黃益領(lǐng) 陳 湧

浙江省平陽縣人民醫(yī)院普外科1(325400) 岳陽市二人民醫(yī)院普外科2

背景：蛇孢菌素A(OphA)是一種由雙極霉屬真菌產(chǎn)生的二倍半萜化合物，已被證實在多種實體瘤中具有抗癌效應(yīng)，但其在直腸癌中的作用尚不明確。目的：研究OphA對人直腸癌細胞生長的抑制作用及其可能作用機制。方法：體外人直腸癌細胞株SW480經(jīng)OphA和(或)活性氧簇(ROS)清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)作用后，以光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT實驗檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和ROS表達，蛋白質(zhì)印跡法檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達和NF-κB活化情況。結(jié)果：OphA可劑量依賴性地抑制體外SW480細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，促進細胞內(nèi)ROS表達，細胞色素C、cleaved caspase-3、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)表達上調(diào)，Bcl-2、p-NF-κBp65表達下調(diào)。以NAC清除ROS可明顯阻斷OphA對SW480細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，同時逆轉(zhuǎn)上述相關(guān)蛋白表達。結(jié)論：OphA可能通過ROS介導(dǎo)線粒體途徑細胞凋亡，抑制人直腸癌細胞生長。NF-κB信號通路可能參與了ROS介導(dǎo)的細胞凋亡的調(diào)控。

蛇孢菌素(ophiobolin, Oph)是一類具有三環(huán)或四環(huán)結(jié)構(gòu)的二倍半萜類化合物，主要由侵染農(nóng)作物的雙極霉屬真菌產(chǎn)生，具有抑制植物胚芽鞘、根系生長和種子萌發(fā)等植物毒性作用，其作用機制與破壞細胞膜通透性、減少光合作用和抑制核酸合成有關(guān)[1-2]。隨著越來越多的Oph被分離和鑒定，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Oph除對細菌和線蟲具有殺滅作用外，還能有效抑制HIV和多種腫瘤細胞生長，從而為新型抗癌藥物的研發(fā)提供了思路[3]。

在目前已發(fā)現(xiàn)的45種Oph同系物中，以O(shè)phA的細胞毒性最強，可有效抑制惡性膠質(zhì)瘤[4]、黑色素瘤[5]等多種實體瘤腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡。然而，目前尚未見關(guān)于OphA抗直腸癌活性的研究報道。本研究旨在探討OphA對人直腸癌細胞生長的抑制作用及其可能作用機制，為OphA用于直腸癌的治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人直腸癌細胞株SW480購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血 液學(xué)研究所。OphA(>95%, AdipoGen Life Sciences)以乙醇配制成2 mmol/L的母液，使用前以PBS稀釋。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(Sigma-Aldrich Co.)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；細胞色素C、cleaved caspase-3、Bcl-2、β-actin抗體(Abcam plc.)；磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)、NF-κBp65、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)抗體(Santa Cruz Bio-technology)；羊抗兔 IgG-HRP、羊抗鼠 IgG-HRP、PBS、DMSO(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；活性氧簇(ROS)檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：SW480細胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺)，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。細胞生長至80%～90%融合度時，以適量0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代比率為 1∶6。

2. 實驗分組：實驗分兩部分進行。第一部分實驗中，細胞分為四組，分別予PBS和1、5、10 μmol/L OphA作用24 h。第二部分實驗中，細胞分為對照組、NAC組、OphA組和NAC+OphA組，分別予PBS、NAC(3 mmol/L)、OphA(5 μmol/L)和NAC+OphA作用24 h。

3. MTT實驗：調(diào)整細胞密度為5×104/mL，以每孔90 μL細胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，孵育過夜后加入10 μL含OphA和(或)NAC的藥液，使OphA終濃度分別為1、5、10 μmol/L，NAC終濃度為 3 mmol/L，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，倒置顯微鏡(奧林巴斯IX83)下觀察細胞形態(tài)。根據(jù)試劑盒說明書，每孔加入MTT試劑20 μL作用4 h，吸去培養(yǎng)基后每孔加入200 μL DMSO，使用酶標儀測定波長570 nm處吸光度(A)值，計算細胞存活率(實驗組A值/對照組A值×100%)。每一樣品設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

4. 細胞凋亡檢測：調(diào)整細胞密度為5×105/mL，以每孔1 mL細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，孵育過夜后藥物處理同MTT實驗。收集細胞，PBS洗滌3次，根據(jù)試劑盒說明書，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，冰浴避光放置15 min，上流式細胞儀(Beckman Coulter EPICS XL)檢測細胞凋亡。

5. 蛋白質(zhì)印跡法：細胞處理同MTT實驗。RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每一樣品取20 μg總蛋白上樣，行10% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，4 ℃ 5%脫脂奶粉封閉過夜。硝酸纖維素膜經(jīng)與相應(yīng)一抗和二抗反應(yīng)后，ECL顯色、曝光、顯影。ImageJ軟件分析目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次。

6. 細胞內(nèi)ROS檢測：取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×105個接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞生長至80%融合度時，藥物處理同MTT實驗。根據(jù)試劑盒說明書，在細胞懸液中加入10 μmol/L DCFH-DA (ROS熒光探針)，置于 37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗滌、離心，上流式細胞儀(Beckman Coulter CytoFLEX)檢測細胞內(nèi)ROS，CytExpert軟件定量分析ROS熒光強度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、OphA抑制體外SW480細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡

光學(xué)顯微鏡下，OphA作用后部分SW480細胞出現(xiàn)皺縮，胞質(zhì)中可見空泡，隨著藥物濃度的增加，更多細胞發(fā)生破裂(圖1A)。MTT實驗顯示，經(jīng)終濃度1、5、10 μmol/L的OphA作用24 h，SW480細胞平均存活率分別為72.3%、54.6%和42.4%，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明OphA有顯著的體外抗直腸癌細胞增殖作用，增殖抑制作用呈劑量依賴性。流式細胞分析顯示，經(jīng)終濃度1、5、10 μmol/L的OphA作用24 h，SW480細胞平均凋亡率分別為6.1%、14.3%和18.7%，與對照組(2.6%)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1B)，誘導(dǎo)凋亡作用亦呈明顯的劑量依賴性。

二、OphA對SW480細胞凋亡相關(guān)蛋白表達和NF-κB活化的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，經(jīng)1、5、10 μmol/L OphA作用的SW480細胞，細胞色素C、cleaved caspase-3、IκBα表達隨藥物濃度增加而逐步增高，Bcl-2、p-NF-κBp65表達則隨藥物濃度增加而逐步降低，OphA的作用呈劑量依賴性(圖2)。

A：光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)；B：流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

與對照組(0 μmol/L OphA)比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

三、OphA對SW480細胞ROS表達的影響

DCFH-DA熒光探針流式細胞檢測顯示，經(jīng)1、5、10 μmol/L OphA作用24 h，SW480細胞內(nèi)ROS表達水平逐步增高，作用呈劑量依賴性(圖3)。

***與對照組(0 μmol/L OphA)比較，P<0.001

四、NAC對OphA抑制SW480細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡作用的影響

ROS清除劑NAC(3 mmol/L)對體外SW480細胞增殖無明顯影響，但可阻斷OphA(5 μmol/L)對SW480細胞的增殖抑制作用(圖4)。同樣，NAC對SW480細胞早期凋亡無明顯影響，但可阻斷OphA的誘導(dǎo)凋亡作用，對照組、 NAC組、OphA組和NAC+OphA組細胞凋亡率分別為2.4%、3.1%、14.9%和6.7%，OphA組與NAC+OphA組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

五、NAC對OphA調(diào)控SW480細胞凋亡相關(guān)蛋白、ROS表達和NF-κB活化作用的影響

NAC對SW480細胞凋亡相關(guān)蛋白細胞色素C、Bcl-2表達和NF-κB活化無明顯影響，但可阻斷OphA對上述蛋白表達的調(diào)控作用(圖6)。此外，NAC不僅可下調(diào)ROS在SW480細胞中的表達，還可抑制OphA對ROS表達的上調(diào)作用(圖7)。

**兩組間比較，P<0.01

***兩組間比較，P<0.001

討 論

直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年我國直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，對人民健康造成嚴重威脅[6]。目前臨床上使用的直腸癌化療藥物均存在較強的毒性反應(yīng)，尋找低毒、高效的抗直腸癌藥物成分或其前體成為當(dāng)前結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域的研究熱點。本研究主要觀察OphA對體外人直腸癌細胞株SW480生長和凋亡的影響，并初步探討其可能作用機制。

圖5 NAC對OphA誘導(dǎo)凋亡作用的影響

**兩組間比較，P<0.01

誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是大多數(shù)化療藥物發(fā)揮抗癌效應(yīng)的主要作用機制。本實驗中，OphA可有效抑制體外SW480細胞增殖，作用呈明顯的劑量依賴性，并能劑量依賴性地誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞色素C作為細胞呼吸鏈中的一個重要組分，不僅在氧化還原和能量代謝中扮演重要角色，在線粒體啟動凋亡程序中亦發(fā)揮關(guān)鍵的信號放大作用。其釋放入細胞質(zhì)后，可特異性地與caspase-9結(jié)合形成凋亡體，激活下游caspases級聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細胞凋亡，而細胞色素C的釋放受Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)[7-9]。本研究觀察到OphA可下調(diào)SW480細胞中具有抗凋亡作用的Bcl-2表達，同時檢測到大量細胞色素C自線粒體中釋放。Caspase-3是caspases家族凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶，經(jīng)OphA作用的SW480細胞中caspase-3大量激活，cleaved caspase-3表達呈OphA劑量依賴性上調(diào)，引起細胞凋亡。

ROS作為機體代謝過程中一類具有較強氧化能力的副產(chǎn)物，在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中充當(dāng)?shù)诙攀?，對正常生理反?yīng)發(fā)揮重要調(diào)控作用。少量ROS可促進細胞分裂，對細胞增殖和分化具有一定促進作用；高濃度ROS則可直接或間接對細胞內(nèi)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成一定程度的破壞，從而增加線粒體膜通透性，使細胞色素C從線粒體釋放至細胞質(zhì)，促進細胞衰老，誘導(dǎo)細胞凋亡[10-12]。與正常細胞相比，高氧化應(yīng)激狀態(tài)多見于腫瘤細胞，同時腫瘤細胞對ROS濃度的變化更為敏感。腫瘤細胞中諸如過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶等抗氧化劑往往表達上調(diào)，從而將ROS限定在一定濃度以維持細胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定。因此，通過促氧化劑上調(diào)腫瘤細胞內(nèi)的ROS表達被認為是有效抑制腫瘤細胞生長、促進細胞凋亡的方式[13-14]。本實驗觀察到，OphA誘導(dǎo)SW480細胞凋亡過程中伴有ROS表達上調(diào)，當(dāng)以ROS清除劑NAC清除SW480細胞內(nèi)的ROS后，OphA對SW480細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用被阻斷，OphA對凋亡相關(guān)蛋白表達的調(diào)控作用亦明顯受抑，表明介導(dǎo)ROS產(chǎn)生和線粒體損傷在OphA誘導(dǎo)SW480細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

NF-κB是一種以異二聚體形式存在于細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子超家族，與IκB結(jié)合時處于非活性狀態(tài)，細胞內(nèi)信號因子的刺激可使IκB磷酸化進而發(fā)生降解，NF-κB與IκB分離后激活，其p65亞基迅速轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)包括Bcl-2家族蛋白在內(nèi)的下游靶基因轉(zhuǎn)錄表達，從而促進細胞存活，抑制細胞凋亡[15-16]。本研究觀察顯示，OphA可分別下調(diào)和上調(diào)NF-κBp65和IκBα在SW480細胞中的表達，而NAC可阻斷 OphA對兩者表達的調(diào)節(jié)作用，提示NF-κB信號通路可能參與了OphA通過ROS介導(dǎo)的誘導(dǎo)凋亡作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明OphA對人直腸癌細胞的生長抑制作用依賴于ROS的產(chǎn)生和線粒體凋亡途徑的激活，而NF-κB信號通路可能參與了ROS介導(dǎo)的細胞凋亡的調(diào)控。上述發(fā)現(xiàn)對于揭示直腸癌的發(fā)病機制以及OphA用于直腸癌的治療有一定積極意義，ROS對NF-κB信號通路的調(diào)控作用及其確切機制尚需進一步實驗加以明確。