陶 茸， 尹國(guó)麗， 師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

根緣細(xì)胞(root border cells)又稱根冠脫落細(xì)胞(sloughed root cap cells)，指從根冠表面脫落下來并聚集在根部周圍的一群特化細(xì)胞[1]。它能夠合成并向外分泌一系列具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)，主要功能在于通過對(duì)土壤微生物的特異識(shí)別及在根系周圍建立一個(gè)穩(wěn)定平衡的根際生態(tài)系統(tǒng)，誘導(dǎo)和控制根際微生物的生長(zhǎng)，中和有毒物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)根部環(huán)境[2]。根緣細(xì)胞具有特殊的生理活性和生物學(xué)意義[3]，在調(diào)節(jié)根尖微生態(tài)系統(tǒng)-逆境脅迫中起著十分重要的作用[4-5]。根冠果膠甲基酯酶(pectin methyl esterase，PME)在根緣細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)育中有重要的作用[6]，它可以使果膠去甲基化，果膠酸分解；可誘導(dǎo)其它果膠酶基因表達(dá)，果膠層降解，最終導(dǎo)致根緣細(xì)胞從根冠分離，即根緣細(xì)胞游離是根冠PME活性表達(dá)的結(jié)果，而根緣細(xì)胞的游離與根冠PME活性有密切相關(guān)性[7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為多年生豆科牧草，具有一次種植、多年收獲、產(chǎn)草量高、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好等突出特點(diǎn)，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的重要來源，有“牧草之王”之稱[8]，紫花苜蓿植株的次生代謝成分主要有黃酮、三萜、生物堿和香豆素，大分子化合物主要為苜蓿蛋白和多糖[9]。有研究表明，種植過紫花苜蓿的土壤，由于自毒作用，連茬種植苜蓿時(shí)往往種子發(fā)育不良，很難建植成功[10]。造成紫花苜蓿自毒作用的主要次生代謝物質(zhì)是香豆素、綠原酸、香豆酸、羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸類物質(zhì)，其對(duì)多數(shù)植物種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)具有抑制作用[11]，且在苜蓿植株體內(nèi)的積累量隨著生育時(shí)期的延續(xù)不斷增加[12]。目前，盧成、李志華、榮思川等利用液相色譜法測(cè)定了紫花苜蓿植株中自毒物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)含量較高的是香豆素和咖啡酸[13-15]。王希、袁莉、柳樹權(quán)[16-19]等研究了紫花苜蓿不同種植年限、不同品種、不同部位組織的植物浸提液對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、產(chǎn)草量等方面的自毒作用，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的皂甙和刀豆氨酸，影響后續(xù)苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育，造成草產(chǎn)量遞減；同一苜蓿品種根、莖、葉浸提液的自毒效應(yīng)，葉浸提液最強(qiáng)，其次為莖浸提液，根浸提液自毒效應(yīng)最弱，不同苜蓿品種的自毒作用存在差異。蔡登高[20]指出香豆素會(huì)影響苜蓿幼苗氮代謝和氨同化的關(guān)鍵酶，導(dǎo)致體內(nèi)養(yǎng)分缺失。也有學(xué)者研究了咖啡酸、香豆素、對(duì)羥基苯甲酸等外源酚酸對(duì)萵苣(LactucasativaL.)幼苗、人參(PanaxginsengC.A.Meyer)種子萌發(fā)、三七(PanaxnotoginsengF.H.Chen)、小麥(TriticumaestivumL.)和大豆(Glycinemax)的化感效應(yīng)，揭示了咖啡酸、香豆素、對(duì)羥基苯甲酸等外源酚酸類物質(zhì)對(duì)這些植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響[21-26]。然而紫花苜蓿主要自毒物質(zhì)香豆素和咖啡酸對(duì)其根緣細(xì)胞的化感作用少見報(bào)道，本研究采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)法研究紫花苜蓿根緣細(xì)胞和根冠果膠甲基酯酶(PME)對(duì)苜蓿主要自毒物質(zhì)香豆素、咖啡酸和混合物及其濃度的響應(yīng)，以期為深入探討香豆素和咖啡酸對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)和發(fā)育影響的機(jī)理提供依據(jù)，同時(shí)也為有效緩解和解決苜蓿自毒障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苜蓿品種：‘甘農(nóng)9號(hào)’紫花苜蓿(MedicagosativaL. ‘Gannong No.9’)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，發(fā)芽率為95%；

藥劑:香豆素(C)；咖啡酸(CF)均為分析純品，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司?；旌衔?M)由香豆素、咖啡酸按 1:1比例配制。

對(duì)照：以蒸餾水處理為對(duì)照(CK)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外源添加物的配制 稱取香豆素、咖啡酸各1 g及混合物(香豆素1 g+咖啡酸1 g)分別溶于4 mL無水乙醇中，定容至1 L，配制成1 000 mg·L-1母液，放入4℃冰箱備用(分別以C，CF和M表示)。處理時(shí)將母液濃度稀釋至500 mg·L-1，50 mg·L-1，5 mg·L-1，0.5 mg·L-1詳見表1。

表1 香豆素和咖啡酸處理配比Table 1 The treatment of coumarin and caffeic acid

1.2.2苜蓿種子萌發(fā)及根緣細(xì)胞培養(yǎng) 挑選顆粒飽滿、無病斑、霉點(diǎn)和蟲害的苜蓿種子，經(jīng)75%酒精消毒3 min，用蒸餾水沖洗種子3～5次，將消毒種子播種于墊有2層濾紙和含多層無菌濕紗布的9 cm直徑培養(yǎng)皿中，于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)至種子萌動(dòng)露白。萌動(dòng)種子播種于底部鋪有兩層無菌濕紗布及一層濾紙的9 cm直徑培養(yǎng)皿，每皿播30粒，種子上面再蓋一層濾紙，然后滴加相應(yīng)濃度處理液，溶液量以上層濾紙濕潤(rùn)，傾斜時(shí)皿底無溶液聚集為宜，蒸餾水處理為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理3次重復(fù)，種子置于光周期25℃，12 h，暗周期20℃，12 h的人工氣候箱中培養(yǎng)[27]。

1.3 測(cè)定方法與指標(biāo)計(jì)算

1.3.1根伸長(zhǎng)量的測(cè)定 隨機(jī)選取剛萌動(dòng)的種子5粒/皿，測(cè)其根長(zhǎng)，即初始根長(zhǎng)，再隨機(jī)選取經(jīng)不同濃度酚酸水溶液處理并連續(xù)培養(yǎng)12 h的植株5株/皿，測(cè)其根長(zhǎng)，該根長(zhǎng)與初始根長(zhǎng)兩者之差即為根的伸長(zhǎng)量[28]。根相對(duì)伸長(zhǎng)率=處理組根伸長(zhǎng)量/對(duì)照組根相對(duì)伸長(zhǎng)量×100%。

1.3.2根緣細(xì)胞的形狀觀察和數(shù)目統(tǒng)計(jì) 從蒸餾水培養(yǎng)的苜蓿中，分別剪取根尖長(zhǎng) 2.5，5，10，15，20 mm各3條，將剪下的根尖置于滴有蒸餾水的載玻片上，輕輕晃動(dòng)載玻片，持續(xù) 40～50 s，以便充分洗脫邊緣細(xì)胞。鏡檢：觀察邊緣細(xì)胞的形狀并分別統(tǒng)計(jì)邊緣細(xì)胞的數(shù)目，每個(gè)根尖檢查5個(gè)視野。

1.3.3根緣細(xì)胞存活率測(cè)定 選取根長(zhǎng)長(zhǎng)度10 mm(根緣細(xì)胞數(shù)目最多)的植株10個(gè)，每個(gè)剪取2～3 mm根尖，分別置于潔凈的載玻片上，滴加20 μL中性紅溶液，靜置2 min讓細(xì)胞充分染色，然后擦去周圍染液、加入1滴蒸餾水，輕輕晃動(dòng)，持續(xù)40～50 s，以便根緣細(xì)胞充分洗脫下來，鏡檢(每個(gè)根尖檢查5個(gè)視野)。原生質(zhì)體被染為紅色的為活細(xì)胞，不著色的為死細(xì)胞，對(duì)兩種細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。根緣細(xì)胞存活率(survive ratio，SR) =活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%[28]。

1.3.4紫花苜蓿根冠PME酶(果膠甲基酯酶)活性測(cè)定 各處理分別取30株根的2～3 mm根尖，置于含有200 μL PME提取液(檸檬酸0.1 moL·L-1，Na2HPO40.2 moL·L-1，NaCL 1 moL·L-1，pH5.8)的研缽中，冰浴條件下充分研磨，將研磨液裝入離心管充分震蕩后，在冰浴中放置1 h，每隔20 min振蕩1次。于4℃，15 000 r·min-1，離心10 min，收集上清液，即為PME酶提取液，-20℃下保存待用。

PME活性檢測(cè)方法參照Richard等[29]的方法。取10 μL PME酶提取液加入到4 mL底物溶液[果膠0.5%(W/V)，NaCl 0.2 moL·L-1，甲基紅0.15%(W/V)，pH 6.8]中，充分混勻，37℃溫水浴2 h，用紫外分光光度計(jì)于525 nm處測(cè)吸光度值(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可測(cè)出不同酚酸處理?xiàng)l件下紫花苜蓿根冠PME酶的活性，重復(fù)3次，在PME酶的作用下，果膠去甲基化后，釋放出H+使溶液pH值下降，甲基紅由黃色變成紅色。這種顏色變化可以通過分光光度計(jì)檢測(cè)出來。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取12，14，16，18，20，22 μL的0.01 moL·L-1鹽酸加入4 mL底物溶液，525 nm下測(cè)A值，重復(fù)2次。以鹽酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，測(cè)繪出關(guān)于H+值和A值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程，然后利用回歸方程計(jì)算不同PME樣品的酶活性。PME酶活性用Root H+μmoL/(cap·h)表示。

1.3.5化感作用敏感指數(shù) 化感作用敏感指數(shù)(allelopathic response index，RI)采用Williamson[30]公式：

RI=(T-C)/T(T≥C)或RI=(T-C)/C(T

式中，RI為化感效應(yīng)指數(shù)，T為處理值，C為對(duì)照值。RI絕對(duì)值的大小表示化感作用強(qiáng)度，當(dāng)RI≥0時(shí)，為促進(jìn)作用；當(dāng)RI≤0時(shí)，為抑制作用。

采用化感綜合效應(yīng)(synthetical allelopathic effects，SE)表示化感或自毒作用的綜合效應(yīng)，SE是供體對(duì)同一受體多個(gè)測(cè)試項(xiàng)目的化感效應(yīng)敏感指數(shù)RI的算術(shù)平均值[31]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行顯著性比較。使用Excel 2010應(yīng)用軟件處理測(cè)定數(shù)據(jù)，并制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根長(zhǎng)的影響

不同種類不同濃度的外源添加物對(duì)苜蓿根長(zhǎng)的影響表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的效應(yīng)，且差異顯著(P<0.05)(圖1)。0.5 mg·L-1濃度下，三種處理外源添加物對(duì)苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)量均呈現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)，且與對(duì)照差異顯著，其中M處理的促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng)，CF處理次之，C處理最弱，但三者之間差異不顯著；50～500 mg·L-1濃度下，三種處理的外源添加物對(duì)苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)均呈現(xiàn)出顯著抑制效應(yīng)，其中C處理的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，M處理次之，CF處理最弱。同種外源添加物不同濃度處理下，0.5 mg·L-1香豆素、咖啡酸及其混合物處理時(shí)苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)量均最大，較對(duì)照分別提高了30.23%，45.45%和52.95%，差異顯著(P<0.05)；5 mg·L-1咖啡酸和混合物處理顯著高于對(duì)照，較對(duì)照分別提高了45.45%和30.23%(P<0.05)。高于50 mg·L-1濃度處理下，隨著添加物濃度的增加苜蓿根尖的伸長(zhǎng)量顯著降低，500 mg·L-1時(shí)，苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)量均最短，香豆素、咖啡酸及其混合物處理分別較對(duì)照降低了59.09%，44.32%和57.5%，顯著低于對(duì)照(P<0.05)。不同外源添加物處理下，咖啡酸和混合物在低于5 mg·L-1時(shí)，隨著外源添加物濃度的降低對(duì)苜蓿根長(zhǎng)生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)增強(qiáng)，而高于50 mg·L-1時(shí)，隨著添加物濃度的升高對(duì)苜蓿根生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)增強(qiáng)；香豆素只有在0.5 mg·L-1濃度處理下對(duì)苜蓿根長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著的促進(jìn)作用，其余處理均呈現(xiàn)顯著的抑制作用。即咖啡酸和混合酚酸均以5 mg·L-1為正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)的拐點(diǎn)，香豆素以0.5 mg·L-1為正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)的拐點(diǎn)，隨著外源自毒物質(zhì)濃度的升高對(duì)苜蓿根伸長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)逐漸減弱，抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。綜上，三種處理的外源自毒物質(zhì)對(duì)苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)的抑制效應(yīng)最強(qiáng)的是香豆素，其次是混合物，咖啡酸最弱。

圖1 香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of coumarin and caffeic acid on the root length of alfalfa注：圖s，同種酚酸不同濃度對(duì)苜蓿根長(zhǎng)的影響；圖b，不同酚酸同種濃度對(duì)苜蓿根長(zhǎng)的影響Note:Fig.a：The effect of different concentrations on the root length of alfalfa under the same phenolic acid;Fig.b：The effect of different phenolic acids on the root length of alfalfa under the same concentration treatment

2.2 苜蓿根緣細(xì)胞的形狀、數(shù)目及外源香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞活性的影響

有關(guān)植物根緣細(xì)胞產(chǎn)生的時(shí)間有兩種模式，一種是根緣細(xì)胞幾乎與根尖同時(shí)出現(xiàn)，另一種是當(dāng)初生根生長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度時(shí)才有根緣細(xì)胞產(chǎn)生[32-33]。經(jīng)鏡下觀察苜蓿根緣細(xì)胞的產(chǎn)生模式，苜蓿根緣細(xì)胞與根尖出現(xiàn)的時(shí)間屬于第二種類型，當(dāng)根尖生長(zhǎng)至2.5 mm時(shí)，僅有5～6個(gè)根緣細(xì)胞出現(xiàn)，根尖伸長(zhǎng)至10 mm時(shí)，根緣細(xì)胞的數(shù)量達(dá)最大值，約137個(gè)。根緣細(xì)胞在開始形成時(shí)呈圓球形和長(zhǎng)橢圓形，之后部分細(xì)胞逐漸發(fā)育成棍棒狀和蠕蟲形。經(jīng)香豆素、咖啡酸及混合物處理的苜蓿根緣細(xì)胞存活率與對(duì)照相比出現(xiàn)了不同程度的下降，且隨著處理液濃度的增加，根緣細(xì)胞的存活率顯著降低(圖3)，表明較高濃度香豆素、咖啡酸及其混合物對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞的活性具有明顯的化感抑制效應(yīng)，同時(shí)這種抑制效應(yīng)因外源添加物種類不同而呈現(xiàn)一定的差異，5 mg·L-1及以上濃度，香豆素處理對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞活性呈現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)；50 mg·L-1及以上濃度，咖啡酸和混合物處理呈現(xiàn)顯著抑制效應(yīng)(P<0.05)，其余處理均與對(duì)照差異不顯著?？梢姡^高濃度下三種處理的外源自毒物質(zhì)對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)最強(qiáng)的是C處理，M處理次之，最弱的是CF處理，即較高濃度香豆素處理對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞活性的抑制作用最顯著，當(dāng)其濃度增至500 mg·L-1時(shí)，苜蓿根緣細(xì)胞的存活率僅為14.22%，顯著低于對(duì)照、咖啡酸及混合物處理(P<0.05)。

圖2 苜蓿根緣細(xì)胞Fig.2 Root border cells of alfalfaa. 根緣細(xì)胞形狀；b.對(duì)照組根緣細(xì)胞；c. 處理組根緣細(xì)胞(活細(xì)胞原生質(zhì)體顯紅色，死亡細(xì)胞無色或色澤較淡)a. Shape of root border cells;b. Root border cells of control group;c. Root border cells of the treatmen group(Red protoplast exhibits viable border cells，colourless or lighter in color protoplast exhibits dead ones)

圖3 香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞存活率的影響Fig.3 The effect of coumarin and caffeic acid on the viability of root border cells in alfalfa注：圖A.同種酚酸不同濃度對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞存活率的影響；圖B.不同酚酸同種濃度對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞存活率的影響Note:Fig.A，The effect of different concentrations on the viability of root border cells in alfalfa under the same phenolic acid;Fig.B，The effect of different phenolic acids on the viability of root border cells in alfalfa under the same concentration treatment

2.3 外源香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根冠PME活性的影響

與對(duì)照相比，C處理和M處理的紫花苜蓿PME活性在5 mg·L-1的濃度處理下顯著增強(qiáng)(P<0.05)，隨著處理濃度的升高，促進(jìn)效應(yīng)逐漸降低，當(dāng)處理濃度增至500 mg·L-1時(shí)，香豆素、咖啡酸和混合物處理的苜蓿PME活性均最低，分別較對(duì)照降低了75.68%，22.92%與36.49%，差異顯著(P<0.05)(圖4)。0.5 mg·L-1處理時(shí)，香豆素、咖啡酸和混合物處理的苜蓿根冠PME活性較其對(duì)照分別提高了20.27%，9.46%與18.92%，但差異不顯著。可見，50 mg·L-1及以下濃度下，香豆素、咖啡酸及其混合物處理對(duì)苜蓿根尖PME活性具有不同程度的促進(jìn)作用，表明苜蓿在受到外源添加物質(zhì)刺激時(shí)，可能通過PME活性的升高產(chǎn)生大量的邊緣細(xì)胞來抵御其自毒作用，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)根尖的目的，但當(dāng)外源刺激高于其耐受范圍時(shí)，PME活性明顯降低，同時(shí)這種抑制效應(yīng)因外源添加物種類不同而呈現(xiàn)一定的差異，如500 mg·L-1濃度處理下，香豆素、咖啡酸和混合物對(duì)苜蓿根尖PME活性抑制效應(yīng)最強(qiáng)的是香豆素，混合物次之，咖啡酸最弱。

2.4 外源香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根尖的化感綜合效應(yīng)

香豆素、咖啡酸和混合物對(duì)苜蓿根尖的化感潛勢(shì)差異明顯(表2)，綜合比較它們對(duì)根長(zhǎng)、PME活性和根緣細(xì)胞存活率的化感綜合效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，0.5 mg·L-1及以下濃度處理時(shí)，C、CF和M處理的外源自毒物質(zhì)對(duì)紫花苜蓿根生長(zhǎng)和根緣細(xì)胞影響的化感綜合效應(yīng)值依次為0.39，0.46和0.59，表明三種外源添加物對(duì)紫花苜蓿根尖促進(jìn)作用最強(qiáng)的是M處理，CF處理次之，C處理最弱。50 mg·L-1及以上濃度下，三種外源自毒物質(zhì)對(duì)紫花苜蓿根尖抑制作用最強(qiáng)的是C處理，M處理次之，CF處理最弱。同時(shí)三種處理的外源自毒物質(zhì)對(duì)紫花苜蓿根尖的促進(jìn)和抑制效應(yīng)因添加物種類和濃度的不同呈現(xiàn)一定的差異，C處理濃度為5～50 mg·L-1時(shí)，苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)量的化感作用敏感指數(shù)均顯著低于CF和M處理，當(dāng)其濃度增至500 mg·L-1時(shí)，苜蓿根緣細(xì)胞活性和根尖PME活性均顯著低于CF和M處理(P<0.05)。CF和M處理在同種濃度處理下，差異均不顯著(P>0.05)。綜合三種處理的外源自毒物質(zhì)對(duì)紫花苜蓿根尖化感作用敏感指數(shù)可知，香豆素以0.5 mg·L-1為正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)的拐點(diǎn)，咖啡酸和混合酚酸均以5 mg·L-1為正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)的拐點(diǎn)，隨著外源自毒物質(zhì)濃度的升高其化感綜合促進(jìn)效應(yīng)逐漸減弱，抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，且香豆素處理對(duì)紫花苜蓿根尖和根緣細(xì)胞發(fā)育抑制效最強(qiáng)，混合物次之，咖啡酸最弱。

圖4 香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根冠PME活性的影響Fig.4 The effect of coumarin and caffeic acid on the activity of PME in root cap of alfalfa注：圖A，同種酚酸不同濃度對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞存活率的影響；圖B，不同酚酸同種濃度對(duì)苜蓿根緣細(xì)胞存活率的影響Note:Fig.A，The effect of different concentrations on the activity of PME in root cap of alfalfa under the same phenolic acid;Fig.B，The effect of different phenolic acids on the activity of PME in root cap of alfalfa under the same concentration treatment

表2 香豆素和咖啡酸對(duì)苜蓿根生長(zhǎng)和根緣細(xì)胞的化感綜合效應(yīng)Table 2 The synthesis effect of coumarin and caffeic acid on the root growth and root border cells of alfalfa

濃度Concentration/mg·L-1添加物種類Additive type化感作用敏感指數(shù)The allelopathic response indexRIRLRISRRIPA化感綜合效應(yīng)Synthesis effect0.5C0.39±0.07aA-0.01±0bA0.01±0aA0.39CF0.46±0.02aA0.04±0aA-0.04±0aA0.46M0.49±0.01aA0.03±0abA0.07±0.01aA0.595C-0.24±0.03bB-0.08±0.01bAB0.02±0.11aA-0.30CF0.46±0.06aA0.00±0aA0.01±0.00aA0.48M0.40±0.05aA0.03± 0.01aA-0.01±0.00aA0.4250C-0.39±0.07bB-0.22±0.02aB-0.15±0.00aA-0.76CF0.08±0.01aB-0.09±0.01aB-0.14±0.01aAB-0.15M-0.16±0.04abB-0.17±0.07aB0.04±0.01aA-0.29500C-0.47±0.10aB-0.85±0.08bC-0.90±0.03bB-2.21CF-0.26±0.08aC-0.22±0.02aC-0.23±0.01aB-0.72M-0.45±0.13aB-0.31±0.03aC-0.36±0.02aB-1.12

注：RIRL：根長(zhǎng)化感敏感指；RISR：根緣細(xì)胞存活率的化感敏感指數(shù)；RIPA：根冠PME活性的化感敏感指數(shù)。不同大寫字母表示同種類不同濃度處理下的差異顯著性，小寫字母表示同種濃度不同酚酸種類下的差異顯著性，P<0.05

Note:RIRL:The index of allelopathy effect of the root length;RISR:The index of allelopathy effect of the viability of root border cells;RIPA:The index of allelopathy effect of root cap PME activity．Different capital letters indicate the significant difference in the same phenolic acids of different concentrations;Different lowercase letters indicate significant difference in the same concentration of different phenolic acids at the 0.05 level

3 討論

根緣細(xì)胞起源于根冠分生組織的有絲分裂，經(jīng)過一系列的不同發(fā)育時(shí)期，最后在根冠外圍形成細(xì)胞層，其產(chǎn)生和發(fā)育受到內(nèi)源和外界環(huán)境因素的嚴(yán)格調(diào)控[34]。本研究結(jié)果表明，香豆素、咖啡酸及其混合物對(duì)紫花苜蓿根尖和根邊緣細(xì)胞的發(fā)育具有明顯的低濃度促進(jìn)和高濃度抑制效應(yīng)。50 mg·L-1及以上濃度處理時(shí)，香豆素處理對(duì)紫花苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)和根緣細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，混合物處理次之，咖啡酸處理最弱；0.5 mg·L-1及以下濃度處理時(shí)，混合物處理對(duì)紫花苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)和根緣細(xì)胞活性的促進(jìn)效應(yīng)最強(qiáng)，咖啡酸處理次之，香豆素處理最弱。這一結(jié)果說明，香豆素和咖啡酸的混合物在一定程度上增強(qiáng)了單體香豆素、咖啡酸在低濃度處理中對(duì)紫花苜蓿根尖和根邊緣細(xì)胞活性的促進(jìn)效應(yīng)，同時(shí)降低了單體香豆素、咖啡酸在高濃度處理中對(duì)紫花苜蓿根尖和根邊緣細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)。50 mg·L-1及以下濃度的香豆素、咖啡酸及其混合物處理對(duì)苜蓿根尖PME活性具有不同程度的促進(jìn)作用，但隨著濃度的增加，PME活性明顯降低，說明香豆素和咖啡酸在中低濃度時(shí)可能誘導(dǎo)了植物根冠PME基因的表達(dá)，使PME活性升高，促進(jìn)了根緣細(xì)胞的形成，通過根緣細(xì)胞釋放某些生物活性物質(zhì)，中和化感物質(zhì)，提高紫花苜蓿對(duì)自身自毒物質(zhì)的抵御能力，保護(hù)了根尖分生區(qū)細(xì)胞免遭傷害。但是當(dāng)處理濃度超過了紫花苜蓿根尖組織的耐受極限(50 mg·L-1)時(shí)，整個(gè)機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致PME活性迅速下降，根緣細(xì)胞的產(chǎn)生受到抑制，降低了對(duì)根尖分生區(qū)細(xì)胞的保護(hù)作用，這與王桂芹[34]的研究結(jié)果一致，推測(cè)PME的活性與植物抵御化感物質(zhì)之間存在著一定的相關(guān)性。當(dāng)香豆素和混合物的處理濃度為5 mg·L-1時(shí)，紫花苜蓿根尖PME活性較對(duì)照分別提高了42.74%和48.39%，差異顯著(P<0.05)，游離出的根緣細(xì)胞數(shù)量也顯著高于對(duì)照，但其根緣細(xì)胞活性與對(duì)照相比無顯著差異性，這可能是由于香豆素和咖啡酸在一定程度上使紫花苜蓿根緣細(xì)胞失活所致。同時(shí)香豆素、咖啡酸及其混合物能夠促進(jìn)或抑制苜蓿根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，可能是通過干擾苜蓿根尖細(xì)胞有絲分裂實(shí)現(xiàn)的，植物化感作用的一個(gè)重要機(jī)制是化感物質(zhì)通過影響受體植物細(xì)胞有絲分裂來促進(jìn)或抑制其生長(zhǎng)發(fā)育的[35]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：香豆素、咖啡酸和混合物對(duì)紫花苜蓿根尖和根緣細(xì)胞發(fā)育有明顯的低濃度促進(jìn)高濃度抑制作用，且隨著處理濃度增加抑制效應(yīng)顯著增強(qiáng)，0.5 mg·L-1及以下濃度的促進(jìn)作用最強(qiáng)的是混合物，咖啡酸次之，香豆素最弱，50 mg·L-1及以上濃度抑制作用最強(qiáng)的是香豆素，混合物次之，咖啡酸最弱。香豆素和咖啡酸的混合物在一定程度上增強(qiáng)了單體香豆素、咖啡酸在低濃度處理中對(duì)紫花苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)、根緣細(xì)胞活性的促進(jìn)效應(yīng)，同時(shí)降低了單體香豆素、咖啡酸在高濃度處理中對(duì)紫花苜蓿根長(zhǎng)伸長(zhǎng)、根緣細(xì)胞活性的抑制效應(yīng)。香豆素和咖啡酸在一定程度上使紫花苜蓿根緣細(xì)胞失活是導(dǎo)致紫花苜蓿根緣細(xì)胞活性降低的因素之一，該現(xiàn)象產(chǎn)生的可能原因及其對(duì)紫花苜?；凶饔脵C(jī)理還有待進(jìn)一步研究。