圖譜的相似度，結果見表1。

由圖2可以看出，黨參蘆頭和參尾的HPLC特征圖譜主要特征峰相同，通過對樣品各個峰進行比對分析，發(fā)現(xiàn)了10個共有峰；經與混合對照品圖譜比對，其中1號峰為5-羥甲基糠醛，8號峰為黨參炔苷，10號峰為蒼術內酯Ⅲ。由表1相似度評價結果可知，黨參蘆頭和參尾特征圖譜相似度為0.904，說明黨參蘆頭和參尾的主要化學成分差異不大。

圖2 混合對照、黨參蘆頭及參尾的HPLC特征圖譜Fig.2 HPLC specific chromatograms of mixed contrast、rhizomes and sterns of Radix Codonopsis

表1 黨參蘆頭和參尾HPLC特征圖譜相似度評價結果Table 1 Similarities evaluation of rhizomes and sterns of Radix Codonopsis by HPLC specific chromatograms

2.2 線性回歸方程

黨參蘆頭和參尾中各成分的回歸方程、線性關系（r）及線性范圍，結果見表2。

表2 各成分的線性回歸方程Table 2 Equation of linear regression of four components

2.3 3種成分的加樣回收率試驗結果

3種成分的加樣回收率試驗結果見表3。

表3 3種成分的加樣回收率試驗結果（n=6）Table 3 The results of recovery test of three components（n=6）

續(xù)表3 3種成分的加樣回收率試驗結果（n=6）Continue table 3 The results of recovery test of three components（n=6）

2.4 樣品含量測定

取黨參蘆頭和參尾粉末（過80目篩）各適量，分別按照“1.2.3”和“1.2.5.2”項下方法制備供試品溶液，測定并計算黨參蘆頭和參尾中各成分的含量，結果見表4。

表4 黨參蘆頭和參尾各成分的含量Table 4 Contents determination of four components in rhizomes and sterns of Radix Codonopsis mg/g

3 討論

3.1 前處理方法考察[8]

本研究前期比較了不同提取溶劑（甲醇和乙醇）、提取方法（超聲和回流），結果發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取和回流提取無明顯差異，考慮到超聲輔助提取操作簡便且耗時短，所以選用超聲操作；選用甲醇作為提取溶劑時，能盡可能完全地提取出藥材中所含的有效成分；選用甲醇作為溶劑進行超聲輔助提取獲得的供試品溶液采用HPLC法進行測定，發(fā)現(xiàn)色譜峰信息較豐富、峰面積較大。

3.2 色譜條件選擇

篩選了流動相體系（乙腈-水[9-10]、甲醇-水[11-12]、乙腈-0.1%磷酸溶液[13-14]、乙腈-0.5%磷酸溶液）采用HPLC進行測定，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動相時峰個數(shù)較多、色譜峰峰分離度較好；不同檢測波長（220、256、267 nm）下獲取數(shù)據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)選用波長256、267 nm處蒼術內酯Ⅲ吸收很小，而在220 nm時黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ及5-羥甲基糠醛三者均有較大吸收，且樣品的HPLC圖譜峰形較好、不與其他色譜峰發(fā)生重疊，多數(shù)成分在220 nm處均有較好的響應，故最終確定選用流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液、檢測波長在220 nm處進行檢測。

3.3 結果分析

黨參含有多糖類、植物甾醇類、萜類、生物堿類、苯丙素苷類等多種化學成分，其中多糖類所占比例最大[15]，是其有效成分之一，也是評價黨參質量優(yōu)劣的主要指標。因此本研究采用經典的苯酚-硫酸法測定黨參中多糖的含量，發(fā)現(xiàn)潞城產多年黨參蘆頭和參尾中均主要含有多糖類成分，在參尾中多糖的含量是蘆頭的近100倍。

王崢濤從不同產地黨參屬19種黨參及一個變種素花黨參中首次分離得到倍半萜內酯類化合物蒼術內酯Ⅲ，其具有很好的抗炎活性，并指出是否含有蒼術內酯Ⅲ可作為潞黨參的一個重要的鑒別和質量評價手段[16-17]；5-羥甲基糠醛具有抗心肌缺血、抗氧化、增進血紅細胞變性等藥理活性[18]，鄒利研究發(fā)現(xiàn)米炒黨參飲片后5-羥甲基糠含量增加，從而對胃腸平滑肌的興奮性收縮起到調控的作用，是黨參健脾功效增強的物質基礎之一[19]；此外2015版藥典僅將黨參炔苷（薄層鑒別）作為黨參指標性成分，但是在一些代用品和摻偽品中也能檢測到黨參炔苷。因此黨參炔苷只能作為黨參的一般化學標示物，而不能作為特征化學標示物單獨用于黨參的鑒定[20]。綜合考慮，反映黨參的整體質量需要研究其所含的化學組成分。因此，本研究對以上3種活性成分（黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛）的含量進行同時測定以全面綜合評價黨參的整體水平，研究結果發(fā)現(xiàn)在蘆頭中蒼術內酯Ⅲ和5-羥甲基糠醛的含量遠低于參尾，具有顯著性差異（P＜0.05）；在黨參蘆頭和參尾中黨參炔苷的含量較為接近。這與趙曉華[5]報道的甘肅產黨參不同部位中黨參炔苷的含量分析一致。

目前，指紋圖譜已成為國內外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質量的有效方法。它能有效地檢測和控制中藥產品的真實性、質量的一致性及穩(wěn)定性[21]。因此，本研究在多指標成分進行含量測定的同時結合中藥特征圖譜進行全面綜合的質量評價，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2008A版）對黨參蘆頭和參尾的特征圖譜進行了比較分析，相似度在0.90以上，主要化學特征相似，確定了10個共有峰，但共有峰的高度和峰形等細節(jié)存在些許差異。

黨參的銷量是逐年增加的，現(xiàn)在每年的銷量在30 000 t以上。蘆頭重量占主根重量的8%～15%，如果按每100克黨參去蘆頭8 g計算，那一年至少棄去黨參蘆頭2 400 t。有研究報道黨參炔苷可以保護乙醇造成的胃黏膜損傷[22]，本研究發(fā)現(xiàn)黨參蘆頭中黨參炔苷的含量和參尾中基本接近，推測蘆頭在胃黏膜保護的功效方面可能不亞于參尾，未來可以將蘆頭運用到釀酒工業(yè)中制作營養(yǎng)類保健酒。另外，蘆頭中含有的主要成分多糖具有增強機體免疫[23]、抑制腫瘤[24]、延緩衰老[25]等功效，也可以運用到保健品、化妝品等領域。因此，黨參帶蘆頭入藥既能極大地提高資源利用率，又能保證經濟價值最大化。

綜上所述，本研究運用特征圖譜結合多種活性成分定量對潞城產野生黨參蘆頭和參尾進行了全面分析，結果發(fā)現(xiàn)黨參蘆頭和參尾具有相似的化學特征，其中質量標志性成分（黨參炔苷）含量相差不大，其余3種活性成分的含量有所差異，黨參蘆頭和參尾中均主要含有多糖成分。后續(xù)除了從化學成分的角度來考察二者的異同外，還會結合藥理藥效作用對黨參蘆頭與參尾進一步進行藥效學比較研究，以全面評價蘆頭與參尾一同入藥的必要性。