運立媛，張民，朱振元

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

糖尿病是最嚴重的疾病之一，它對健康，生活質(zhì)量，人的壽命以及現(xiàn)代醫(yī)療保健系統(tǒng)都有重大影響[1]。因此，尋找安全有效的治劑成為人們的研究熱點。越來越多的研究者從植物中提取出具有降血糖的活性成分來治療糖尿病。

黃芪，是一種多年生草本植物，廣泛分布于世界各地的溫帶地區(qū)，是一種多年生植物[2]。黃芪的干根，在神農(nóng)本草經(jīng)中被記載，是中國2000多年來最流行的對人體健康有益的中草藥之一[3]?，F(xiàn)代植物化學和藥理試驗證明，多糖是黃芪根的主要活性成分之一，具有多種重要的生物活性，例如造血功能、神經(jīng)保護[4]、抗氧化劑[5-6]、保護內(nèi)皮細胞[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抗肝炎病毒[9]、降血糖等活性[10]。有報道指出黃芪多糖對糖尿病小鼠有顯著的低血糖作用[11]。由于自然環(huán)境的不同，因此導致黃芪的品質(zhì)不同。本研究旨在探討不同地區(qū)黃芪多糖的活性的差異，為黃芪在降血糖活性的應用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪（Astragalus membranaceus）根：來源于山西、甘肅、四川、貴州、新疆、內(nèi)蒙古、大興安嶺，經(jīng)鑒定均為膜莢黃芪。木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡聚糖-2000、葡聚糖-500、葡聚糖-110、葡聚糖-70、葡聚糖-40、葡聚糖-10、α-葡萄糖苷酶（125 U/mg）、阿卡波糖：美國 Sigma公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）：國藥集團化學試劑北京有限公司；無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸、醋酸酐均為分析純；小鼠維持飼料：斯貝福北京生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（HWS26）：上海一恒科技有限公司；冷凍干燥機（Modulyod-230）：美國 Thermo公司；高效液相色譜儀（LC-20AT）、示差折光檢測器（RID-20AT）、凝膠色譜柱（SB-805HQ）：日本島津公司；血糖監(jiān)測儀（EZ III）：Acon生物技術(shù)有限公司。

1.3 多糖的提取

將清洗后的黃芪根置于50℃烘箱，烘干24 h，粉碎，過60目篩，備用。稱取50 g樣品無水乙醇回流脫脂[12]，向脫脂后樣品中加入10倍體積的蒸餾水，于80℃下提取2 h，共提取3次，合并提取液，60℃下對濾液濃縮，濃縮至300 mL，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇進行沉淀，于4℃條下沉淀15 h，Sevage試劑（三氯甲烷 ∶正丁醇=4∶1，體積比）除蛋白[13]，溶液真空濃縮，冷凍干燥[14]，得粗多糖。多糖得率計算公式為：

式中：m1為黃芪多糖質(zhì)量，g；m2為黃芪質(zhì)量，g。

通過苯酚硫酸法對樣品中的中性糖含量進行測定，以葡萄糖為標準品[15]；通過二硝基水楊酸法（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法對還原糖含量進行測定[16]。

1.4 黃芪多糖單糖組成分析

向5 mg黃芪多糖樣品中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），于110℃反應3 h。冷卻后用N2吹干殘余的TFA，加少量甲醇，用N2吹干，反復3次以除盡TFA。向酸降解產(chǎn)物中加入10 mg鹽酸羥胺，2 mg肌醇六乙酸乙酯，0.5 mL吡啶，混合均勻后密封，于90℃反應30 min。反應30 min后冷卻至室溫，向反應管中加入0.5 mL醋酸酐，于90℃繼續(xù)反應30 min。生成糖腈乙酸酯衍生物，將衍生物通過N2吹干后，加入1 mL二氯甲烷重新溶解，通過0.22 μm濾膜進行過濾。取1 μL進行氣相色譜分析[17]。以單糖（葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，阿拉伯糖）衍生化的產(chǎn)物作為對照。根據(jù)各峰的峰面積計算摩爾比。

1.5 黃芪多糖分子量的測定

通過SB-805HQ凝膠色譜柱結(jié)合示差檢測器對黃芪多糖進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。蒸餾水配制濃度為5mg/mL的多糖溶液，0.22 μm 濾膜過濾，進樣量為 20 μL，流速為0.6 mL/min，超純水作流動相。以T-系列葡聚糖（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）為標準品，以保留時間為橫坐標，分子量的對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線[18]，通過標準曲線計算多糖各組分的分子質(zhì)量。

1.6 α-葡萄糖苷酶抑制活力測定

腸道內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)生可以通過α-葡糖苷酶抑制劑進行抑制，從而降低餐后血糖的升高[18]。阿卡波糖等α-葡糖苷酶抑制劑是常見且有效的治療Ⅱ-型糖尿病的臨床治療藥物。

試驗分為抑制劑組與對照組[19-20]。抑制劑分別為不同產(chǎn)地的黃芪多糖及阿卡波糖。向抑制劑組分別加入400 μL抑制劑及400 μLα-糖苷酶（1U）。抑制劑對照組分別加入400 μL抑制劑及400 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）；空白組分別加入400 μL磷酸鹽緩沖液及400 μL α-糖苷酶（1U），空白對照組中加入 800 μL 磷酸鹽緩沖液（pH7.0），于37℃反應20 min。之后向每組中加入100μLpNPG（100mmol/L）于37℃反應40min。最后以1.5 mL NaOH溶液（1.0 mol/mL）以停止反應的進行，于410 nm處測各組的吸光度值。抑制率計算公式為：

式中：A1為抑制劑組吸光度值；A2為抑制劑對照組吸光度值；A3為空白組吸光度值；A4為空白對照組吸光度值。

1.7 動物實驗

雄性昆明小鼠[（20±2）g，證書號：SXCK（津）2014-0008）]由中國醫(yī)學科學院中心（北京）提供。飼養(yǎng)溫度保持在（22±2）℃，環(huán)境濕度（55±10）%，自由飲水，攝取維持飼料。

1.7.1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立

小鼠在培養(yǎng)環(huán)境中適應6天后，除空白組，其他小鼠于腹腔內(nèi)注射160 mg/kg·BW的新鮮制備的pH4.5的鏈脲佐菌素（STZ）溶液。注射鏈脲佐菌素72 h后，通過血糖監(jiān)測儀進行測試，當血糖水平超過11.1 mmol/L時，被認為是造模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠，可用于后續(xù)實驗。

1.7.2 實驗動物的分組

將STZ誘導小鼠隨機分成9組，每組10只。分別為空白組（NC），模型組（DC），阿卡波糖陽性對照組（PC），山西黃芪多糖組（SX），甘肅黃芪多糖組（GS），四川黃芪多糖組（SC），貴州黃芪多糖組（GZ），新疆黃芪多糖組（XJ），內(nèi)蒙古黃芪多糖組（NMG），大興安嶺黃芪多糖組（DXAL）。多糖灌胃劑量為120 mg/kg·BW。

所有的小鼠都采用灌胃的方式給藥，連續(xù)灌胃4周。在整個過程中，小鼠以維持飼料喂養(yǎng)。每周通過血糖儀測定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）值。

1.7.3 口服糖耐量的測定

糖耐量是指人體對攝入的葡萄糖具有很大耐受能力的現(xiàn)象。在實驗最后一天前12小時禁食。尾靜脈采血測血糖值，對小鼠灌胃40%葡萄糖溶液，灌胃劑量為2.5 g/kg·BW。灌胃后測0、30和120 min的血糖值并計算血糖曲線下面積（area under curve，AUC）。

曲線下面積（AUC）=0.5×空腹血糖值+30 min血糖值+1.5×60 min血糖值+120 min血糖值

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地黃芪粗多糖得率及含量分析

通過熱水提取、Sevage除蛋白、乙醇醇沉、冷凍干燥后得黃芪粗多糖。通過苯酚硫酸法對不同產(chǎn)地黃芪多糖的含量進行測定，結(jié)果如表1。

表1 不同產(chǎn)地黃芪多糖的得率及糖含量分析Table 1 The analysis on the yield and sugar content of Astragalus polysaccharide from different regions %

多糖含量由高到低分別為：四川＞貴州＞甘肅＞內(nèi)蒙古＞山西＞新疆＞大興安嶺。多糖得率如表1所示，得率由高到低分別為：山西＞新疆＞大興安嶺＞甘肅＞內(nèi)蒙古＞貴州＞四川。由結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地黃芪多糖得率與含量存在著顯著的差異。

2.2 不同產(chǎn)地黃芪多糖單糖組成及分子量分析

多糖結(jié)構(gòu)和物理化學性質(zhì)是影響多糖生物活性的主要因素。單糖組成和分子量在多糖的活性中起著關(guān)鍵的作用。不同產(chǎn)地黃芪多糖的單糖組成及分子量分析如表2所示。

表2 不同產(chǎn)地黃芪多糖單糖組成及分子量分析Table 2 Molecular weight distribution and monosaccharide composition of crude Astragalus polysaccharide

試驗結(jié)果表明，不同區(qū)域的多糖具有不同的摩爾比，且內(nèi)蒙古、大興安嶺的黃芪多糖主要含有木糖。通過HPLC法對不同產(chǎn)地黃芪多糖的分子量進行分析。通過標準曲線計算出多糖的平均相對分子質(zhì)量，結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地黃芪多糖的相對分子質(zhì)量存在的差異，且各產(chǎn)地的黃芪多糖均含有兩個組分。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

阿卡波糖與不同產(chǎn)地黃芪多糖的葡萄糖苷酶抑制活性如圖1所示。

由圖1可以看出葡萄糖苷酶的抑制活性與多糖濃度呈量效關(guān)系，且內(nèi)蒙古和大興安嶺的黃芪多糖均表現(xiàn)出明顯的抑制活性。這可能是由于相對分子質(zhì)量和單糖成分的差異造成的。

圖1 不同產(chǎn)地黃芪多糖的α-葡糖苷酶抑制活性Fig.1 α-glucosidase inhibition activity of crude Astragalus polysaccharides in different regions.

2.4 體內(nèi)降血糖實驗

2.4.1 不同產(chǎn)地黃芪多糖對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

體重的減少是糖尿病的常見特征[21]。傳統(tǒng)上的Ⅱ型糖尿病治療與體重相關(guān)。在此研究中，每周對9組糖尿病小鼠進行體重的測定，結(jié)果如表3所示。

表3 不同產(chǎn)地黃芪多糖對Ⅱ型糖尿病小鼠的體重及臟器指數(shù)的影響Table 3 The effect of Astragalus polysaccharide from different regions on the weight and organ index of typeⅡdiabetes mellitus mice

經(jīng)過4周的治療，所有的糖尿病小鼠體重都有所增加。然而，模型組糖尿病小鼠的體重仍然顯著低于正常小鼠（p＜0.01），肝臟，胰腺，胸腺和脾臟的重量明顯降低（p＜0.01）。黃芪多糖組中小鼠體重的增加和器官指數(shù)的增加意味著黃芪多糖可有效地緩解Ⅱ型糖尿病。與模型組相比內(nèi)蒙古黃芪多糖藥物組與黃芪多糖藥物組臟器指數(shù)增加的更顯著（p＜0.01）。

2.4.2 不同產(chǎn)地黃芪多糖對空腹血糖水平的影響

不同產(chǎn)地黃芪多糖對糖尿病小鼠血糖水平的影響見圖2。

由圖2可以看出，經(jīng)STZ注射后，與正常組相比，模型組空腹血糖顯著升高（p＜0.01），說明鏈脲佐菌素可造成小鼠胰島損傷，導致胰島素分泌不足。與模型組相比，黃芪多糖組中小鼠的空腹血糖均有所降低，且在第四周后，內(nèi)蒙古與大興安嶺多糖組小鼠血糖值分別顯著降低47.83%與49.49%。

2.4.3 不同產(chǎn)地黃芪多糖對糖尿病小鼠糖耐量的影響

不同產(chǎn)地黃芪多糖對糖尿病小鼠糖耐量的影響見圖3。

口服葡萄糖耐量實驗如圖3a所示，所有實驗組小鼠的血糖水平在30 min時達到峰值，120 min后，血糖值有均呈下降趨勢，且正常組小鼠血糖值逐漸恢復到正常水平。如圖3b，根據(jù)曲線下面積（AUC）可以看出，與正常組相比，模型組的曲線下面積顯著升高（p＜0.01），與模型組相比，黃芪多糖實驗組中，各組的曲線下面積均有所降低，且內(nèi)蒙古黃芪多糖組和大興安嶺黃芪多糖組小鼠葡萄糖耐量顯著降低（p＜0.01）。

圖2 不同產(chǎn)地黃芪多糖對糖尿病小鼠血糖水平的影響Fig.2 Effect of APS from different regions on fasting blood glucose levels in diabetic mice

圖3 不同產(chǎn)地黃芪多糖對糖尿病小鼠糖耐量的影響Fig.3 Effects of APS from different regions on glucose tolerance in the diabetic mice

3 結(jié)論

由試驗結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的黃芪多糖在分子質(zhì)量，單糖組成，單糖摩爾比上存在著差異，且內(nèi)蒙古與大興安嶺黃芪多糖主要由木糖組成。α-葡萄糖苷酶抑制活性與體內(nèi)降血糖活性表明，不同產(chǎn)地的黃芪多糖均有降血糖效果，且內(nèi)蒙古和大興安嶺的黃芪多糖降血糖活性最顯著。