漆永紅， 曹素芳， 李雪萍， 李敏權(quán)*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所， 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所， 甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

青稞(Hordeumvulgare‘nudum’)莖基腐病是青稞苗期和成株期生長中的一種主要病害之一。苗期田間地上癥狀主要表現(xiàn)為，有明顯的發(fā)病中心、植株長勢弱、不同程度發(fā)黃或萎蔫，嚴重時會出現(xiàn)缺埂斷壟、禿斑和整株死亡，根及莖基部變褐縊縮或腐爛等；成株期植株感染莖基腐病后表現(xiàn)為穗白、粒癟、莖桿發(fā)褐或黑紅、根及莖基部縊縮發(fā)干或腐爛等[1]。該病害病原菌主要有燕麥鐮孢菌(Fusariumavenaceum)、木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)、銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum)、柔毛鐮孢菌(Fusariumflocciferum)和Fusariumlangsethiae等，其中燕麥鐮孢菌為優(yōu)勢病原菌[1]。青稞莖基腐病田間癥狀表現(xiàn)多樣，其癥狀常因環(huán)境條件、發(fā)病階段、寄主與品種及生育時期的不同而呈現(xiàn)較大變化。當田間癥狀不典型或診斷者經(jīng)驗不足時，僅依據(jù)田間病害癥狀有時不易準確判別。因此，建立快速、準確檢測青稞莖基腐病菌的方法對及時有效的控制該病害有重要的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Mori等[2]研發(fā)的一種新型核酸擴增方法，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，在鏈置換DNA酶(Bst DNA polymerase)作用下，60～65℃恒溫擴增，30～80 min能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴增至109個[3]。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀以及凝膠電泳儀進行檢測，還可以通過SYBR Green I、鈣黃綠素和羥基萘酚藍等[4-5]染色后用肉眼觀察顏色變化來判斷。LAMP檢測具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、產(chǎn)物易檢測等特點，廣泛應(yīng)用于真菌、細菌、病毒、線蟲等病原微生物的檢測[6-12]，已成功建立了假禾谷鐮孢菌[13]、大麗輪枝菌[14]、番石榴焦腐病[15]等檢測技術(shù)，關(guān)于青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP檢測方法未見報道。因此，本試驗以燕麥鐮孢菌為目標菌，建立以熒光染料SYBR Green I為指示劑的LAMP檢測技術(shù)用于青稞莖基腐病菌的快速檢測，為燕麥鐮孢菌的檢測及其青稞莖基腐病的診斷提供一種新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青稞莖基腐病病株(圖1)采自甘肅省甘南州臨潭縣，同時采集發(fā)病根際周圍土樣，室內(nèi)分離病原菌，保存于本研究室。

圖1 青稞莖基腐病Fig.1 Naked barley crown rot disease

主要試劑：Bst2.0 DNA聚合酶、熒光染料SYBR Green I、MgSO4、dNTP等，購自天根生物科技有限公司。

1.2 菌株培養(yǎng)和基因組DNA提取

菌株用常規(guī)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)?；蚪MDNA提取采用E. Z. N. ATM. HP Fungal DNA Kit試劑盒(OMEGA Bio-tek)的具體步驟進行。

1.3 病原菌ITS序列的擴增及LAMP引物的設(shè)計

對青稞莖基腐病菌ITS序列進行擴增(94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸80 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存)、PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收、測序(北京天一輝遠生物科技有限公司)，獲得其病菌燕麥鐮孢菌的ITS序列。應(yīng)用LAMP設(shè)計軟件primer software PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.Html;Eiken Chemical Co.,Japan)進行引物設(shè)計，包括2條外引物F3和B3，2條內(nèi)引物FIP、BIP(表1)。

表1 設(shè)計的LAMP引物序列Table 1 Necleotide sequences of LAMP primers

1.4 LAMP反應(yīng)體系的建立

在60～65℃范圍內(nèi)對反應(yīng)溫度進行梯度實驗，反應(yīng)時間1 h，以確定LAMP引物的最佳反應(yīng)溫度。優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系：10×Isothermal Amplification Buffe (1～3 μL)，100 m M MgSO4(0.5～2) μL，F(xiàn)IP Primer (0.5～1.5) μL，BIP Primer (0.5～1.5) μL，F(xiàn)3 Primer (0.5～1.5) μL，B3 Primer (0.5～1.5) μL，10 mM dNTP (2.0～4.0) μL，模板DNA (2.0～4.0) μL，8 000 U·mL-1的Bst2.0 DNA聚合酶(0.5～1.5) μL，加ddH2O (8.0～11.0) μL至總25 μL體系。試驗重復(fù)3次。

1.5 擴增結(jié)果判斷方法

反應(yīng)結(jié)束后取3 μL產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若出現(xiàn)連續(xù)階梯狀條帶，則判定為陽性；未出現(xiàn)條帶，則判定為陰性。同時加入0.5 μL熒光染料SYBR Green I，通過肉眼觀察LAMP反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變化來判斷結(jié)果，陽性反應(yīng)為黃綠色，陰性反應(yīng)為橘色。

1.6 燕麥鐮孢菌LAMP檢測體系的特異性驗證

選擇7個不同地區(qū)來源(表2)的燕麥鐮孢菌菌株DNA作為模板，同時以ddH2O替代目標菌的DNA模板為陰性對照，以燕麥鐮孢菌相近種尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporium)和其他3個非鐮孢菌(Phytophthorainfestans、Botrytiscinerea、Rhizoctoniasolani)的基因組DNA為模板作為對照，進行LAMP反應(yīng)，觀察反應(yīng)管顏色變化和2%瓊脂糖凝膠電泳是否出現(xiàn)階梯狀條帶來判定結(jié)果，試驗重復(fù)3次。

表2 青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌菌株及其來源Table 2 Fusarium avenaceum causing naked barley crown rot disease and their locality

1.7 燕麥鐮孢菌LAMP檢測體系的靈敏度驗證

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌DNA進行梯度稀釋，使其質(zhì)量濃度梯度依次為100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1，分別取2 μL作為模板進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后觀察反應(yīng)管顏色變化和2%瓊脂糖凝膠電泳是否出現(xiàn)階梯狀條帶來判定結(jié)果。試驗重復(fù)3次。

1.8 田間發(fā)病組織中燕麥鐮孢菌的檢測

供試24份青稞莖基腐病疑似病害樣本采自甘肅省甘南州卓尼縣和臨潭縣，每份樣品取200 mg病組織，按照E. Z. N. ATM. HP Fungal DNA Kit試劑盒說明書提取發(fā)病組織DNA，將其作為模板進行LAMP擴增，以燕麥鐮孢菌純DNA作為陽性對照，滅菌水作為陰性對照。

1.9 土壤中燕麥鐮孢菌檢測的靈敏度

在燕麥鐮孢菌平板中加5 mL無菌水，輕輕刮下鐮孢菌的孢子，制備孢子懸浮液。取每份不含燕麥鐮孢菌的土樣(該土樣經(jīng)燕麥鐮孢菌LAMP檢測呈陰性) 1 g，放入2 mL的EP管中，分別添加不同數(shù)量的孢子(40 000、4 000、400、40、4個)。按照E. Z. N. ATM. HP Fungal DNA Kit提取試劑盒說明書提取土壤樣品總DNA，將其作為模板進行LAMP擴增，并以燕麥鐮孢菌純DNA作為陽性對照，滅菌水作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立

優(yōu)化后用于檢測青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌的LAMP最佳反應(yīng)體系25 μL：10×Isothermal Amplification Buffe 2.5 μL，100 mM MgSO41.5 μL，F(xiàn)IP Primer 1 μL，BIP Primer 1 μL，F(xiàn)3 Primer 1 μL，B3 Primer 1 μL，10 mM dNTP 3.5 μL，模板DNA 2.5 μL，8 000 U·mL-1的Bst2.0 DNA聚合酶1 μL，ddH2O 10 μL。通過反應(yīng)溫度進行優(yōu)化，確定LAMP引物最佳反應(yīng)溫度為65℃。反應(yīng)程序為：65℃ 1 h，80℃ 20 min。肉眼觀察燕麥鐮孢菌LAMP反應(yīng)液陽性為黃綠色，而對照產(chǎn)物為橘色，呈陰性(圖2A)。2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，陽性出現(xiàn)連續(xù)階梯狀條帶，而陰性未出現(xiàn)條帶(圖2B)。

圖2 燕麥鐮孢菌LAMP反應(yīng)體系的建立Fig.2 The detection of F. avenaceum by LAMP注：(A)LAMP反應(yīng)體系顏色變化；(B)2%瓊脂糖凝膠電泳(1：燕麥鐮孢菌；2：陰性對照)Note：(A) The specificity of LAMP for F. avenaceum was detected by SYBR Green I;(B) 2.0% agarose gel electrophoresis. Lane M:DL 2 000 DNA marker;Lane 1:F. avenaceum;Lane 2:Negative control.

2.2 特異性檢測

7個不同地理來源的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP檢測均顯示黃綠色，而陰性對照(CK)和其它 4個病原菌LAMP檢測均顯示橘色(圖3A)。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，陽性均出現(xiàn)梯度條帶，陰性對照和其它4個病原菌則沒有出現(xiàn)任何條帶(圖3B)。以上結(jié)果表明，該LAMP引物能夠特異性的檢測不同地理來源的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌。

圖3 燕麥鐮孢菌LAMP特異性檢測Fig.3 Specificity of LAMP detection for different F. avenaceum strains

2.3 靈敏度驗證

以10 pg為模板時，反應(yīng)產(chǎn)物仍然可顯示黃綠色(圖4A)，說明該LAMP反應(yīng)體系可以檢測到10 pg的燕麥鐮孢菌DNA。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，100 ng～10 pg模板DNA均可出現(xiàn)梯度條帶，而對照ddH2O模板未出現(xiàn)條帶(圖4B)。

圖4 燕麥鐮孢菌LAMP靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity of LAMP assay to detect serially diluted genomic DNA from 100 ng to 10 pg with F. avenaceum

2.4 田間發(fā)病組織中燕麥鐮孢菌的檢測

20份甘肅省甘南州卓尼縣和臨潭縣青稞莖基腐病疑似病害樣本提取的DNA檢測發(fā)現(xiàn)，13份為陽性，其中卓尼縣5份(圖5)，臨潭縣8份(圖6)。同時對陽性的樣本進行組織分離，分離獲得的菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS測序鑒定為燕麥鐮孢菌。以上結(jié)果表明，該技術(shù)能夠排除寄主植物及其他非目標菌的干擾，快速、準確地從青稞發(fā)病組織中檢測出燕麥鐮孢菌。LAMP檢測技術(shù)用于燕麥鐮孢菌的檢測和青稞莖基腐病的快速診斷。

圖5 甘肅省甘南州卓尼縣青稞莖基腐病LAMP檢測Fig.5 LAMP assay for diseased naked barley from Zhuoni county注：1～10：發(fā)病樣品；11：陽性對照；12：陰性對照，下同Note：Tuber 1-10:Diseased naked barley samples;Tuber 11:Positive control;Tuber 12:Negative control,the same as below

圖6 甘肅省甘南州臨潭縣青稞莖基腐病LAMP檢測Fig.6 LAMP assay for diseased naked barley from Lintan county

2.5 土壤中燕麥鐮孢菌的檢測靈敏度

圖7表明，1號陽性對照，2～5號燕麥鐮孢菌40 000、4 000、400、40個孢子懸浮液LAMP檢測均呈黃綠色的陽性反應(yīng)，表明LAMP技術(shù)在每克土壤中檢測的靈敏度為40個燕麥鐮孢菌孢子。5號燕麥鐮孢菌4個孢子懸浮液LAMP檢測呈橘色的陰性反應(yīng)，表明LAMP檢測對土壤中4個燕麥鐮孢菌孢子懸浮液未檢測到，6號陰性對照呈現(xiàn)橘色。本方法可用于土壤中攜帶燕麥鐮孢菌的高靈敏度檢測。

圖7 土壤中燕麥鐮孢菌的檢測Fig.7 Sensitivity of the LAMP assay in soil containing different number of spores注：1號：陽性對照；2～6號：40 000、4 000、400、40、4個孢子懸浮液；7號：陰性對照Note：Tuber 1:Positive control;Tuber 2-6:Soil with different amount of spores 40 000,4 000,400,40 and 4,respectively;Tuber7:Negative control

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以ITS為靶標的普通PCR分子檢測[16]、RAPD-PCR方法[17]、巢式PCR技術(shù)[18,19]、實時定量RT-PCR技術(shù)[20-21]、IGS-PCR[22]等用于不同病原菌的檢測，但這些檢測方法需要的檢測時間較長，準確性和靈敏度偏低。本試驗以熒光染料SYBR Green I為指示劑，首次建立了青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP快速檢測方法，本方法的建立與應(yīng)用為燕麥鐮孢菌的檢測及其青稞莖基腐病的診斷提供一種新的技術(shù)。

LAMP技術(shù)已成功用于尖孢鐮孢菌[23]、木賊鐮孢菌和禾谷鐮孢菌[24]等多種植物病原菌的檢測。紀睿等[25]利用LAMP技術(shù)檢測雪松疫霉根腐病菌(Phytophthoralateralis)，在靈敏度檢測中，最低檢測限為 100 pg·μL-1。張吉紅等[26]采用LAMP建立了煙草環(huán)斑病毒檢測法，60℃擴增60 min，整個檢測過程約1.5 h。本試驗首次利用LAMP技術(shù)進行了燕麥鐮孢菌的檢測。與PCR技術(shù)相比，本試驗中LAMP檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點：(1)引物特異性強。在LAMP體系中，4條引物特異性識別靶標基因的6個區(qū)域，而在PCR體系中只有2條引物識別2個區(qū)域。本試驗應(yīng)用LAMP設(shè)計軟件設(shè)計4條引物，包括2條外引物F3、B3和2條內(nèi)引物FIP、BIP，7個不同地理來源的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP檢測均呈黃綠色(陽性)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測均出現(xiàn)梯度條帶，而對照和其他病原菌均呈橘色(陰性)，電泳檢測沒有條帶。(2)檢測靈敏度高。LAMP技術(shù)檢測靈敏度比普通PCR技術(shù)高10～1000倍。本試驗靈敏度驗證結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)液檢測靈敏度在DNA水平達到10 pg，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，100 ng～10 pg的模板DNA均出現(xiàn)梯度條帶。(3)反應(yīng)速度快。PCR一般需要3～6 h，本試驗優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系最佳反應(yīng)程序為65℃ 1 h，80℃ 20 min。(4)直接用肉眼觀察結(jié)果。本試驗LAMP技術(shù)在反應(yīng)完成后加入熒光染料SYBR Green I，通過肉眼觀察LAMP反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變化來判斷結(jié)果，陽性反應(yīng)為黃綠色，陰性反應(yīng)為橘色。(5)準確性高。本試驗中，擴增產(chǎn)物的陰陽性，加入熒光染料SYBR Green I顏色變化檢測的結(jié)果和凝膠電泳是否出現(xiàn)梯度條帶完全吻合。(6)不易污染。熒光染料SYBR Green I可以在LAMP反應(yīng)前加入到反應(yīng)液中，可以有效避免反應(yīng)后開蓋加入熒光染料造成的污染問題。

本試驗LAMP技術(shù)對疑似病害樣本提取的DNA進行檢測，只需要提取青稞發(fā)病部位的總DNA就可以檢測到燕麥鐮孢菌的有無，該技術(shù)能夠檢測出青稞發(fā)病組織中的燕麥鐮孢菌，排除了病害樣本上含有多種微生物，手工不易分離純化到目標菌的人為因素影響。另外，本試驗LAMP技術(shù)在土壤中檢測的靈敏度為每克土壤40個燕麥鐮孢菌孢子，土壤檢測靈敏度很高。與普通PCR相比，本試驗在燕麥鐮孢菌ITS特異序列基礎(chǔ)上建立了青稞莖基腐病菌LAMP簡便、靈敏、快速和準確的方法，為生產(chǎn)上青稞莖基腐病診斷和防治提供重要的實用價值。

本試驗僅對引起青稞莖基腐病的優(yōu)勢病原菌燕麥鐮孢菌進行了LAMP快速檢測，然而在實際生產(chǎn)中，引起青稞莖基腐病的病原菌種類很多，為了全面、系統(tǒng)、準確檢測青稞莖基腐病的病原菌，在今后的研究中應(yīng)該建立多重病原菌LAMP快速分子檢測技術(shù)。

4 結(jié)論

首次建立了青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP快速檢測技術(shù)，最佳反應(yīng)溫度為65℃，LAMP反應(yīng)液檢測靈敏度在DNA水平達到10 pg·μL-1，土壤靈敏度檢測為每克土壤40個燕麥鐮孢菌孢子。本方法的建立與應(yīng)用為燕麥鐮孢菌的檢測及其青稞莖基腐病的診斷提供了一種新技術(shù)。