姜錦鵬, 解文軍, 黃建飛

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是腎上腺、性腺等組織分泌的類(lèi)固醇產(chǎn)物，也是血液循環(huán)中最豐富的固醇類(lèi)物質(zhì)。研究表明, DHEA不僅是合成性激素的前體物質(zhì)，還參與獨(dú)特的生物學(xué)活動(dòng)如降脂、抗癌、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等[1]。目前，一些國(guó)家已將DHEA用于臨床，其中北美、日本等國(guó)已將DHEA作為膳食補(bǔ)充劑。近年來(lái)，DHEA因具有生物學(xué)活性，引起了畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。并在動(dòng)物生產(chǎn)上取得了進(jìn)展，如發(fā)現(xiàn)DHEA具有促進(jìn)畜禽的脂質(zhì)代謝、改善畜禽肌肉品質(zhì)，增強(qiáng)動(dòng)物自身免疫力等功效[2-3]。雖然眾多研究表明生理劑量的DHEA對(duì)動(dòng)物和人體有多種益處，其毒副作用也不明顯，但長(zhǎng)期或大劑量使用DHEA可能存在安全問(wèn)題[4]。相關(guān)資料表明高劑量DHEA能夠增加SD大鼠肝臟和腎臟的重量[5]，并對(duì)一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有致癌作用[6]。本實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，高劑量DHEA對(duì)生長(zhǎng)期小鼠的睪丸組織發(fā)育有毒性作用[7]，因此，DHEA的安全性仍需進(jìn)一步研究。因豬的消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝過(guò)程等許多生理學(xué)特點(diǎn)與人有高度的相似性，可作為研究人類(lèi)一些疾病和藥物安全性的良好動(dòng)物模型[8]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)添加不同劑量的DHEA的飼養(yǎng)商品豬，觀察選擇以生長(zhǎng)育肥期去勢(shì)公豬的肝臟、腎臟為研究對(duì)象，觀察DHEA對(duì)其亞慢性毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選擇45頭98日齡前后、體重相近的健康杜×(長(zhǎng)·大)去勢(shì)公豬，由安徽省懷遠(yuǎn)縣淮河種豬養(yǎng)殖有限公司提供。DHEA購(gòu)自常州佳爾科藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，純度大于99%。選擇98日齡、體重為45 kg左右的杜×(長(zhǎng)·大)三元雜交去勢(shì)公豬45頭，隨機(jī)分為3組，每組15頭，組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料(表1)，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組在基礎(chǔ)飼料中分別添加25和75 mg/kg DHEA。試驗(yàn)豬以重復(fù)為單位分舍圈養(yǎng)，圈舍均為南向，面積為12.6 m2。預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期105 d。試驗(yàn)前，將豬舍內(nèi)外環(huán)境徹底清理消毒。試驗(yàn)期間，豬自由采食和飲水，每天喂料3次，早、中、晚各一次。常規(guī)飼養(yǎng)管理，定期對(duì)豬舍進(jìn)行消毒和清理糞便，保持舍內(nèi)清潔衛(wèi)生，通風(fēng)良好，并嚴(yán)格按豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)和免疫。試驗(yàn)期間每日觀察豬的健康情況、活動(dòng)、飲水采食等一般狀況。

表1 基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，按組間體重相近原則從每組各選擇6頭豬進(jìn)行屠宰。宰前由前腔靜脈采集血樣，分離血清后置于冰箱保存，用于生化指標(biāo)的檢測(cè)。宰后，分離并稱(chēng)量肝臟、腎臟重量，采集肝臟與腎臟組織樣，置于體積比為4%的甲醛溶液中固定待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.3.1 肝腎重量 屠宰后分別稱(chēng)量左右胴體重，小心剝離并取出肝臟和左側(cè)腎臟，濾紙吸干表面水分后稱(chēng)重，并計(jì)算相對(duì)重量。肝臟相對(duì)重量(g/kg)=肝臟重量(g)/胴體重量(kg)，腎臟相對(duì)重量(g/kg)=左側(cè)腎臟重量(g)/左側(cè)胴體重量(kg)。

1.3.2 血清生化指標(biāo) 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性測(cè)定分別采用速率法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法。血清總蛋白(Total protein，TP)和白蛋白(Albumin，ALB)含量分別采用雙縮脲法和溴甲酚綠法測(cè)定。血清肌酐(Creatinine，CREA)和尿素氮(Urea nitrogen，UREA-N)含量分別采用堿性苦味酸法、鄰苯二甲醛法測(cè)定。血清ALT、AST、TP、ALB、CREA和UREA-N測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司。以上指標(biāo)均使用全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 7080，株式會(huì)社日立科學(xué)系統(tǒng))測(cè)定。血清球蛋白(Globulin，GLB)含量以及白/球比(A/G，其中A表示ALB，G表示GLB)按以下公式計(jì)算：GLB(g/L) = TP-ALB，A/G = 白蛋白/球蛋白。

1.3.3 肝腎組織切片制作 肝、腎組織固定24 h 后，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋(YB-6型包埋機(jī)，湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)，用切片機(jī)(Leica RM2128，德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)進(jìn)行組織切片，切片厚度約為6 μm，HE 染色，中性樹(shù)膠封片，采用Olympus CH-30顯微攝影系統(tǒng)(奧林巴斯株式會(huì)社)觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因子方差分析(One way ANOVA，LSD)，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬的一般狀況與肝腎重量

各試驗(yàn)組豬在105 d喂養(yǎng)期間沒(méi)有死亡,皮毛順滑，活動(dòng)自如，采食飲水正常，生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好。由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，DHEA處理使豬的腎臟重量雖有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；DHEA低劑量組(試驗(yàn)Ⅰ組)的肝重也無(wú)明顯變化(P>0.05)，但DHEA高劑量組(試驗(yàn)Ⅱ組)肝臟絕對(duì)重、相對(duì)重分別比對(duì)照組增加了18.6%和17.23%，差異均顯著(P<0.05)。

表2 日糧添加DHEA對(duì)豬肝腎重量的影響

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)沒(méi)有字母或相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字者表示差異顯著 (P<0.05)。下同。

Note：Values in the same column with the same letters and no letters represent non-significant difference (P>0.05); Values in the same column with the different small letters mean significant difference at levels of 0.05 (P<0.05).The same below.

2.2 豬的肝腎功能

由表3可見(jiàn)，飼料中添加不同濃度的DHEA飼喂105 d后，對(duì)去勢(shì)公豬血清ALT和AST活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，對(duì)血清TP、ALB和GLB含量以及A/G也沒(méi)有明顯影響(P>0.05)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組血清CREA和UREA-N水平均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

表3 日糧添加DHEA對(duì)豬肝腎功能指標(biāo)的影響

續(xù)表3

2.3 豬的肝腎組織病理性觀察

屠宰時(shí)，肉眼觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組豬肝臟與腎臟的形態(tài)、色澤及質(zhì)地未見(jiàn)明顯變化，但試驗(yàn)Ⅱ組豬的肝臟肥大。試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組豬的肝臟、腎臟組織經(jīng)顯微鏡檢查未見(jiàn)特征性病理變化(圖1)。

圖1 豬肝臟和腎臟組織病理學(xué)變化(HE染色)

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，由于DHEA能參與機(jī)體一系列重要的生理活動(dòng)，日益受到人們重視，但其副作用尚未完全厘清，必須考慮其使用上的安全性。DHEA的安全性與使用劑量和時(shí)間有關(guān)[7]。DHEA作為膳食補(bǔ)充劑，人的每日口服劑量范圍通常在25～50 mg之間[9]。本試驗(yàn)采用與人體用量基本相當(dāng)?shù)膭┝浚载i作為模型動(dòng)物，觀察亞慢性毒性。試驗(yàn)結(jié)果表明，去勢(shì)公豬采食添加25、75 mg DHEA/kg飼料105 d，活動(dòng)、采食、生長(zhǎng)發(fā)育等一般狀況未見(jiàn)明顯異常，血清肝功能和腎功能指標(biāo)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。但是當(dāng)日糧DHEA添加劑量達(dá)到75 mg/kg時(shí)，引起試驗(yàn)豬肝腎重量增加，其中肝臟絕對(duì)重和相對(duì)重明顯增加(P<0.05)。陳冠敏等[5]發(fā)現(xiàn)，大鼠采食含有42 mg DHEA/kg的日糧90 d，就可增加肝/體比，在含量達(dá)到84 mg/kg 時(shí)同時(shí)增加雌性大鼠腎/體比。外源性添加DHEA導(dǎo)致肝細(xì)胞肥大可能與肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化酶體增生有關(guān)[10]，但其原因還有待進(jìn)一步研究。

肝臟組織病理學(xué)檢查顯示，對(duì)照組及DHEA處理組肝組織中有部分紅細(xì)胞沉積，這與肝的造血和貯血功能有關(guān)[11]，也可能由于屠宰時(shí)未充分放血，導(dǎo)致血液在肝組織內(nèi)滯留所引起。此外，未見(jiàn)其他明顯的病理?yè)p傷。在本試驗(yàn)中，日糧添加75 mg/kg DHEA可引起肝重增加，但衡量肝臟功能的一些重要指標(biāo)，如血清ALT和AST活力，白蛋白與球蛋白的含量及肝臟的組織結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生明顯改變。說(shuō)明DHEA對(duì)去勢(shì)公豬肝臟功能無(wú)明顯影響。

本試驗(yàn)中，腎臟病理組織學(xué)切片未見(jiàn)特征性病理變化。血清UREA-N 和CREA水平在一定程度上反映了腎臟的健康情況，表現(xiàn)了腎功能的受損程度[12]。參考有關(guān)資料中豬的血尿素氮(3.0～8.5 mmol/L)和肌酐(90～240 μmol/L)的正常生理范圍[13]，可見(jiàn)本試驗(yàn)中被檢的18頭試驗(yàn)組去勢(shì)公豬的相應(yīng)值均為正常。以上結(jié)果表明，飼料中添加正常劑量DHEA對(duì)去勢(shì)公豬腎功能無(wú)明顯影響。另有研究顯示DHEA對(duì)一些損傷反而具有一定的修復(fù)和治療作用。Brignardello等[14]研究DHEA對(duì)高血糖所致大鼠腎小球細(xì)胞損害的影響，結(jié)果顯示DHEA濃度為100 nmol/L和500 nmol/L時(shí)，可以逆轉(zhuǎn)高糖所致的腎小球細(xì)胞損害。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明DHEA對(duì)豬的血清肝功能和腎功能指標(biāo)無(wú)不良影響，肝腎組織病理學(xué)檢查也未見(jiàn)普遍性的特征性病變，但大劑量能引起豬肝臟重量增加。故DHEA低劑量使用較為安全，而在體內(nèi)達(dá)一定劑量時(shí)并長(zhǎng)期使用對(duì)豬肝臟有一定的亞慢性毒性作用。