陳秋陽,趙彬潔,袁 潔,張 健,譚 香,*,張全發(fā)

1 中國科學院武漢植物園水生植物與流域生態(tài)重點實驗室, 武漢 430074 2 中國科學院大學, 北京 100049

反硝化是去除河流氮污染、調節(jié)氮循環(huán)的關鍵過程。通過大氣氮沉降、氮肥的使用、糞便的排放和生物固氮等方式輸入河流的氮元素,在最終匯入海洋前,有將近一半由反硝化的作用去除,釋放到大氣中[1]。河流中的氮循環(huán)微生物參與了包括固氮、硝化、反硝化、厭氧氨氧化和氨化等生態(tài)過程,各形態(tài)的氮作為主要反應物,河流中的氮素水平直接影響了微生物的群落特征和功能作用,因此施肥行為將顯著改變氮循環(huán)微生物的群落結構,增強其生物功能活性。研究表明,在河流砂質沉積物內添加氮質營養(yǎng)能促進反硝化進程[2]；氮肥的施用促進了反硝化細菌的活性,有機肥還能提高土壤反硝化細菌多樣性[3]。光照的強度對底棲和浮游藻類的生長具有顯著的影響[4],從而影響藻類對河流沉積物中氮磷營養(yǎng)鹽和有機碳的吸收和釋放[5-7]。比如,暗光環(huán)境會抑制沉積物中異養(yǎng)細菌的生長,低光照強度能降低異養(yǎng)細菌的碳生物量貢獻率[8]。

迄今為止,反硝化細菌群落對營養(yǎng)響應的生態(tài)試驗常見于農業(yè)土壤和水產養(yǎng)殖沿岸土壤的研究中[9-10],利用野外原位生態(tài)試驗探索營養(yǎng)添加和遮光處理對河流沉積物反硝化微生物多樣性影響的研究鮮有報道。本實驗選擇漢江上游金水河流域中的森林溪流,采集進行原位營養(yǎng)添加和遮光處理后的河流砂質沉積物,選用nirS功能基因作分子標記,采用16S rDNA技術研究兩種處理對反硝化細菌群落結構和物種多樣性的影響,可以為深入理解人類活動對流域脫氮能力的改變提供依據。

1 實驗方法

1.1 研究區(qū)域

在金水河上游的東河及其支流中選取6條溪流作為實驗樣地,分布如圖1,自上游到下游分別為李家溝、東河、倒流水溝、牌坊溝、瓦房溝和轉彎溝。

圖1 實驗樣地分布圖Fig.1 Map of the study area and sampling sites

1.2 實驗設計

控制實驗設置在有連續(xù)水域的溪流河段上,水面無樹木遮擋。每條溪流選取長20 m、寬8 m的河段,自上游至下游分成4個區(qū)域：對照區(qū)(O： Open)、遮光區(qū)(S: Shaded)、營養(yǎng)區(qū)(ON: Open & Nutrient)和遮光營養(yǎng)區(qū)(SN: Shaded & Nutrient)。每個區(qū)域尺寸為：長5 m、寬8 m。每個區(qū)域之間的間隔為30 m。圖2是對照區(qū)和3個處理區(qū)的實驗布置示意圖。對照區(qū)(O)河段不進行任何特殊處理,反映自然狀態(tài)下的溪流；遮光區(qū)(S)在水面以上0.5 m處覆蓋長方形遮陽網,選用遮光率大于95%的黑色遮陽網,應完全遮蓋該區(qū)域的水面；在營養(yǎng)區(qū)(ON)的沉積物中均勻施加50 kg緩釋肥,緩釋肥用小型蛇皮袋分裝,包扎后均勻的投放在河面上；遮光營養(yǎng)區(qū)(SN)在沉積物中用相同的方法均勻施加50 kg緩釋肥后,在河面以上50 cm處覆蓋同樣的黑色遮陽網。由于森林河流在源頭處的郁閉度極高,遮光處理可以模擬河流源頭區(qū)域通常比較隱蔽光照強度不足的狀況；人類沿河耕種施肥和排放生活污水帶給河流營養(yǎng)的輸入狀態(tài)可以用營養(yǎng)添加處理來模擬。營養(yǎng)添加處理中使用的緩釋肥是美國Scotts公司生產的精準奧綠肥(Osmocote Exact),有效成分比N∶P∶K=15∶19∶12?？刂茖嶒灥奶幚頃r間為60天,2015年10月布設,2015年12月進行樣品采集。樣品采集時,每一個處理區(qū)域選取3個平行河水樣品和砂質沉積物樣品用于后期實驗室內測量反硝化活性和微生物物種多樣性?，F場測量的指標均由YSI6920水質檢測儀完成,有：河水溫度(Temperature)、溶解氧含量(Dissolved Oxygen)、pH和濁度(Turbidity)?？偟?Total Nitrogen；TN)由碳氮儀Multi N/C2100測定,總磷(Total Phosphorus；TP)由鉬酸銨分光光度法(GB 11893-89)測得。

圖2 河流遮蓋和營養(yǎng)加富實驗布置示意圖Fig.2 The experiment diagram of coverage and enrichment treatments

1.3 樣品的采集和反硝化活性測定

營養(yǎng)添加及河面遮蓋2個月后,取每條溪流四個區(qū)域的沉積物。用采樣袋采集200 g砂質沉積物,放入干冰和保溫箱中帶回實驗室,凍干后用于DNA的提取。用采樣袋采集500 g砂質沉積物,在4℃條件下帶回實驗室,測定反硝化活性,即,利用乙炔抑制法培養(yǎng)沉積物4 h,用真空氣瓶收集產生的N2O氣體,N2O濃度用裝有63Ni電子捕獲器(Electron Capture Detector)的氣相色譜儀測定。每個樣品3個重復。評價沉積物的反硝化活性的指標是培養(yǎng)沉積物樣品4 h內N2O生成速率,根據Terry等提供的公式計算水中溶解N2O 的濃度[13]。4 h內的平均反硝化速率v為：

單位是：μg N2O-N g-1h-1,表示每1 g烘干沉積泥沙在4 h內產生的N2O態(tài)N的質量。其中Ct是4 h后頂空氣體中N2O的濃度；Vh是頂空氣體的體積；Vw是加入的水的體積；為本森系數；CFn是修正系數,當只抽取一次氣體時,CFn的值為1；Ms為烘干后的沉積物質量；T為培養(yǎng)時的溫度；P為壓強；R=8.31451 KPa mol-1K-1。

1.4 細菌總DNA提取和PCR擴增

選取倒流水溝和東河兩條溪流的各區(qū)域河流砂質沉積物進行反硝化微生物分析,分析流程如下：

其中,使用Omega Soil kit試劑盒從河流沉積物樣品中分離出DNA；用NanoDrop分光光度計檢驗提取的DNA純度；用Qubit?2.0熒光定量儀測量DNA濃度；利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

測序區(qū)域：反硝化細菌16SrDNA的Cd3aF-R3cd；引物：Cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)和R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)。PCR擴增采用TransStart?FastpfuDNA Polymerase(20 μl反應體系)。

1.5 序列分析

OTU(Operational Taxonomic Unit)及物種群落分析：使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)對所有樣品的全部有效標記(Effective Tags)序列進行一致性(Identity)聚類,形成OTU。在對OTU注釋并去除污染OTU后,使用R軟件進行各個分類等級的注釋比例和物種相對豐度的統(tǒng)計。選取關注細菌屬的OTU使用QIIME軟件進行系統(tǒng)進化樹構建,進行系統(tǒng)進化關系展示。最后使用R軟件進行綱級別的相對豐度熱圖繪制,同時進行樣本間和物種間的聚類分析。

Chao指數是常用的通過預測樣品中OTU數量,衡量樣品中OTU豐富度的指數,用來評估沉積物樣本的物種多樣性,指數越高,表明樣本的多樣性越復雜。覆蓋百分率(Coverage)通過下列公式計算：

式中,n1表示克隆文庫中只出現一次的OTU數量,N表示每個克隆文庫的克隆總數。覆蓋百分率越高, 表明文庫表達真實環(huán)境中nirS基因群落結構的置信度越高。在文庫庫容相同的情況下,覆蓋百分率越高,nirS型反硝化細菌的群落多樣性就越低。

1.6 統(tǒng)計分析

多樣性指數(Chao),使用QIIME軟件計算。

沉積物反硝化活性在遮光和營養(yǎng)添加處理下的差異顯著性分析,以及遮光和營養(yǎng)添加處理下沉積物nirS型反硝化細菌物種相對豐度和物種數量的差異顯著性分析,由SPSS 16.0進行方差分析(ANOVA)和LSD多重比較分析方法。

2 結果

2.1 河流水體的基本理化性質

控制實驗實施前,6條溪流河水的理化指標背景值如表1所示。6條溪流的河水均為弱堿性,溶解氧含量較高,濁度很低。當四種處理持續(xù)2個月時(2015年12月),營養(yǎng)添加處理前后水體理化性質的改變可對比表2和表3。2個月的處理后,較對照區(qū)域(O),營養(yǎng)添加處理區(qū)域(ON)的河水酸堿度顯著(P<0.05)降低,溶解氧含量顯著(P<0.05)上升?？偟涂偭缀吭?條河流中的變化各有不同。較對照區(qū)而言,營養(yǎng)添加僅使倒流水(DLSG)和牌坊溝(PFG)的總氮TN 顯著(P<0.05)增加,對其他河流無顯著影響。較對照區(qū)而言,營養(yǎng)添加僅使李家溝(LJG)、倒流水溝(DLSG)、牌坊溝(PFG)和轉彎溝(ZWG)的總磷TP 顯著(P<0.05)增加,對其他河流無顯著影響。

表1 對照區(qū)6條溪流河水的基本理化性質監(jiān)測初始值(10月)

第一列縮寫為對應的拼音首字母縮寫,表中數值為：平均值±標準偏差,重復次n=3；NTU為Nephelometric Turbidity Unit,是散射比濁測定法測定濁度的單位

表2 對照區(qū)6條溪流河水的基本理化性質(12月)

表中數值為：平均值±標準偏差(Mean±SD),重復次n=3；小寫字母a和b表示在P<0.05水平上的差異；NTU為Nephelometric Turbidity Unit,是散射比濁測定法測定濁度的單位

表3 營養(yǎng)區(qū)6條溪流河水的基本理化性質(12月份)

表中數值為：平均值±標準偏差(Mean±SD),重復次數n=3；小寫字母a和b表示在P< 0.05水平上的差異；NTU為Nephelometric Turbidity Unit,是散射比濁測定法測定濁度的單位

2.2 沉積物反硝化活性變化

圖3 不同處理下的河流沉積物培養(yǎng)4 h內的反硝化速率 Fig.3 Denitrification rate of 4-hour-inhibited sediments in different segments縱坐標反硝化速率的單位ng N2O-N g-1 h-1,表示每1 g烘干沉積泥沙在4 h內產生的N2O態(tài)N的質量；O：對照區(qū)(Open),S：遮光區(qū)(Shading),ON：營養(yǎng)區(qū)(Open & Nutrient),SN：遮光營養(yǎng)區(qū)(Shading & Nutrient)；a和b表示小寫字母表示在P<0.05水平上的差異

對4種處理下6條河流的沉積物4 h平均反硝化速率做單因素方差分析和LSD法多重比較分析,結果表明,遮光處理S與對照O、營養(yǎng)添加ON和遮光且營養(yǎng)添加SN這3種處理之間的差異性顯著(P<0.05),O、ON和SN 3種處理之間彼此沒有顯著差異(P>0.05)。如圖3所示是在6條河流中4種處理下的河流沉積物反硝化活性。相比于對照區(qū)(O),河面遮光處理(S)顯著(P<0.05)降低了沉積物的反硝化活性,營養(yǎng)添加處理(ON)和營養(yǎng)添加且河面遮蓋處理(SN)的沉積物反硝化活性略微增加,但與對照區(qū)(O)沒有顯著的差異(P>0.05)。均進行了遮光處理的 S和SN兩組之間比較,遮光且營養(yǎng)添加處理(SN)顯著(P<0.05)提高了沉積物的反硝化活性。

見表4,6條河流中,經過S、ON和SN 3種處理后,倒流水溝的沉積物反硝化活性變化幅度最大,4 h內平均反硝化速率在河面遮蓋區(qū)域達到最小值15.98 ng N2O-N g-1h-1,在營養(yǎng)添加區(qū)域達到最大值114.90 ng N2O-N g-1h-1。牌坊溝的沉積物反硝化活性變化幅度最小,4 h內平均反硝化速率在河面遮蓋區(qū)域達到最小值63.15 ng N2O-N g-1h-1,在營養(yǎng)添加區(qū)域達到最大值77.70 ng N2O-N g-1h-1。

表4 4種處理下6條河流沉積物4 h內的反硝化速率平均值(ng N2O-N g-1 h-1)

O：對照區(qū),Open;S：遮光區(qū),Shading;ON：營養(yǎng)區(qū),Open & Nutrient;SN：遮光營養(yǎng)區(qū),Shading & Nutrient; 表中數值為：平均值±標準偏差(Mean±SD),重復次數n= 3

2.3 OTU系統(tǒng)進化與豐度聚類分析

圖4 4種處理區(qū)域內沉積物中nirS型反硝化細菌在各分類學分支的分布Fig.4 Taxonomic distribution of denitrifying bacteria by encoding nirS gene in sediments from 4 segments扇形的面積表示不同處理區(qū)域內的樣品在該細菌分類上相對豐度的比例大??；分類名下方的數字表示4種處理區(qū)域種的所有沉積物樣品在該分類上的平均相對豐度百分率

反硝化細菌的序列分析是基于東河(DH)和倒流水溝(DL)中四種處理區(qū)域的沉積物樣品進行的。基于樣本內的 OTU 的物種系統(tǒng)進化關系及相對豐度信息,在屬水平上,選擇每個分類中所有樣品相對豐度最大的前 10 個分類,分別是Alpha變形菌綱的趨磁螺菌屬(Magnetospirillum),Beta變形菌綱的未分類Beta變形菌(Candidatus_Accumulibacter_phosphatis)、纖毛菌屬(Leptothrix、Rubrivivax)、固氮螺菌屬(Azospira)、脫氯單胞桿菌屬(Dechloromonas)和凍膠菌屬(Zoogloea),Gamma變形菌綱的假單胞菌屬(Pseudomonas)和黃桿菌屬(Rhodanobacter),除此之外的反硝化細菌序列均屬于非變形菌門的環(huán)境樣品(environmental_samples_norank)。在可識別的反硝化細菌中,脫氯單胞桿菌屬具有最高的相對豐度,占所有測序nirS型反硝化細菌的15.476%,遠高于其他屬,在控制實驗四種處理區(qū)域內的沉積物中均為優(yōu)勢屬(圖4)。

圖5 東河與倒流水溝各處理區(qū)沉積物nirS反硝化細菌在綱級別的豐度聚類Fig.5 Class-level clustering of denitrifying bacteria by encoding nirS gene in sediments from all segments in DH and DL streamsDL.O: 倒流水溝對照區(qū),Dao Liushui Open；DL.S: 倒流水溝遮光區(qū),Dao Liushui Shaded；DL.ON: 倒流水溝營養(yǎng)區(qū),Dao Liushui Open and Nutrient；DL.SN: 倒流水溝遮光營養(yǎng)區(qū),Dao Liushui Shaded and Nutrient;DH.O: 東河對照區(qū),Dong He Open；DH.S: 東河遮光區(qū),Dong He Shaded；DH.ON: 東河營養(yǎng)區(qū),Dong He Open and Nutrient；DH.SN：東河遮光營養(yǎng)區(qū),Dong He Shaded and Nutrient

對東河與倒流水溝采用營養(yǎng)添加、河面遮蓋、營養(yǎng)添加且河面遮蓋這3種處理后,河流沉積物反硝化微生物的群落產生了較為明顯的變化。相比于對照區(qū)的樣點,3種處理點的細菌在沉積物中所有nirS型細菌的總相對豐度均有變化,在河面遮蓋點的降幅約為14.29%±1.21%,在營養(yǎng)添加點的降幅約為9.22%±0.83%,在營養(yǎng)添加且河面遮蓋的點降幅為10.66%±0.98%。此外,細菌的物種組成和各物種豐度也發(fā)生了相應的改變。在東河及其倒流水溝的沉積物中,優(yōu)勢屬均為脫氯單胞桿菌屬,在各支流沉積物反硝化細菌中的相對豐度在19.46%—74.99%之間。3種處理方式均降低了脫氯單胞桿菌在沉積物中nirS型反硝化細菌里的相對豐度。將3種處理點和控制點對比,河面遮蓋的處理非常顯著(P<0.001)增加了假單胞菌屬的物種數量和相對豐度,顯著(P<0.05)降低了固氮螺菌屬和脫氯單胞桿菌屬的物種數量和物種豐度；營養(yǎng)添加的處理非常顯著(P<0.001)增加了假單胞菌的物種豐度,顯著(P<0.05)降低了脫氯單胞桿菌的物種豐度。

根據所有樣品在綱水平的物種注釋及豐度信息繪制熱圖,對樣品進行聚類分析。圖5中橫向為樣品信息,縱向為物種注釋信息,圖中左側的聚類樹為物種聚類樹,上方的聚類樹為樣品聚類樹,中間熱圖對應的值為每一行物種相對豐度經過標準化處理后得到的標準化值(http://en.wikipedia.org/wiki/Standard_score),即,一個樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標準差所得到的值。黃色柱形高度代表標準化值相對大小。在此豐度聚類分析中,東河的控制區(qū)域(DH.O)和營養(yǎng)添加區(qū)域(DH.ON)沉積物反硝化細菌聚為一類,河面遮蓋區(qū)(DH.S)與營養(yǎng)添加且河面遮蓋區(qū)域(DH.SN)分屬兩類；倒流水溝的控制區(qū)域(DL.O)和營養(yǎng)添加區(qū)域(DL.ON)沉積物反硝化細菌聚為一類,河面遮蓋區(qū)(DL.S)與營養(yǎng)添加且河面遮蓋區(qū)域(DL.SN)聚為一類。

2.4 沉積物反硝化細菌nirS基因多樣性分析

表5第二列為反硝化細菌群落OTU種類劃分,可以看出倒流水溝(DL)各處理狀態(tài)下沉積物的劃分的OTU種類均低于同處理狀態(tài)下的東河(DH)各區(qū)域。本次實驗樣品文庫覆蓋率均達到78%以上,說明能夠較為真實的反映出測序結果的真實情況。在倒流水溝的四個處理中,控制區(qū)域的沉積物反硝化細菌的Chao指數最大,即物種多樣性最大,營養(yǎng)添加區(qū)域Chao指數最小,即物種多樣性最小；在東河的4個處理中,控制區(qū)域的沉積物反硝化細菌物種多樣性最大,營養(yǎng)添加區(qū)域物種多樣性最小。

3 討論

表5東河與倒流水溝各處理區(qū)沉積物nirS基因型反硝化細菌的OTU種類、Chao指數和覆蓋率

Table5OTUs,ChaoindexandcoverageofdenitrifyingbacteriabyencodingnirSgeneinsedimentsfromallsegmentsinDHandDLstreams

處理TreatmentOTU種類OTUs Chao指數Chao Index 文庫覆蓋度 Coverage/% 處理TreatmentOTU種類OTUs Chao指數Chao Index 文庫覆蓋度 Coverage/%DL.O589713.5679.38DH.O9341107.3188.27DL.S649680.5485.39DH.S814936.3193.46DL.ON505524.588.28DH.ON655728.2387.80DL.SN594632.0178.05DH.SN845920.8790.96

DL.O: 倒流水溝對照區(qū),Dao Liushui Open；DL.S: 倒流水溝遮光區(qū),Dao Liushui Shaded；DL.ON: 倒流水溝營養(yǎng)區(qū),Dao Liushui Open and Nutrient；DL.SN: 倒流水溝遮光營養(yǎng)區(qū),Dao Liushui Shaded and Nutrient;DH.O: 東河對照區(qū),Dong He Open；DH.S: 東河遮光區(qū),Dong He Shaded；DH.ON: 東河營養(yǎng)區(qū),Dong He Open and Nutrient；DH.SN: 東河遮光營養(yǎng)區(qū),Dong He Shaded and Nutrient

森林溪流沉積物中可檢測出的10個主要nirS型反硝化細菌屬中,好氧反硝化細菌的相對豐度對水體溶解氧變化的響應十分顯著。假單胞菌屬和凍膠菌屬是好氧反硝化細菌,其反硝化能力受環(huán)境中溶解氧的限制較少。在人工培養(yǎng)環(huán)境下,一種假單胞菌屬的菌株(StutzeriSU2)即使在濃度達到92%的O2氛圍中,也能在92 h的培養(yǎng)后,實現99.24%的硝態(tài)氮去除率[18]。在本次控制實驗的四種處理區(qū)域中,營養(yǎng)區(qū)緩釋肥的加入導致水體溶解氧含量的上升,同時營養(yǎng)區(qū)的假單胞菌屬和凍膠菌屬的相對豐度均顯著的高于對照區(qū)；遮光處理抑制了水體中光合作用的進行,使得遮蓋區(qū)溶解氧含量較對照區(qū)降低,同時假單胞菌屬和凍膠菌屬的相對豐度在遮光區(qū)也顯著低于對照區(qū)。因此,在實驗區(qū)溪流水體中較高的溶解氧含量促進了沉積物中好氧反硝化細菌的廣泛分布。此外,兼性異養(yǎng)反硝化細菌也會受到溪流水體中溶解氧升高的影響。Beta變形菌綱的紅長命菌屬是兼性異養(yǎng)細菌,它在實驗區(qū)溪流沉積物樣品中的相對豐度僅次于脫氯單胞桿菌屬。紅長命菌可以利用無機氮氧化物進行光合作用,但它不可直接利用硝酸鹽,只能將亞硝酸鹽還原成N2,因此紅長命菌只能在厭氧和低氧條件下進行反硝化作用[19]。在營養(yǎng)添加和遮光這兩種單獨處理下的沉積物中,紅長命菌屬的相對豐度均顯著高于對照區(qū),但遮光且營養(yǎng)區(qū)的紅長命菌屬的相對豐度與對照區(qū)比不具備顯著性,說明遮光和營養(yǎng)添加增加紅長命菌屬的相對豐度的效應不會累加。

反硝化細菌的除磷效應會影響反硝化細菌對水體營養(yǎng)荷載的響應方式。好氧反硝化細菌在進行反硝化時,一般還具有除磷的作用。實驗區(qū)沉積物內檢測出的10種主要nirS型反硝化細菌廣泛具有除磷效應。除好氧細菌(假單胞菌屬和凍膠菌屬)以外,Beta變形菌綱紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)中的脫氯單胞桿菌屬和固氮螺菌屬也具有除磷的作用,是工業(yè)除磷活性污泥中常用的兼性反硝化除磷菌[20]。紅環(huán)菌目的各類細菌普遍具有除磷作用,是水污染處理中脫磷除氮系統(tǒng)的主要菌種之一,且對無機磷營養(yǎng)的添加有正向響應,研究結果表示磷礦石的添加會促進紅環(huán)菌目細菌優(yōu)勢菌群的數量,從而提高水體硝酸鹽的去除效果[21]。然而一些研究也表明,活性污泥系統(tǒng)中的好氧反硝化菌對磷營養(yǎng)鹽增加的響應不明顯,而污泥中的溶解氧含量、碳源含量和碳源種類均顯著影響除磷效果,但對反硝化細菌除磷作用的影響機制較為復雜,不同種類的細菌在不同溶氧環(huán)境下對各類有機碳源會選擇性吸收[22-24]。脫氯單胞桿菌屬在實驗區(qū)沉積物中是相對豐度最高的是優(yōu)勢菌屬。在四種處理區(qū)域內,無機營養(yǎng)鹽的添加處理對脫氯單胞桿菌的豐度無顯著影響,遮光處理卻顯著降低了脫氯單胞桿菌的豐度。遮光后水體溶解氧減少,藻類和光合細菌的化能合成受阻,水體有機碳含量減少,這驗證了溶解氧和有機碳的變化會對除磷菌的反硝化作用有影響。

在不同環(huán)境下反硝化細菌群落結構的差異很大,因此在不同自然環(huán)境下,營養(yǎng)添加處理會對反硝化微生物群落和物種多樣性產生不同的影響。例如在水稻種植土壤中,nirS型反硝化細菌對僅僅施加無機營養(yǎng)的反應不顯著,而有機營養(yǎng)和無機營養(yǎng)同時施加比僅僅添加有機營養(yǎng)更能夠顯著提高反硝化細菌的種群豐度[25-27]。在控制實驗中施加NPK為主成分的緩釋肥,極顯著地降低了沉積物中優(yōu)勢菌屬(脫氯單胞桿菌屬)的相對豐度,增加了假單胞菌屬的相對豐度,且促進了沉積物反硝化活性。

營養(yǎng)添加和遮光處理對河流沉積物反硝化細菌的影響有助于理解不同土地利用類型的河岸帶反硝化作用的差異。研究發(fā)現,農田和草地河岸帶土壤中的反硝化酶活性低于林地河岸帶,主要是因為農田和草地河岸帶上的人類活動更頻繁,促進了土壤中的全氮和有機碳的損失[28]。雖然河口濕地潮灘有機碳源充足,而有植被覆蓋的潮灘土壤反硝化活性大于無植被覆蓋區(qū)域[29]。由此可見,河岸帶覆蓋植被的差異對沉積物反硝化過程影響的途徑之一是改變環(huán)境中的可利用的碳源和氮源。

控制實驗中光照條件的變化也會影響水體沉積物中反硝化細菌可利用的氮源和碳源。光能自養(yǎng)生物膜是指在陸地和水生環(huán)境表面形成的由光能驅動的微生物群落,其中,富氧光養(yǎng)微生物(如底棲硅藻、藍藻和底棲綠藻)進行光合作用產生能量,為生物膜上的異養(yǎng)微生物提供有機碳和氧[30]。生物膜上好氧的硝化細菌利用產生的有機碳和氧將水體里的氨態(tài)氮轉化為硝酸鹽,為反硝化細菌提供了可用無機氮。當光照不充足時(遮光處理或者夜間),生物膜內缺氧,厭氧或兼性厭氧的反硝化細菌利用生物膜內產生的有機碳和硝酸鹽,進行反硝化作用[31]。當光照強度升高,光能自養(yǎng)生物膜上合成的有機碳很快被同系統(tǒng)的異養(yǎng)反硝化細菌利用,反硝化效率增高[32]。遮蓋處理極大降低光照強度,光合作用的缺乏導致生物膜內層出現相對缺氧的狀態(tài),好氧菌的反硝化作用被抑制,僅厭氧菌或兼性菌具有反硝化能力。若長期缺乏光照,初級生產者藻類的光合作用降低,從而合成有機碳的減少,異養(yǎng)菌和兼性菌的反硝化能力也會隨之下降。因此,在控制實驗中,2個月的遮光處理導致水體中藻類和光合細菌化能合成作用能力下降,溶解氧的缺乏抑制了好氧反硝化細菌的活性,有機碳的缺乏抑制了異養(yǎng)和兼性厭氧反硝化細菌的生長,造成了遮光處理下沉積物反硝化活性的顯著降低。而在營養(yǎng)添加且遮光(SN)區(qū),添加的營養(yǎng)鹽緩解了河水中長期缺乏營養(yǎng)的狀況,因而沉積物的反硝化能力恢復,與控制區(qū)無顯著差異。

4 結論

(1)營養(yǎng)添加和河面遮蓋對選取的6條實驗河流中沉積物的反硝化活性產生了相似的影響：營養(yǎng)添加處理會增加沉積物的反硝化活性,遮蓋處理會降低沉積物的反硝化活性。

(2)在東河與倒流水溝各處理區(qū)域的沉積物樣品中,優(yōu)勢屬均為脫氯單胞桿菌屬。河面遮蓋和營養(yǎng)添加這兩種處理方式均降低了脫氯單胞桿菌屬的相對豐度。河面遮蓋的處理顯著提高了假單胞菌屬的物種數量和相對豐度,固氮螺菌屬和脫氯單胞菌的物種數量和物種豐度顯著減少；營養(yǎng)添加的處理后,假單胞菌屬的相對豐度與物種數量顯著增加,脫氯單胞桿菌的相對豐度顯著減少。

(3)在東河與倒流水溝各處理區(qū)域中,NPK營養(yǎng)的添加和河面遮蓋均降低了nirS型反硝化細菌的物種多樣性,營養(yǎng)添加處理后的河流沉積物中nirS型反硝化細菌的物種多樣性是各處理區(qū)域中最低的。