秦珊，張璐璐,2,*，崔建升,2，李雙江,2

1. 河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，石家莊 050018 2. 河北省污染防治生物技術實驗室，石家莊 050018

湖泊生態(tài)系統服務功能對社會經濟可持續(xù)發(fā)展極其重要[1]。但近年來，隨著工農業(yè)迅速發(fā)展，導致湖泊生態(tài)系統中持久性有機污染程度增加[2]。其中，多環(huán)芳烴(PAHs)作為一類重要的持久性有機化合物，具有分布范圍廣、持久性強、遠距離運輸能力、以及致癌、致畸、致突變性等特點而廣泛受到關注[3]，美國環(huán)境保護局(USEPA)將16種PAH化合物作為優(yōu)先控制污染物。在中國，湖泊生態(tài)系統中的多環(huán)芳烴污染逐漸受到關注[4-6]。

當進行大量、大規(guī)模的樣品分析時，需運用化學分析方法。但運用傳統化學分析方法來檢測環(huán)境介質(如水和沉積物)中的PAHs濃度，雖然可直接揭示環(huán)境中PAHs污染狀況，但該方法不能建立PAHs污染與生物個體、種群、群落和生態(tài)系統之間生態(tài)效應的量化關系[7-8]。因此，需要構建一種有效的方法來建立PAHs污染水平與生物生態(tài)效應之間的量化關系[9-14]。與傳統的理化分析方法相比，基于生物指示物的生態(tài)監(jiān)測方法具有靈敏度高，整合度好，實用性強等優(yōu)點[15]。生態(tài)監(jiān)測方法主要是基于生物指示物來監(jiān)測和記錄生物對環(huán)境變化的響應。這些生物指示物包括魚[16]、植物[17]、硅藻[18]、大型水生植物[19]、浮游植物[20]、鳥[21]、大型底棲生物[22]、底棲藻類[23]和其他物種[24]。

其中，底棲藻類在淺水湖泊生態(tài)監(jiān)測中具有許多優(yōu)勢：它具有分布廣；作為食物網的主要初級生產者[25-26]，在物質循環(huán)中發(fā)揮重要作用；對環(huán)境變化極其敏感[27-28]。目前，自然環(huán)境中有關短期多環(huán)芳烴污染對底棲藻類群落的生態(tài)影響關注較少。此外，在PAHs生態(tài)效應評估中，需考慮湖泊富營養(yǎng)化水平，有研究結果表明，營養(yǎng)水平可能會影響污染物的生物有效性與遷移轉化過程，污染水平也可能通過影響初級生產者進而間接影響富營養(yǎng)化狀況。因此，本研究選取底棲藻類作為生物指示物[29]，構建富營養(yǎng)化條件下PAHs生態(tài)效應的評估方法。本研究目的為：(1)白洋淀多環(huán)芳烴生態(tài)風險評估；(2)基于底棲藻類群落的綜合生物反應指數(The Integrated Biomarker Response，IBR)計算；(3)建立PAHs生態(tài)風險指數與IBR之間的相關關系。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 湖泊的物理和化學特性1.1.1 白洋淀的物理特征

白洋淀(38°44′～38°59′N，115°45′～116°06′E)地處我國河北省保定市(圖1)，面積約有366 km2。近10年來，由于人口數量的迅速增長和經濟快速發(fā)展，白洋淀流域受人為干擾影響強烈。府河是白洋淀現今唯一的流入源，但府河作為保定市的城市排污河，會將含有大量污染物的城市污水匯入白洋淀。此外，淀區(qū)的生活污水、水產養(yǎng)殖、農業(yè)的非點源污染的過量營養(yǎng)物質直接排入到湖泊中，致使白洋淀湖泊呈中度營養(yǎng)-富營養(yǎng)狀態(tài)，對湖泊生態(tài)系統健康有嚴重的負面影響。本研究選取8個國控點作為采樣點，將采樣點劃分為3類生境：生境1為主要遭受城市污水(S1和S2)影響；生境2為主要遭受水產養(yǎng)殖和生活污水影響(S3、S6和S8)，生境3為遭受人為干擾較少(S4、S5和S7)。采樣時間由底棲藻類群落的發(fā)展情況而定，分別于2009年6月下旬、8月下旬、11月初采集底棲藻類樣品。

圖1 白洋淀采樣點分布圖注：S1-府河入淀口，S2-南劉莊，S3-王家寨，S4-燒車淀，S5-棗林莊，S6-圈頭，S7-采蒲臺，S8-端村。Fig. 1 The sampling sites for Baiyangdian LakeNote: S1-Fuhe Inlet，S2-Nanliuzhuang，S3-Wangjiazhai，S4-Shaochedian，S5-Zaolinzhuang，S6-Quantou，S7-Caiputai，S8-Duancun.

1.1.2 水和沉積物的物理化學特征

用低密度聚乙烯容器采集5個4 L湖水樣品，適當地過濾(0.2 μm過濾器)，在采樣地和實驗室冷卻保存直至分析，在現場直接測量水深(WD)、溫度(T)、pH和溶解氧(DO)。根據標準方法(CBEP—2002)測定氨氮(NH4-N)、化學需氧量(CODMn)、生化需氧量(BOD5)和其余水質參數。用碳分析儀測定總有機碳(TOC)。通過NH4-N、CODMn、BOD5和DO實測值歸一化和求和來計算營養(yǎng)狀態(tài)指數(TSI)[30-31]。除溫度和pH值外，白洋淀中其余水體理化參數的均值均超出地表水標準(GB 3838—2002) (表1)。

將沉積物樣品用聚乙烯塑封袋包裝、封口標記、冷藏并送至實驗室分析。將干燥后的樣品轉移至玻璃盤中，篩選去除石塊、木屑、動植物殘體等異物，用聚乙烯袋保存?zhèn)溆谩３练e物樣品用木制滾筒研磨，直到細顆粒<0.149 mm。pH測量使用玻璃pH電極測量[32]。TN和TP按照標準方法(GB 7173—1987和GB 9387—1988)測定。土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀法測定[33]，總有機碳(TOCs)、溶解性有機碳(DOC)、有機質(OM)和腐殖質(Hu)根據相關標準方法進行測定(GB 9834—1988，GB 7857—1987和GB 7858—1987)(表2)。

1.1.3 白洋淀中多環(huán)芳烴濃度

將采集的沉積物樣品放入冷凍干燥機中冷凍干燥并研磨成粒狀粉末，通過100目尼龍篩網。依據美國環(huán)境保護局(USEPA)3545(加壓流體萃取)、3630C(硅膠凈化)和3660B(硫清除)的改進方法提取沉積物中多環(huán)芳烴。將搗碎的樣品與無水硫酸鈉以5:1的質量比進行混合，再與活化銅片以約1:1的比例混合，使得提取物脫硫。在125 ℃的溫度和1 500 psi的壓力下，用正己烷：二氯甲烷(1:1體積比)的加速溶劑并用快速溶劑萃取儀(ASE300，Dionex，Sunnyvale，CA)萃取10 min后提取混合物(2個靜態(tài)循環(huán))，用旋轉蒸發(fā)器將提取物濃縮至約2 mL，通過裝有無水硫酸鈉的硅膠柱純化，再用10 mL正己烷溶劑沖洗柱子去除非PAHs雜質。然后用15 mL二氯甲烷和正己烷(1:1，V/V)的混合溶劑洗脫，收集含有PAHs的第二洗脫液并使用旋轉蒸發(fā)器濃縮。最后在容器中，運用氮氣將流出物減少至0.5 mL左右，并通過正己烷調節(jié)至1.0 mL用于GC-MS分析。按順序檢測出15種PAHs分別是：萘(Nap)、Ace-萘(Acy)、苊(Ace)、芴(Flo)、菲(Phe)、蒽(Ant)、熒蒽(Fla)、芘(Pyr)、苯并(a)蒽(BaA)、苯并(b)熒蒽(BbF)、苯并[k]芴(BkF)、苯并[a]芘(BaP)、茚并[1,2,3-cd]芘(IcdP)、二苯并[a，h]蒽(DahA)、苯并[ghi]苝(BghiP)。其中PAHs濃度如表3所示。

表1 白洋淀不同時空水體主要理化參數(平均值)Table 1 Time course (mean values) of water chemical and physical attributes at the different habitats for the Baiyangdian Lake

表2 白洋淀不同時空沉積物主要理化參數(平均值)Table 2 Time course (mean values) of sediment chemical and physical attributes at the different habitat for the Baiyangdian Lake

表3 白洋淀不同時間和生境沉積物中15種重要PAHs含量(平均值，ng·g-1)Table 3 Time course (mean values, ng·g-1) of sediment 15 priority PAHs at the different habitat for the Baiyangdian Lake

續(xù)表3種類Types生境Habitat2009年4月April-20092009年8月August-20092009年11月November-2009ΣPAHs1846.80922.90770.702441.88527.70478.503414.33413.10377.30

1.2 白洋淀底棲藻類收集與指標分析

1.2.1 底棲藻類收集

為了收集底棲藻類樣品，將3個由碳纖維(長10 cm，寬2 cm)組成的采集裝置分別垂直固定在各采樣點蘆葦床附近水面下20 cm處，于湖水中暴露21 d。采集到的底棲藻類用0.2 μm濾膜過濾后的樣點水懸浮，其中一份加入5%甲醛固定，用于底棲藻類鑒定；其余所有樣品用冰盒保存并帶回實驗室分析。分別取3份底棲藻類平行樣品，2 mL蒸餾水懸浮，然后用孔徑為0.2 μm的玻璃纖維膜過濾，稱重，105 ℃干燥24 h后稱重，在500 ℃馬弗爐內烘干1 h后稱量樣品灰，計算無灰干重，計算結果以g·m-2為單位[31]。

1.2.2 底棲藻類指標分析

使用生長在碳纖維上的底棲藻類樣品用于屬性測定分析(TK-1600，江蘇同康活性炭纖維有限公司；比表面積：1 450～1 550 m2·g-1；孔徑：18～21 ?。用于測定結構(葉綠素、無灰干重、藻密度和多糖含量)和功能屬性(胞外酶活性)的樣品在黑暗的冷卻箱中運送到實驗室。用于測定葉綠素和多糖含量的樣品保持冷凍直至分析。測定無灰干重(AFDW)、葉綠素濃度、多糖含量(PSC)、胞外酶活性、藻密度和成分的分析計算方法[31]列于表4中。

1.3 綜合生物反應指數(IBR)計算

1.3.1 計算方法

為了計算綜合生物反應指數(表5)，計算不同時空條件下的IBR值[34]，步驟如下：(1)計算各個采樣點生物標志物(X)的平均值和標準偏差(SD)；(2)生物標志物數據標準化：Y=(X-平均值)/ SD，其中X是每個采樣點生物標志物值，平均值是所有采樣點生物標志物的平均值，SD是標準偏差；(3)在應對激活或抑制的生物學效應的情況時，Z = Y或Z = -Y。選取采樣點中每個生物標志物的最小值加到Z中；(4)標準分數(S)計算公式為S = Z + | Min |，其中S≥0并且取| Min |絕對值。

由于所有生物標志物都以上述方式處理，因此可使用星圖來顯示生物標志物結果，其中半徑坐標(Si)表示給定生物標志物在特定位置的得分，星圖的面積根據公式獲得[34]：

(1)

其中，Ai是順時針順序連接星圖的第i個和第(i+1)個半徑坐標的個體區(qū)域；Si和Si+1是標準生物標志物得分，第i個和第(i+1)個星圖半徑坐標；n是調查中生物標志物的數量。

1.3.2 底棲藻類群落的IBR計算

表5中給出了生物標志物的平均值、每個生物標志物的總體平均值和標準差值。利用該表給出的2009年4月生境1的數據計算生境1的綜合生物反應指數值(表6)并按數據的結果繪圖(圖2)。 然后計算相應IBR值：IBR04/2009H1 = A1 + A 2+ A3 + A4 + A5 +A6 + A7 + A8 + A9 + A10 + A11 + A 12= 7.64，其中A1 =(S1S2)/2=0.03，A2 = 0.03，A3 = 0.57，A4 = 0.87，A5 = 1.45，A6 = 3.28，A7 = 0.72 ，A8 = 0.04，A9 = 0.03，A10 = 0.19，A11 = 0.22，A12 = 0.21。

1.4 多環(huán)芳烴生態(tài)風險評估

為了評估白洋淀中PAHs潛在的生態(tài)風險，本研究將沉積物中檢測到的PAHs含量與其相應的質量值進行比較[35]，風險熵(RQ)表征部分PAHs的風險水平，計算公式如下：

圖2 2009年4月H1生物標志物星圖Fig. 2 Examples of a biomarker star plot for station H1 in April 2009

表4 底棲藻類群落指標計算方法Table 4 The ecological metrics for IBR based on periphyton community

表5 白洋淀不同時空底棲藻類結構和功能指標(平均值)Table 5 Time course (mean values) of periphyton structural and functional metrics at the different habitat for the Baiyangdian Lake

表6 2009年4月白洋淀的H1的IBR計算實例Table 6 The score for IBR of station H1 in the Baiyangdian Lake, April 2009

(2)

其中CPAHs是介質中部分PAHs的濃度；CQV是介質中部分PAHs的質量值[35]。

以上方法只能評估9種PAHs的生態(tài)風險，為了能夠評估其他6種PAHs的生態(tài)系統風險，本研究采用單個PAHs的毒性等效因子(TEFs)[36]來推斷Acy、Ace、Flo、Pyr、BbF和DahA的NC和MPC值(表7)。根據此前的方法，RQΣPAHs、RQΣPAHs(NCs)和RQΣPAHs(MPCs)定義如下：

(3)

(4)

(5)

圖3 白洋淀各采樣點單一生物標志物星狀圖注：AP-H1、AP-H2、AP-H3，AU-H1、AU-H2、AU-H3，NO-H1、NO-H2、NO-H3表示2009年4月、8月、11月的3種生境。Fig. 3 Station star plots for each biomarker and survey in the Baiyangdian LakeNote: AP-H1, AP-H2, AP-H3; AU-H1, AU-H2, AU-H3; NO-H1, NO-H2, NO-H3 stand for Habitat 1, Habitat 2, Habitat 3 studied in April, August, November 2009.

基于對16種PAHs的生態(tài)風險評估，總和大于1的PAHs的RQ(NCs)和RQ(MPCs)，計算出ΣPAHs的RQΣPAHs(NCs)和RQΣPAHs(MPCs)。

1.5 統計分析

為了建立多環(huán)芳烴生態(tài)風險與綜合生物反應指數之間的相關關系，本研究采用Pearson(SPSS 16.0)相關分析非正態(tài)分布數據，顯著性水平表示為P<0.05，P<0.01或P<0.001[37]。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 白洋淀理化參數

在2009年4月—11月，3個生境中水溫(T)的變化范圍為17.50 ～29.50 ℃，僅存在輕微的季節(jié)變化；而pH值相對穩(wěn)定。就空間變化而言，WD、透明度(Trans)和TOC在生境1中相對較低，而TSI、TN和TP在生境1中相對較高。表2中數據表明，在空間分布上沉積物主要理化參數也存在顯著空間差異，生境1中所有的指標都高于生境2和3。

2.2 底棲藻類IBR2.2.1 單一生物標志物時空變化

從底棲藻類群落指標的季節(jié)變化而言，AD、Chl a、Chl b/a、CHL、CYA、APA、GLU、LEU、PSC和AFDW的值在11月最高，其次是8月和4月；就空

間分布特征而言，這些指標值在生境1中最高。而Chl c/a和BAC的值在8月最高，其次是11月和4月，從空間分布特征而言，Chl c/a和BAC指標值在生境3最高(圖3)。相關分析的結果表明Chl a、Chl b/a、CHL、CYA、APA、GLU、LEU、PSC和AFDW的指標與PAHs污染物濃度呈顯著正相關，而Chl c/a和BAC指標與污染物PAHs濃度呈顯著負相關(表3)。

2.2.2 不同生物標志物的時空變化

從白洋淀生物標志物星圖(圖4)可以發(fā)現在4月，星狀圖面積最大值出現在生境3(H3)，生境1(H1)和生境2(H2)的面積相對較低。在8月和11月生境1的星狀圖面積大于生境2和生境3。

表8 每個樣點和調查的綜合生物標志物響應(IBR)Table 8 Integrated biomarker response (IBR) for each station and survey

圖4 白洋淀各采樣點不同生物標志物星狀圖Fig. 4 All biomarker star plots for station and survey in the Baiyangdian Lake

表9 白洋淀不同時間和生境中15種PAHs生態(tài)風險(平均值)Table 9 Time course (mean values) of ecological risk for 15 PAHs at the different habitats for the Baiyangdian Lake

2.2.3 IBR比較

白洋淀各采樣點綜合生物反應指數值見表8。結果表明：在4月、8月和11月，生境1的IBR值高于生境2和生境3；生境1的IBR最高值出現在8月，表明其活躍度較高。在4月、8月和11月，生境3的活躍程度低于生境1和生境2，但生境1的最大面積表明其生物指標值始終最高。

2.3 白洋淀多環(huán)芳烴生態(tài)風險評估2.3.1 多環(huán)芳烴濃度時空變化

白洋淀沉積物中15種主要PAHs(ΣPAHs)的濃度范圍為377.30～922.90 ng·g-1。就空間分異特征而言，生境1中的ΣPAHs濃度最高，表明人為干擾程度直接影響PAHs的空間分布。就季節(jié)變化而言，PAHs的濃度從4月到8月逐漸增加，而從8月到11月逐漸下降。各類PAHs表現出與ΣPAHs相同的時空變化特征(表3)。除BbF、Bap、IcdP和BghiP外，大部分PAHs具有顯著相關性(r=0.681～0.991)，這一現象可以用PAHs在地球化學和人為污染的不同來源解釋。

2.3.2 白洋淀PAHs生態(tài)風險時空變化

不同時空條件下RQ(NCs)和RQ(MPCs)值見表9。結果表明：BaA、BbF、BaP和IcdP是RQΣPAHs(NCs)的主要貢獻者，但在不同時空條件下仍存在差異。RQΣPAHs(NCs)的時空變化趨勢與人為干擾程度直接相關，而RQΣPAHs(MPCs)在時空分布上無顯著差異(表10)。

2.4 白洋淀PAHs生態(tài)風險與底棲藻類IBR的相關性分析

本研究旨在建立底棲藻類IBR與ΣPAHs生態(tài)風險間可能存在的相關性。IBR與RQΣPAHs(NCs)均呈現顯著的時空分異規(guī)律，運用Pearson相關性分析，結果見表10。IBR與RQΣPAHs(NCs)呈正相關關系(r=0.827，P<0.01)；除RQAcy(NCs)外，其他種類PAHs生態(tài)風險均與IBR呈正相關關系(r=0.699～0.899)，其中RQBaP(NCs)與IBR顯著正相關(r=0.899，P<0.01)。此外，除沉積物TP外，IBR與TSI、水中TN、水中TP和沉積物TN也呈顯著正相關(r=0.722～0.862)。因此，在富營養(yǎng)化湖泊中應考慮運用底棲藻類IBR進行生態(tài)監(jiān)測PAHs污染水平。

2.5 底棲藻類群落指標與污染物毒性相關性研究

底棲藻類在水生態(tài)系統中作為主要的初級生產者，因此在營養(yǎng)循環(huán)和化學物質遷移轉化過程中發(fā)揮重要的作用[38]。由化學物質引起的底棲藻類群落結構變化可以揭示污染物對生物群落的間接效應，而這些間接效應無法通過對單一物種的毒性測試獲取，因此底棲藻類群落在群落尺度下的生態(tài)毒理學研究中具有極其重要的特征[39]。Guash等[40]的研究結果表明，底棲藻類暴露在三氯生中會導致生產力下降，因為三氯生的毒性會抑制藻類被攝食后的再次生長和群落生物多樣性下降。在這些綜合因素的協同作用下，污染物的毒性效應可能會通過捕食壓力的變化而放大對群落結構和生態(tài)系統功能(如：初級生產和營養(yǎng)循環(huán))的影響。Pandey等[41]的研究結果表明，由于底棲藻類細胞內可以富集重金屬(Cu, Zn和Pb)，進而抑制細胞生長，減少細胞數量，并增加硅藻的細胞膜變異，因此底棲藻類群落中硅藻細胞膜的形態(tài)變異可以作為監(jiān)測河流中重金屬污染的生態(tài)指標。

生物群落已廣泛應用于持久性有機污染物的生態(tài)監(jiān)測中，不同的生物指示物種已經被陸續(xù)應用于監(jiān)測陸地環(huán)境中PCDD/Fs和PAHs的污染水平[42]，使用最廣泛的為松針和蔬菜，但這些生物指示物種具有短期存在的特征，無法富集足夠量的有機污染

表10 綜合生物反應指數與PAHs生態(tài)風險之間的Pearson相關系數Table 10 The Pearson’s correlation coefficients between biotic metrics and risk indexes

注：*相關性在0.05水平顯著，**相關性在0.01水平顯著。

Note:*Correlation level at 0.05,**correlation level at 0.01.

物，因此無法顯示POPs的長期慢性毒性效應。POPs在生態(tài)系統中處于低劑量長期暴露的特征，而藻類則具有長期存在，能夠揭示POPs在自然生態(tài)系統中低劑量長期暴露的特征。其中，越來越多的研究表明，底棲藻類群落能夠揭示POPs的生態(tài)效應[43]，Sabater等指出[44]，群落種類組成[45]、藻類色素或其光合能力[46]等指標都可以運用于建立POPs生態(tài)效應與底棲藻類群落結構和功能的相關性，并將底棲藻類群落作為POPs監(jiān)測的預警指示物種。

綜上所述：

底棲藻類作為一種生物指示物，已廣泛應用于污染物的生態(tài)監(jiān)測中。但在生態(tài)系統尺度下，污染物的毒性效應與底棲藻類群落結構和功能指標之間的相關性研究還較為缺乏。本研究選取富營養(yǎng)化湖泊——白洋淀作為研究區(qū)，選取底棲藻類群落作為生物指示物，以PAHs作為污染物，通過相關性分析，建立了IBR與PAHs生態(tài)風險的相關關系，研究結果表明基于底棲藻類群落的IBR指數與PAHs的生態(tài)風險呈現顯著相關性，因此，在富營養(yǎng)化湖泊中應考慮運用底棲藻類IBR生態(tài)監(jiān)測PAHs污染水平。