林 峰， 肖月娥, 周翔宇， 唐 穎， 高步紅

(1. 南京林業(yè)大學(xué)，江蘇南京210037； 2. 上海植物園，上海200231； 3. 上海辰山植物園，上海201602)

核基因組大小是指單套染色體組的DNA含量，C值指生物體不復(fù)制的單倍體細(xì)胞核(無論倍性水平)的DNA總含量。Greilhuber和Bennett[1]為了區(qū)分與理解兩者的關(guān)系，提出了“1C值”、“1CX值”的概念，分別對應(yīng)整倍體和一倍體的基因組大小。對于二倍體生物，1C=1CX；對于多倍體，1C>1CX。基因組大小對許多研究領(lǐng)域至關(guān)重要，包括研究植物的分類、進(jìn)化、規(guī)劃基因組測序等方面[2]。測定基因組大小的方法主要有3種：基因組測序法、孚耳根微顯影(Feulgen microdensitometry)以及流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)，F(xiàn)CM因方便、快速、可靠而成為首選方法。該法的樣品制備通常只需要幾分鐘，不需要昂貴的試劑，分析速度快，即測即得，在以往研究中被廣泛應(yīng)用[3]。

鳶尾屬(IrisL.)屬鳶尾科(Iridaceae)，也是鳶尾科中最大和最復(fù)雜的屬。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前已知的鳶尾屬植物共計(jì)300余種。鳶尾屬植物生長的氣候帶以北溫帶為主，分布區(qū)域集中在亞洲、歐洲及北美洲。我國也是鳶尾屬植物的分布中心之一，已知的種有64個(gè)，變種13個(gè)，此外還有1個(gè)亞種和6個(gè)變型主要分布于西南、西北和東北。該屬植物具有廣泛的生物活性，包括抗炎類豐富，抗氧化劑和癌癥化療防護(hù)性能。據(jù)報(bào)道，鳶尾屬大約有二百多個(gè)化合物，其中包括黃酮、異黃酮及其苷類、萜類和芪苷類。目前，該屬植物在國內(nèi)外已被廣泛研究和應(yīng)用。研究內(nèi)容包括分類[4]、育種[5]、生理[6]、生化[7]、種質(zhì)資源[8]等各個(gè)方面。

根據(jù)DNAC值庫(http://data.kew.org/cvalues)[9]查詢，國外已報(bào)道了38份、共計(jì)35種鳶尾草植物C值的檢測結(jié)果，占該屬6%，國內(nèi)尚無鳶尾屬相關(guān)檢測的報(bào)道。本研究以25 份鳶尾屬嫩葉材料為基礎(chǔ)，利用流式檢測手段對其進(jìn)行基因組大小檢測，旨在為鳶尾屬的基因組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和種質(zhì)資源研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1待測樣品與標(biāo)樣 內(nèi)標(biāo)玉米(Zeamays‘CE-777’)、番茄(LycopersiconesculentumL. ‘Stupicke polni tyckove rane’)由捷克共和國科學(xué)院植物研究所分子細(xì)胞遺傳學(xué)與細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)室的Dolezel教授惠贈(zèng)，與25份鳶尾一同在上海辰山植物園科研苗圃栽培。本試驗(yàn)均使用播種后1～3個(gè)月的嫩葉為材料。

1.1.2儀器與試劑 流式細(xì)胞儀型號為Influx (美國BD公司)；濾網(wǎng)、熒光染料、鞘液、培養(yǎng)皿、試劑均購自南京博巧生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1解離液與熒光染料配置 選用LB01為解離液，其配方為(15 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA Na2，0.5 mmol·L-1四鹽酸精胺，80 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1NaCl，0.1%(v/v)TritonX-100，pH=7.0～8.0)。碘化丙啶(propidium iodide,PI) 配置至終濃度為50 μg·mL-1，藥品均于4℃冰箱保存。

1.2.2細(xì)胞核懸液制備與DNA特異性染色 向塑料培養(yǎng)皿中加入1 mL(LB01)解離液，先放入1.5 g左右的樣品嫩葉，再放入0.5 g左右的番茄嫩葉(或玉米嫩葉1.5 g左右)，用鋒利的刀片快速切碎，將培養(yǎng)皿擺成斜面，使液體和切碎的材料流至皿底半弧側(cè)，用槍頭輕吸打液體，吸取培養(yǎng)皿中的解離液(棄去碎材料)于1.5 mL EP管，用400目濾網(wǎng)過濾，并置于冰中孵育5 min。離心：轉(zhuǎn)速1 100 r·min-1，溫度4℃，時(shí)間5 min。吸除上清液，再加入150 μL冰解離液。在250 μL解離液中加入0.5 μL PI儲(chǔ)備液，使終濃度達(dá)100 μg·mL-1，再加入終濃度為10 μg·mL-1的RNase，避光，在冰箱孵育3～5 min。上機(jī)檢測：低速(上樣速度約500～1 000個(gè)顆?！っ?1)、收集10 000個(gè)顆粒。

1.2.3確定對照與處理熒光強(qiáng)度大致范圍 采用番茄、玉米作為內(nèi)標(biāo)，在上機(jī)檢測中，先分別以兩種內(nèi)標(biāo)單獨(dú)上機(jī)檢測，初步確定內(nèi)標(biāo)的相對熒光強(qiáng)度范圍，保存檢測模板，在同一檢測模板下，隨機(jī)選取三個(gè)鳶尾，確定其相對熒光強(qiáng)度范圍，作下記錄，結(jié)合機(jī)器的調(diào)節(jié)條件及便于識(shí)別，本試驗(yàn)所有的內(nèi)標(biāo)峰均為P1峰，樣品峰為P2峰(如圖1、圖2)。

1.2.4兩種內(nèi)標(biāo)的采用 由于樣品與內(nèi)標(biāo)的C值大小相差太小或者太大，將造成峰形的重疊或者無法同時(shí)呈現(xiàn)在一張圖上，25份鳶尾均分別采用了番茄、玉米嫩葉為內(nèi)標(biāo)，其中13種鳶尾采用番茄、9種鳶尾采用玉米為內(nèi)標(biāo)，其余3種則分別采用上述兩種嫩葉內(nèi)標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

熒光染料PI的激發(fā)波長為488 nm，收集通道為FL2(670±30 nm)、檢測PI的發(fā)射熒光強(qiáng)度。變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)控制在5%以內(nèi)。使用BD Influx自帶軟件FACSTM Sortware 1.0.0.650 進(jìn)行分析。番茄1C基因組大小為958 Mbp[10]，玉米1C基因組大小為2 655 Mbp[11]，根據(jù)公式[12]：待測樣本的細(xì)胞核DNA含量(=對照樣本細(xì)胞核DNA含量×(待測樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度/對照樣本G0/G1峰熒光強(qiáng)度)。每個(gè)樣本做3～6次平行試驗(yàn)，選取CV值最小的3次結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，使用SPSS 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組C值的分析

如圖1所示，P1峰代表番茄的相對熒光強(qiáng)度，P2分別代表樣品的相對熒光強(qiáng)度：編號1A～1F的直方圖中，P2峰分別代表：華夏鳶尾2 (Iriscathayensis)、野鳶尾(白花)(I.dichotoma)、喜鹽鳶尾(I.halophila)、扇形鳶尾(I.wattii)、鳶尾7(I.tectorum)、鳶尾6(I.tectorum)。如圖2所示，PI峰代表玉米的相對熒光強(qiáng)度，P2分別代表樣品的相對熒光強(qiáng)度：編號2A～2F的直方圖中，P2峰分別代表：扇形鳶尾(I.wattii)、鳶尾7(I.tectorum)、鳶尾6(I.tectorum)、馬藺(I.lactea)、膜苞鳶尾1(I.scariosa)、鳶尾4(I.tectorum)。

圖1 番茄與6種鳶尾樣品混合樣品流式細(xì)胞儀測定結(jié)果Fig.1 Test results of Lycopersicon esculentum and Iris samples mixed samples using FCM注：P1峰：番茄內(nèi)標(biāo)；P2峰：鳶尾樣本Note:Peak1:L.esculentum;Peak2:Iris samples

圖2 玉米與6種鳶尾樣品混合樣品流式細(xì)胞儀測定結(jié)果Fig.2 Test results of Z.mays and Iris samples mixed samples using FCM注：P1峰：玉米內(nèi)標(biāo)；P2峰：鳶尾樣本Note:Peak1:Z.mays;Peak2:Iris samples

2.2 與同屬物種C值的比較

全世界鳶尾屬植物約有300種，目前僅38份共計(jì)35 種的C值被測定，1C值范圍在4.00～28.20 pg之間，其中4.00～8.00 pg的有16種，8.01～13.00 pg的有17種，大于12.00 pg的有5種，分別占已測種的42.1%、44.7%和13.2%，鳶尾種間C值差異較大。本研究計(jì)算得到的結(jié)果見表1、表2。最大的1C值為膜苞鳶尾1(6.77 pg)、最小的為小鳶尾(2.62 pg)。單因素方差分析表明，25份鳶尾材料被分成15組，組間有顯著性差異(P<0.05)，鳶尾的C值大小差異性較大，這與此前報(bào)道的同屬植物C值差異大的情況吻合。

表1 25份鳶尾屬植物的C值Table 1 Genomic C values of 25 Iris samples

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note：Different lowercase letters in same column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.3 種鳶尾采用兩種內(nèi)標(biāo)的比較

由于本次試驗(yàn)采用兩種內(nèi)標(biāo)，為了驗(yàn)證兩種內(nèi)標(biāo)的可靠性，選擇了扇形鳶尾及鳶尾 6、鳶尾 7為代表，分別以玉米與番茄作內(nèi)標(biāo)，并計(jì)算1C值大小，方差分析結(jié)果表明，用兩種內(nèi)標(biāo)測定的C值無顯著性差異(表2)，即番茄或玉米均可作為鳶尾屬植物的內(nèi)標(biāo)。

表2 兩種內(nèi)標(biāo)分別測定3種鳶尾屬植物的C值Table 2 Genomic C values of3 Iris samples by 2 different Internal standard

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different lowercase letters in same column indicate significant difference at the 0.05 level

3 討論

方差分析表明，25份鳶尾屬的DNAC值可分為15組，組間具有顯著差異，同一種鳶尾、來自不同引種地的樣品之間也存在顯著性差異；如三份華夏鳶尾，其中引種地同為南京的兩份無顯著性差異，而與引種地為山東的鳶尾有顯著性差異，1C值為3.08～3.24 pg。兩份引種地同為新疆的膜苞鳶尾1C值分別為6.20 pg、6.77 pg；兩份小花鳶尾1C值分別為6.27 pg、6.16 pg，也都具有顯著性差異。7份鳶尾的1C值變化范圍從3.80～4.26 pg不等。以上材料組間雖然有顯著性差異，但是1C值相差并不大，差距在±0.50 pg以內(nèi)。兩份野鳶尾則無顯著性差異，1C值分別為3.03 pg和3.08 pg。Hanson等[13]測試了2份萱草狀鳶尾(I.tubergeniana)，其1C值分別為9.39 pg和11.03 pg；兩份替代鳶尾(I.vicaria) 的1C值分別為8.46 pg和15.03 pg；兩份白邊鳶尾(I.albomarginata) 1C值分別為10.18 pg和18.83 pg，可見，同一種的鳶尾很可能C值大小不一?；蚪M大小的變化可能歸因于染色體片段的擴(kuò)增和缺失導(dǎo)致重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化[14]。Knight[15]等綜述了與植物DNA含量變化相關(guān)的因素，例如物種多樣性、海拔、緯度、溫度、降水、種子質(zhì)量等。本次的25份鳶尾引種自湖北、四川、北京等14個(gè)省市(自治區(qū))，引種地之間的氣候、海拔、降水等差異較大，很可能導(dǎo)致其1C值間的顯著性差異。

FCM測定基因組大小的要求一個(gè)已知的基因組參考標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(內(nèi)標(biāo))可以防止因儀器漂移或染色不均勻而導(dǎo)致的誤差[16]。本次實(shí)驗(yàn)均采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測定。在前處理過程中，若以番茄為內(nèi)標(biāo)，由于鳶尾屬的葉片比番茄硬、厚，可先切好鳶尾的葉片后再加入番茄葉片切碎，且鳶尾屬植物的葉片需要多放一些。若以玉米為內(nèi)標(biāo)則可以遵循1:1的原則，放入面積相似的葉片同時(shí)切碎即可。在上機(jī)檢測中，要關(guān)注液流變化，確保儀器一直處于在最佳狀態(tài)；可以在FSC或FL2設(shè)置閾值，盡量保持內(nèi)標(biāo)峰與樣品峰高度一致。

在檢測基因組大小的試驗(yàn)中，通常使用1種內(nèi)標(biāo)[17]，本次試驗(yàn)待測的植物樣品較多，為了使樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰不重疊、距離適中、CV值小，使用了玉米和番茄兩種內(nèi)標(biāo)，且挑選了其中的3種鳶尾屬植物，采用了雙標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，方差分析表明，用兩種內(nèi)標(biāo)分別測得的基因組DNAC值無顯著性差異，數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，單內(nèi)標(biāo)通常需要3～6次重復(fù)，而兩種內(nèi)標(biāo)只需要兩次測定即可相互驗(yàn)證，該方法可以更加高效。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)基于流式細(xì)胞儀術(shù)測得25份鳶尾屬的DNAC值，鳶尾屬植物的C值變化較大，DNA 1C值最大的為6.77 pg，最小的為2.62 pg。流式細(xì)胞術(shù)通過測定DNA含量和基因組大小，可預(yù)測該品種的未知染色體數(shù)目，從而使基因和基因組分析更有效，該技術(shù)也可為鳶尾屬植物資源的收集、鑒定、保護(hù)和育種等提供理論依據(jù)。