王作銘，陳軍，陳靜，徐漢杰

上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234

抗生素被廣泛用于人類和動(dòng)物感染性疾病的治療，同時(shí)也被作為促生長(zhǎng)劑添加于飼料中在養(yǎng)殖業(yè)中大量應(yīng)用[1]；我國(guó)是抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó)，且濫用現(xiàn)象嚴(yán)重[2]；抗生素在使用之后，大量未被代謝的抗生素經(jīng)不同途徑最終進(jìn)入水體[3]，在我國(guó)各地江河流域中普遍發(fā)現(xiàn)了抗生素殘留的現(xiàn)象[4]，因此抗生素對(duì)水生態(tài)的影響特別嚴(yán)重，也是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外最受關(guān)注的環(huán)境污染問題之一[5]。雖然，水體中抗生素的殘留濃度不高且半衰期不長(zhǎng)，檢出水平常在μg·L-1和ng·L-1級(jí)別，但由于抗生素被頻繁地使用并進(jìn)入了水環(huán)境，使得抗生素在水體中持續(xù)存在，即表現(xiàn)出“假持續(xù)”現(xiàn)象[6-8]；值得注意的是，這種現(xiàn)象極有可能會(huì)對(duì)水體中的微生物群落產(chǎn)生影響，并通過生物富集和食物鏈傳遞影響高級(jí)生物，破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡，對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成長(zhǎng)期潛在風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。

實(shí)際上，由于水體中殘留的抗生素種類繁多和特定地域的限制，通過實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)環(huán)境中所有不同濃度的混合藥物是不可能的[7,11]，為了預(yù)測(cè)聯(lián)合毒性效應(yīng)和識(shí)別藥物之間的作用關(guān)系，毒性預(yù)測(cè)模型得到了發(fā)展[7]。目前，多采用濃度相加(CA)和獨(dú)立作用(IA)傳統(tǒng)模型進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，缺陷是這2種傳統(tǒng)模型忽視了藥物之間的協(xié)同、拮抗作用。然而，水體中化合物之間不僅僅是簡(jiǎn)單的相加作用，也會(huì)發(fā)生相互作用而產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)[12]，抗生素對(duì)環(huán)境的危害作用可能會(huì)因共存而加強(qiáng)[13]。因此，考慮到當(dāng)抗生素共存時(shí)判斷相互作用發(fā)生與否對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要性[9]，Chou[14]提出的聯(lián)合指數(shù)(CI)模型被用于研究污染物相互作用[15-16]。

上海地處長(zhǎng)江流域下游，是中國(guó)人口密度最高且經(jīng)濟(jì)最發(fā)達(dá)的城市之一；近年來，不同種類、濃度的抗生素在上海地區(qū)的地表水、地下水[4,17-18]，甚至在飲用水以及學(xué)生體內(nèi)被檢出[19-20]。因此，上海地區(qū)水體中抗生素污染風(fēng)險(xiǎn)不得不受到重視，而最直接的危害是通過影響水生生物破壞水生態(tài)健康?，F(xiàn)有權(quán)威統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明磺胺類、四環(huán)素類和氯霉素類抗生素是當(dāng)前上海地區(qū)水體中被檢出最多且污染最為嚴(yán)重的抗生素種類[4,17-18,21]，本文以這3類抗生素的3種代表物質(zhì)即磺胺甲惡唑、土霉素和氟苯尼考為受試物質(zhì)，以不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的國(guó)際通用模式生物蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)、大型蚤(Daphnia magna)和斑馬魚胚胎(zebrafish embryo)為受試對(duì)象，進(jìn)行了急性毒性研究，然后在其基礎(chǔ)上開展聯(lián)合毒性試驗(yàn)并用CA、IA和CI模型對(duì)抗生素的聯(lián)合毒性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，同時(shí)用聯(lián)合指數(shù)CI對(duì)不同濃度下藥物之間作用關(guān)系(相加、協(xié)同、拮抗)進(jìn)行了識(shí)別和評(píng)價(jià)；最后以近年來上海地區(qū)水體中抗生素主要來源(養(yǎng)殖廢水、工廠廢水)和主要地表水(黃浦江、長(zhǎng)江口)的檢出數(shù)據(jù)為指標(biāo)，在CI模型基礎(chǔ)上測(cè)試分析上海地區(qū)水體抗生素污染狀況，評(píng)價(jià)其中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，為上海地區(qū)抗生素污染監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

藥品：磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)購自阿拉丁，分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度為99%，試劑CAS編號(hào)為723-46-6；土霉素(oxytetracycline, OTC)購自阿拉丁，分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度為97%，試劑CAS編號(hào)為6153-64-6；氟苯尼考(florfenicol, FF)購自阿拉丁，分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度為98%，試劑CAS編號(hào)為73231-34-2。取待測(cè)化合物用適量二甲基亞砜(DMSO)配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液備用(最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.1%)。

受試生物：蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、大型蚤(Daphnia magna)均為上海師范大學(xué)水生生物實(shí)驗(yàn)室保存種；費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)由中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院王祥紅教授惠贈(zèng)；斑馬魚(zebrafish)購于上海市奉賢區(qū)花鳥市場(chǎng)，試驗(yàn)前馴養(yǎng)一周以上，馴養(yǎng)期間，健康狀態(tài)良好且無死亡。

試驗(yàn)用水及培養(yǎng)基：①曝氣自來水：曝氣除氯48 h以上的自來水。②大型蚤稀釋用水：CaSO460 mg·L-1，MgSO460 mg·L-1，Na2CO396 mg·L-1，KCl 4 mg·L-1，pH 7.6。③斑馬魚胚胎培養(yǎng)水：CaCl2·2H2O 0.294 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.123 g·L-1，NaHCO30.065 g·L-1，KCl 0.006 g·L-1，用曝氣48 h以上自來水溶解。④BG-11復(fù)合培養(yǎng)基：購于樊克生物有限公司⑤費(fèi)氏弧菌液體培養(yǎng)基：NaCl 30 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，甘油3 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，Na2HPO45 g·L-1，pH 7.0，121 ℃蒸汽滅菌20 min。⑥費(fèi)氏弧菌固體培養(yǎng)基：NaCl 30 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，甘油3 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，Na2HPO45 g·L-1，20 g·L-1瓊脂，pH 7.0，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器

主要儀器包括AE20/21倒置生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；Tecan M200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)；PQX—350H人工氣候箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)。

1.3 受試生物的培養(yǎng)

(1)小球藻的培養(yǎng)：在無菌條件下，將對(duì)數(shù)期的藻種接種到100 mL BG-11培養(yǎng)基中，容器為250 mL錐形瓶，在溫度(22±1) ℃、光照強(qiáng)度2 500 Lux，光暗比12 h∶12 h的條件下靜置培養(yǎng)。每天的固定時(shí)間震蕩3次以上(15 min/次)，每隔96 h移種一次。

(2)大型蚤的培養(yǎng)：大型蚤的擴(kuò)大培養(yǎng)采用曝氣自來水，培養(yǎng)溫度為(20±1) ℃；光照強(qiáng)度為2 500 Lux；光暗比為12 h∶12 h。每隔2天換一次水并喂食蛋白核小球藻，投餌密度為2.0×105～3.0×105cells·L-1。實(shí)驗(yàn)前24 h選取懷卵的健康母蚤在稀釋用水中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前6 h將母蚤挑出，挑選出生時(shí)間在6～24 h之間的幼蚤用于實(shí)驗(yàn)。期間喂食蛋白核小球藻，投餌密度為2.0×105～3.0×105cells·L-1，其他培養(yǎng)條件亦相同。

(3)斑馬魚的培養(yǎng)及胚胎的獲取：將斑馬魚馴養(yǎng)于曝氣自來水中，pH 7.5，溫度(28.5±1) ℃，光暗比為14 h∶10 h，餌料為豐年蝦，每日喂食2次并清理污物。選用魚齡3個(gè)月以上的成魚用于產(chǎn)卵，在繁殖前一天，將雌魚和雄魚以1∶2的比例放入孵化箱中的網(wǎng)兜中，網(wǎng)孔稍大于受精卵大小。設(shè)定好開燈時(shí)間，第2天開燈30 min內(nèi)斑馬魚產(chǎn)卵完成。用胚胎培養(yǎng)水沖洗胚胎，在體視鏡下挑取受精正常的胚胎用于暴露實(shí)驗(yàn)。

(4)費(fèi)氏弧菌的培養(yǎng)及檢測(cè)用菌液制備：無菌條件下，取適量斜面三代菌種接入5 mL液體培養(yǎng)基，在28 ℃、轉(zhuǎn)速250 r·min-1條件下培養(yǎng)12 ～16 h。取活化的菌液100 μL涂布，將平板置于22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約22 h后，用3% NaCl 溶液將菌落洗下并稀釋至約為107cfu·mL-1后作為工作菌液備用。

1.4 試驗(yàn)方法1.4.1 毒性指標(biāo)的測(cè)定

(1)小球藻生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)方法參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)201標(biāo)準(zhǔn)方法[22]，取對(duì)數(shù)期的純種藻液接種到100 mL BG-11培養(yǎng)基中，接種后的初始密度約2×105cells·mL-1。所測(cè)試抗生素設(shè)置8個(gè)濃度組，并設(shè)置空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。經(jīng)測(cè)定OD680nm與藻液密度(105cells·mL-1)線性相關(guān)方程為：Y=81.807 OD680nm，R2=0.9924。分別在24、48、72、96 h，取1 mL藻液測(cè)定吸光度，從而確定其濃度。按照公式(1)、(2)計(jì)算抑制率：

(1)

式中：A為生長(zhǎng)曲線以下的面積；N0為T0時(shí)刻每毫升藻液中的藻細(xì)胞數(shù)；N1為T1時(shí)刻每毫升藻液中所測(cè)得的藻細(xì)胞數(shù)；Nn為Tn時(shí)刻每毫升藻液中所測(cè)得的藻細(xì)胞數(shù)；T1為試驗(yàn)開始后第一次計(jì)數(shù)的時(shí)間；Tn為試驗(yàn)開始后第n次計(jì)數(shù)的時(shí)間。

(2)

式中：IA為每一濃度下藻類細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率(%)；Ac為對(duì)照組生長(zhǎng)曲線所包圍的面積；At為處理組生長(zhǎng)曲線所包圍的面積。

(2)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制試驗(yàn)

費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制試驗(yàn)方法參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization, ISO)11348-1(2009)標(biāo)準(zhǔn)方法[23]，并依據(jù)文獻(xiàn)[24]進(jìn)行適當(dāng)修改；所測(cè)試抗生素用3% NaCl溶液稀釋為9個(gè)濃度組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。取100 μL工作菌液加入到白色96孔板中，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)發(fā)光量，記為I0，然后加入等體積的待測(cè)抗生素溶液，振蕩250 s充分混合均勻，然后在15 ℃的條件下檢測(cè)30 min時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度I。

(3)大型蚤急性毒性試驗(yàn)

大型蚤急性毒性試驗(yàn)方法參照OECD 202標(biāo)準(zhǔn)方法[25]，所測(cè)試抗生素用大型蚤稀釋用水稀釋為7個(gè)濃度組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)容器為50 mL燒杯，每個(gè)容器內(nèi)裝50 mL一定濃度的供試溶液，每一處理放18頭同一母體6～24 h內(nèi)的新生活潑個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)水溫為(20±1) ℃、光暗比為14 h∶10 h，實(shí)驗(yàn)期間不進(jìn)行喂食。24 h試驗(yàn)后觀察大型蚤個(gè)體，大型蚤受抑制的判定是振蕩試驗(yàn)溶液，在15 s內(nèi)無反應(yīng)，記錄受抑制個(gè)數(shù)。

(4)斑馬魚胚胎急性毒性試驗(yàn)

斑馬魚胚胎急性毒性試驗(yàn)方法參照ISO15088(2007)標(biāo)準(zhǔn)方法[26]，選取4細(xì)胞至128細(xì)胞階段下鏡檢正常的受精卵用于染毒實(shí)驗(yàn)，在24孔板中每孔加入6枚受精卵和2 mL受試液，每組放4個(gè)孔，設(shè)置6個(gè)濃度組和1個(gè)對(duì)照組。染毒48 h后出現(xiàn)凝結(jié)、不顯示尾脫離以及未檢出心跳狀況均視為死亡。

上述指標(biāo)的測(cè)定，除大型蚤急性毒性試驗(yàn)外，其他操作均為無菌操作。

1.4.2 聯(lián)合毒性試驗(yàn)方法

在單一毒性的基礎(chǔ)上，按照毒性單位1∶1的配比組成二元混合體系，測(cè)定混合體系對(duì)4種水生生物的聯(lián)合毒性，試驗(yàn)方法和步驟與單一毒性的測(cè)定相同；二元混合物的總濃度為2個(gè)組分濃度之和。采用基于中效原理的中效方程來計(jì)算抗生素單獨(dú)和聯(lián)用的效果[27]，公式如下：

(3)

式中，D是劑量，Dm是產(chǎn)生中度效果的劑量，這是相當(dāng)于有效劑量的中值劑量(EC50)，fa是反應(yīng)系統(tǒng)中的D劑量的有效部分，fu=1-fa，m是劑量-效應(yīng)曲線的系數(shù)。

根據(jù)定義，方程(3)可以變形為公式(4)

(4)

對(duì)于不同效應(yīng)下的聯(lián)合指數(shù)CI根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算[14]：

(5)

采用CA、IA和CI模型對(duì)聯(lián)合毒性作用進(jìn)行預(yù)測(cè)。CA模型是基于混合體系中的所有物質(zhì)都是通過相似的作用方式而產(chǎn)生效應(yīng)這一假設(shè)的，適用于相似聯(lián)合作用[9]，按照公式(6)來計(jì)算：

(6)

式中，ECx,i為混合物中i組分單獨(dú)產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)的濃度；ECx,mix為產(chǎn)生效應(yīng)x%的混合物濃度；Pi為i組分的濃度占混合物濃度的百分比；n為混合物組分?jǐn)?shù)。

IA模型則適用于獨(dú)立聯(lián)合作用，即指混合物中各組分產(chǎn)生的效應(yīng)獨(dú)立于其他的，作用形式也不同[9]。其公式如下：

(7)

式中，E(Cmix)為包含n個(gè)組分的混合物在濃度為Cmix(Cmix=C1+,…,+Cn)時(shí)所產(chǎn)生的效應(yīng)，E(Ci)為混合物中組分i在濃度為Ci時(shí)單獨(dú)產(chǎn)生的效應(yīng)。

CI模型采用如下公式計(jì)算[14]：

(8)

式中，CIxcomp為各個(gè)組分產(chǎn)生x%效應(yīng)的聯(lián)合指數(shù)，其按照公式(5)計(jì)算。

1.4.3 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

為了評(píng)估抗生素在水體中對(duì)生態(tài)環(huán)境的不良影響，根據(jù)歐盟的技術(shù)指導(dǎo)文件(TGD)[29]采用危險(xiǎn)商值(HQs)對(duì)潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，HQs是通過預(yù)測(cè)或檢測(cè)的環(huán)境濃度(PEC或MEC)與預(yù)測(cè)的無效濃度(PNEC)值進(jìn)行計(jì)算的，運(yùn)用公式(9)進(jìn)行計(jì)算[9]：

(9)

其中PNEC是基于生物毒性實(shí)驗(yàn)來計(jì)算，表達(dá)式如下：

(10)

式中，EC50值采用本試驗(yàn)3種抗生素及其二元混合物對(duì)4種模式生物的中效值；AF(評(píng)價(jià)因子)為1 000(對(duì)于單營(yíng)養(yǎng)級(jí)急性毒性試驗(yàn))。

對(duì)于混合物的危險(xiǎn)商值，多采用公式(11)計(jì)算[3]：

(11)

式中，HQi表示單一抗生素的危險(xiǎn)商值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

采用SPSS 23和Origin 8.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用CalcuSyn軟件求出藥物單用和聯(lián)用時(shí)的有關(guān)參數(shù)、聯(lián)合指數(shù)(CI)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 單一毒性及敏感性比較

用CalcuSyn軟件計(jì)算出單一抗生素對(duì)模式生物的EC50值和95%置信限[9]，結(jié)果如表1所示?？股氐亩拘苑旨?jí)采用我國(guó)環(huán)境保護(hù)行業(yè)保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則》[30](HJ/T 154—2004)：極高毒(EC50，≤1 mg·L-1)，高毒(EC50，1～10 mg·L-1)，中毒(EC50，10～100 mg·L-1)，低毒(EC50，>100 mg·L-1)。

由表1可知不同模式生物對(duì)同種抗生素敏感性不同(小球藻>斑馬魚胚胎>費(fèi)氏弧菌>大型蚤)；不同抗生素同樣對(duì)同種模式生物的毒性亦有差異，OTC對(duì)4種模式生物的毒性最大，其對(duì)小球藻極高毒；對(duì)于SMZ，費(fèi)氏弧菌和大型蚤的EC50值分別為85.72 mg·L-1和188.00 mg·L-1，這與Kim等[31]報(bào)道的結(jié)果十分接近(78.1 mg·L-1和189.2 mg·L-1)；至于FF對(duì)非靶生物的生態(tài)毒理學(xué)研究甚少，李霞[32]對(duì)小球藻和隆線蚤進(jìn)行急性毒性測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)FF對(duì)2種生物毒性分別表現(xiàn)為高毒和低毒，這與本文的研究結(jié)果一致；對(duì)于斑馬魚胚胎和大型蚤，測(cè)試抗生素均分別表現(xiàn)出中毒和低毒；至于費(fèi)氏弧菌，SMZ和OTC表現(xiàn)出中毒，F(xiàn)F則表現(xiàn)出低毒，抗生素并未對(duì)費(fèi)氏弧菌表現(xiàn)很強(qiáng)的毒性，Isidori等[33]解釋為費(fèi)氏弧菌短時(shí)間(5～30 min)暴露在藥物的情況下，藥物對(duì)其生物合成途徑影響有限，選擇24 h暴露時(shí)間毒性作用效果會(huì)更加明顯。

2.2 聯(lián)合毒性的評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)2.2.1 抗生素聯(lián)合毒性相互作用

在得到抗生素單一和聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過聯(lián)合指數(shù)法來量化不同效應(yīng)或濃度水平下抗生素之間的作用方式[34]。表2表示二元抗生素相互作用的劑量效應(yīng)關(guān)系參數(shù)Dm即EC50、m、r值及不同效應(yīng)水平下(EC10，EC50，EC90)聯(lián)合指數(shù)CI平均值，聯(lián)合指數(shù)CI與效應(yīng)fa的關(guān)系如圖1所示。

大體上，3種二元混合物組合對(duì)水生生物的毒性作用以拮抗效應(yīng)為主。例如，OTC-FF組合在不同濃度下對(duì)4種模式生物均表現(xiàn)拮抗效應(yīng)；叢永平等[35]也觀測(cè)到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，OTC-FF二元混合物

表1 單一抗生素對(duì)4種模式生物的毒性終點(diǎn)值Table 1 Acute median effective concentrations of the test pharmaceuticals

注：SMZ、OTC、FF為磺胺甲惡唑、土霉素和氟苯尼考。

Note: SMZ, OTC, FF stand for sulfamethoxazole, oxytetracycline and florfenicol.

圖1 二元抗生素組合的聯(lián)合指數(shù)圖注：SMZ-OTC(-■-)，SMZ-FF(-●-)，OTC-FF(-▲-)。Fig. 1 Combination index plot (fa-CI plot) for binary combinations of SMZ, OTC and FFNote: SMZ-OTC(-■-)，SMZ-FF(-●-)，OTC-FF(-▲-).

模式生物Model organism二元混合物Binary mixtures劑量反應(yīng)參數(shù)Dose-response parameterCI值CI valuesEC50/(mg·L-1)mrEC10EC50EC90蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosaSMZ-OTC9.010.500.966857.39Ant10.26Ant3.88AntSMZ-FF9.680.400.9780.06Syn1.01Add19.64AntOTC-FF3.110.200.8811.55Ant11.83Ant1 727.17Ant費(fèi)氏弧菌Vibrio fischeriSMZ-OTC157.120.730.9901.06Add2.35Ant5.74AntSMZ-FF134.990.480.9780.90Add1.26Ant9.90AntOTC-FF123.880.660.9643.68Ant1.40Ant1.74Ant斑馬魚胚胎Zebrafish embryoSMZ-OTC54.541.240.9981.91Ant1.10Add0.64SynSMZ-FF129.371.040.9822.93Ant2.26Ant1.74AntOTC-FF137.811.030.9812.99Ant2.48Ant2.07Ant大型蚤Daphnia magnaSMZ-OTC140.361.330.9020.51Syn0.77Syn1.17AntSMZ-FF265.541.680.9740.96Add1.23Ant1.64AntOTC-FF221.691.450.95010.93Ant49.77Ant226.54Ant

注：協(xié)同、相加和拮抗作用分別用Syn, Add和Ant英文縮寫表示。

Note: Syn, Add, Ant stand for synergism, additive effect and antagonism.

對(duì)明亮發(fā)光桿菌的毒性作用呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)。OTC與FF常作為主要漁藥被使用，二者可能會(huì)因此在水體中共存對(duì)水生生物造成潛在危害。OTC與FF在DNA和RNA水平上具有相似的作用方式[36]，2種抗生素在不同階段抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[37]，因此有研究將OTC與FF之間作用關(guān)系解釋為協(xié)同或相加[38]；然而，當(dāng)藥物釋放到水環(huán)境中時(shí)其作用于非靶標(biāo)生物的作用機(jī)理可能會(huì)不同于靶生物[39]。聯(lián)合指數(shù)僅僅只是量化了協(xié)同或拮抗效應(yīng)，對(duì)于協(xié)同或拮抗作用機(jī)理的闡述是需要不同的方法去解決的單獨(dú)問題[39]；例如，F(xiàn)u等[40]用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)研究了OTC和FF對(duì)綠藻的作用機(jī)制。但是，目前還未有關(guān)于OTC與FF聯(lián)合作用于非靶標(biāo)生物的機(jī)理解釋。此外，SMZ-OTC、SMZ-FF組合在對(duì)費(fèi)氏弧菌和大型蚤的聯(lián)合毒性效果上表現(xiàn)出一定的相似性，即在低效應(yīng)情況下表現(xiàn)出協(xié)同或相加作用，高效應(yīng)下表現(xiàn)出拮抗作用；這也說明聯(lián)合毒性效果會(huì)隨著效應(yīng)水平的不同產(chǎn)生變化。

圖2 二元抗生素混合物對(duì)4種模式生物的濃度-效應(yīng)曲線和模型預(yù)測(cè)曲線Fig. 2 Experimental toxicity values (Exp) and predicted dose-response curves of the binary mixtures of the three chemicals based on concentration addition (CA), independent action (IA), and combination index (CI) models for the four aquatic organisms acute toxicity test

2.2.2 3種聯(lián)合毒性預(yù)測(cè)模型的比較

應(yīng)用CA、IA和CI這3個(gè)模型分別預(yù)測(cè)等毒性濃度比抗生素混合物對(duì)4種水生生物的聯(lián)合毒性?；旌衔锏挠^測(cè)濃度-效應(yīng)散點(diǎn)圖，CA、IA和CI預(yù)測(cè)的濃度-效應(yīng)曲線均繪于圖2，圖2由上至下分別對(duì)應(yīng)蛋白核小球藻、費(fèi)氏弧菌、斑馬魚胚胎、大型蚤。

從圖2可以看出，CI模型預(yù)測(cè)的數(shù)值大體上接近觀測(cè)值。而當(dāng)CI指數(shù)值與1偏差較大時(shí)，CA、CI模型的預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值均發(fā)生了明顯的偏離，這說明組分之間發(fā)生了相互作用，高于觀測(cè)值認(rèn)為是拮抗作用，反之為協(xié)同作用[7]。當(dāng)CI指數(shù)值與1接近時(shí)(相加作用)，如SMZ-OTC、SMZ-FF二元混合物對(duì)大型蚤的毒性作用，CA和IA模型也能較好地預(yù)測(cè)聯(lián)合毒性相互作用；這也說明傳統(tǒng)CA和IA模型適合預(yù)測(cè)藥物不發(fā)生相互作用的相加作用，但在準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藥物發(fā)生相互作用的聯(lián)合毒性作用上有缺陷，而CI模型能夠克服這一點(diǎn)[16,41]。

2.3 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)2.3.1 單一抗生素的最大生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

被選擇的3種抗生素在上海地區(qū)河流和排放廢水中檢出含量如表3所示，圖3表示上海地區(qū)不同水體中3種主要抗生素對(duì)4個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的水生生物(蛋白核小球藻、費(fèi)氏弧菌、斑馬魚胚胎和大型蚤)的最大危險(xiǎn)商值圖(MEC取水體中最大抗生素濃度)。生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)分為三級(jí)：當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)商值0.01≤HQ<0.1時(shí)意味著低度風(fēng)險(xiǎn)(low risk)；當(dāng)0.1≤HQ<1.0時(shí)意味著中度風(fēng)險(xiǎn)(moderate risk)；當(dāng)HQ≥1.0時(shí)意味著高度風(fēng)險(xiǎn)(high risk)[42]。

從圖3可以看出，目標(biāo)抗生素對(duì)蛋白核小球藻的危害性最大，而OTC最甚。相比之下，對(duì)于其他3種受試生物，除養(yǎng)殖廢水處的風(fēng)險(xiǎn)程度表現(xiàn)出高度風(fēng)險(xiǎn)性外，其他3處水體均表現(xiàn)出低度風(fēng)險(xiǎn)或無風(fēng)險(xiǎn)。這表明除蛋白核小球藻外，其他水生生物所測(cè)試指標(biāo)對(duì)目標(biāo)抗生素的指示作用并不明顯，但由于生物毒性蓄積作用，仍不能排除潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，也說明養(yǎng)殖廢水的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性遠(yuǎn)高于其他3處水體，原因可能是由于養(yǎng)殖戶對(duì)抗生素的過量使用造成的，而目前我國(guó)對(duì)抗生素的使用沒有明確的政策規(guī)定，因此使得未經(jīng)代謝的殘余抗生素直接排入水體而并未進(jìn)行有效的處理，這導(dǎo)致養(yǎng)殖廢水中抗生素含量偏高[4,18]；然而，養(yǎng)殖廢水是抗生素污染的重要來源，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于抗生素污染特征的研究偏重于河流、河口灣和污水處理廠等水環(huán)境，而對(duì)養(yǎng)殖區(qū)抗生素污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估較少[43]，這需要進(jìn)一步的調(diào)查和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2.3.2 三元抗生素混合物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

單一抗生素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)表明，蛋白核小球藻具有很好的風(fēng)險(xiǎn)指示作用，因此選用其對(duì)抗生素三元混合物進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。采用檢出濃度的最大值、平均值和最小值來進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，這樣更接近實(shí)際情況?？股鼗旌衔锏奈ｋU(xiǎn)商值圖如圖4所示，首先可以看出養(yǎng)殖廢水對(duì)蛋白核小球藻具有極高風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樵跈z出濃度最小的情況下仍具有高風(fēng)險(xiǎn)，從表3看出這種風(fēng)險(xiǎn)居高不下主要是養(yǎng)殖廢水中高濃度的OTC導(dǎo)致的。因此要降低養(yǎng)殖廢水的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)影響必須對(duì)OTC進(jìn)行處理后排放。此外，抗生素混合物在檢出濃度平均值下的危險(xiǎn)商值在長(zhǎng)江口處接近0.1即中風(fēng)險(xiǎn)，在其他3處均表現(xiàn)出高風(fēng)險(xiǎn)。然而，這是未考慮抗生素相互作用下的風(fēng)險(xiǎn)情況；從圖1可以看出SMZ-FF、OTC-FF組合在低劑量下對(duì)小球藻表現(xiàn)為協(xié)同作用或呈現(xiàn)該趨勢(shì)。有研究表明二元混合物的相互作用主導(dǎo)了三元或多元混合物的作用方式[37,39]，因此二元混合物之間的協(xié)同作用可能會(huì)使得三元混合物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加；目前，將非相加性相互作用數(shù)據(jù)用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的可行方法是“二元證據(jù)權(quán)法”(Binary Weight of Evidence)[48]。Marx等[49]應(yīng)用該方法發(fā)現(xiàn)如果忽略抗生素之間的協(xié)同作用，會(huì)低估50%～200%的風(fēng)險(xiǎn)，這相當(dāng)于聯(lián)合指數(shù)CI從0.75到0.5所表現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)。然而，該方法的主要限制是二元混合物轉(zhuǎn)換到多元混合物的關(guān)鍵參數(shù)的不確定性[48]。

表3 上海地區(qū)水體中3種主要抗生素的檢出濃度(ng·L-1)Table 3 The contamination level of three main antibiotics in the waters of Shanghai area (ng·L-1)

圖3 基于上海地區(qū)水體中檢出抗生素最大濃度計(jì)算出的危險(xiǎn)商值圖注：S1 黃浦江；S2 長(zhǎng)江口；S3 養(yǎng)殖廢水；S4 工廠廢水。Fig. 3 Figure based on the calculated risk quotients for the three antibiotics in the waters of Shanghai areaNote: S1, Huangpu River; S2, Yangtze estuary; S3, Aquaculture wastewater; S4, Plant effluent.

圖4 基于上海地區(qū)水體中檢出抗生素濃度計(jì)算出的抗生素混合物危險(xiǎn)商值圖注：S1 黃浦江；S2 長(zhǎng)江口；S3 養(yǎng)殖廢水；S4 工廠廢水。Fig. 4 Figure based on the calculated HQ for the mixture of three antibiotics in the waters of Shanghai areaNote: S1, Huangpu River; S2, Yangtze estuary; S3, Aquaculture wastewater; S4, Plant effluent.

綜上所述：

(1)根據(jù)單一急性毒性測(cè)試結(jié)果，4種模式生物對(duì)抗生素的敏感性差異顯著，敏感性：蛋白核小球藻>斑馬魚胚胎>費(fèi)氏弧菌>大型蚤。目標(biāo)抗生素中，OTC最具毒性，其對(duì)蛋白核小球藻具極高毒性。

(2)聯(lián)合指數(shù)CI分析結(jié)果顯示在效應(yīng)EC10至EC90之間，二元混合藥物之間多以拮抗作用為主；此外，隨著抗生素濃度的變化，抗生素之間的作用效果亦隨之變化；低濃度下，部分抗生素組合對(duì)模式生物表現(xiàn)出協(xié)同作用或趨勢(shì)。通過與傳統(tǒng)模型CA、IA的預(yù)測(cè)效果比較，發(fā)現(xiàn)CI模型更加貼近觀測(cè)值，說明CI模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抗生素混合物非相加性相互作用方式，并且通過CI指數(shù)量化作用程度。

(3)通過對(duì)上海不同水體中主要抗生素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖廢水對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的水生生物均有較高的風(fēng)險(xiǎn)性，這主要是養(yǎng)殖廢水中OTC濃度過高所致；此外，相比其他營(yíng)養(yǎng)級(jí)模式生物，蛋白核小球藻對(duì)不同水體均有很好的風(fēng)險(xiǎn)指示作用。并以小球藻作為指示生物進(jìn)行抗生素混合物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示在抗生素檢出平均濃度下，長(zhǎng)江口水體表現(xiàn)出中度風(fēng)險(xiǎn)，其他水體均表現(xiàn)出高度風(fēng)險(xiǎn)。如果考慮抗生素之間的相互作用，風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)繼續(xù)升高。