王偉偉，姚 玲，何開躍，王保松, 何旭東 *

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 210014； 2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)， 江蘇 南京 210014； 3. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

柳樹，是指楊柳科 (Salicaceae) 柳屬(Salix)所包含的所有樹種。全世界共有500余種柳樹，主要分布于北半球寒溫帶潮濕的生境中，通常表現(xiàn)為喬木和灌木2種形態(tài)。灌木柳因其萌蘗快、更新容易、生物量高，在北美及歐洲已作為一種重要的可再生、可持續(xù)的生物質(zhì)能源作物被大面積種植[1]；而喬木柳由于生長(zhǎng)快，適應(yīng)性強(qiáng)，樹形優(yōu)美，在中國(guó)主要用于園林景觀及木材工業(yè)原料[2]。盡管楊樹與柳樹同屬楊柳科，是進(jìn)行木本植物遺傳學(xué)與基因組學(xué)研究的模式樹種，但其多樣性的豐富程度遠(yuǎn)不及柳樹。從表型水平上看，柳樹的花型、葉型、樹型、花色、花芽、枝條顏色等變異異常豐富[3]；從染色體水平上看，雖然楊樹與柳樹染色體基數(shù)均為19條，但楊樹大多為2倍體，而柳樹從2倍體到10倍體均有存在[4]。尤為重要的是，一些灌木柳扦插后1 a即可開花，容易建立高世代的遺傳譜系，可作為林木遺傳學(xué)研究的理想模式樹種[5]。

花粉作為植物種質(zhì)的一種形式，包含了父本全部的基因信息，是植物生殖、遺傳、進(jìn)化及育種的重要研究對(duì)象。而花粉活力又是花粉存活、生長(zhǎng)、萌發(fā)及發(fā)育的前提，是植物育種成敗的關(guān)鍵[6]。柳樹分布廣泛、種類繁多，自然條件下花期主要集中于3月至6月，其種間、雜種間、親本與雜種間花粉活力差異較大[7]。柳樹花粉活力的保持是解決花期不遇以及遠(yuǎn)距離雜交困難的關(guān)鍵，而花粉活力的測(cè)定，則是開展遺傳改良與品種選育工作的首要前提。雖然柳樹的生物學(xué)地位尤為重要，但柳樹花粉相關(guān)研究卻很少[7-8]。本研究選取6個(gè)柳樹不同親本及雜交個(gè)體開展花粉離體培養(yǎng)，比較不同花粉活力測(cè)定方法，旨在揭示柳樹不同個(gè)體間花粉變異特點(diǎn)，為柳樹雜交育種工作提供技術(shù)支持，也為下一步柳樹花粉保存與活力維持提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為4個(gè)親本個(gè)體與2個(gè)雜交子代個(gè)體，包括灌木和喬木2種類型(見(jiàn)表1)。其中銀柳、簸箕柳、蒿柳×毛枝柳和簸箕柳×蒿柳采自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹種質(zhì)資源圃，垂柳和紫柳采自南京市玄武湖公園。3月初將帶有柳樹花芽的花枝采回實(shí)驗(yàn)室水培，室溫保持20—25 ℃。待雄花盛開后，用毛筆輕蘸收集花粉于5 mL的離心管中備用。

表1 供試材料信息

1.2 花粉離體培養(yǎng)

1.2.1 最佳培養(yǎng)基篩選 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量濃度為7g/L。試驗(yàn)選取 L25(56) 正交表，對(duì)蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)23個(gè)影響因子進(jìn)行優(yōu)化(見(jiàn)表2)。在雙孔凹型玻片孔內(nèi)滴入培養(yǎng)基0.1 mL，用小毛筆將采取的新鮮花粉均勻散布在培養(yǎng)基上，25 ℃光照培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，重復(fù)4次。

表2 柳樹花粉離體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 光暗條件和最佳觀測(cè)時(shí)間篩選 根據(jù)試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)基，分別在25 ℃光照培養(yǎng)箱和暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0.5，1，2，4，6，8，10，12，14，16 h 進(jìn)行萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)，重復(fù)4 次，以確定花粉萌發(fā)是否需要光照及最適觀察統(tǒng)計(jì)時(shí)間。

1.2.3 最佳培養(yǎng)溫度的篩選 將花粉分別于4，15，25，35 ℃培養(yǎng)于最佳培養(yǎng)基上，在試驗(yàn)確定的最佳觀測(cè)時(shí)間進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，重復(fù)4 次。

1.3 花粉活力測(cè)定

本試驗(yàn)選取離體培養(yǎng)法、藍(lán)墨水染色法、I2-KI 染色法和TTC染色法4種常用的植物花粉活力檢測(cè)方法進(jìn)行比較，以確定不同柳樹個(gè)體的最適宜的花粉測(cè)定方法。

1.3.1 離體培養(yǎng)法 在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，顯微鏡下檢測(cè)花粉萌發(fā)。滴培養(yǎng)基1滴于載玻片中央，用毛筆輕蘸少量花粉置于培養(yǎng)基上，并將載玻片放進(jìn)鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中。若花粉管的長(zhǎng)度超出花粉的直徑則視為花粉萌發(fā)。萌發(fā)率計(jì)算公式為萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/檢測(cè)的花粉總數(shù)×100%

1.3.2 藍(lán)墨水染色法 用毛筆輕蘸少量花粉置于載玻片上，用普通藍(lán)墨水(0.05 g/mL)染色15 min。因活細(xì)胞膜具有選擇吸收的能力，當(dāng)加入藍(lán)墨水時(shí)，沒(méi)有活力的花粉會(huì)被染色，沒(méi)有被染色的花粉則有活力。

1.3.3 I2-KI 染色法 用毛筆輕蘸少量花粉置于載玻片上，輕輕滴入1% I2-KI溶液1滴，蓋上蓋玻片并置于顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染成藍(lán)黑色，沒(méi)有活力的花粉為無(wú)色。

1.3.4 TTC染色法 用毛筆輕蘸少量花粉置于載玻片上，輕輕滴入1%TTC 溶液1滴，蓋上蓋玻片后將載玻片放入恒溫箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為25 ℃。15 min 后置于顯微鏡下觀察，紅色花粉為有活力，無(wú)色的花粉則沒(méi)有活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖表處理、方差與極差分析、Duncan 多重對(duì)比與相關(guān)性分析利用SPSS 17.0與Excel 2007軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 最佳培養(yǎng)基篩選 不同柳樹花粉離體培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。因培養(yǎng)基中蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2質(zhì)量濃度與組合不同，6個(gè)柳樹親本及雜交種個(gè)體之間花粉萌發(fā)率存在顯著差異(P<0.05)。同時(shí)極差分析表明各柳樹不同花粉培養(yǎng)基的最佳配比也存在差異(見(jiàn)表4)。各因素對(duì)P102，P63和2383的花粉萌發(fā)率作用大小為A>C>B，對(duì)2333，垂柳和紫柳的作用大小為A>B>C。P102理論最佳培養(yǎng)基組合為A3B2C1，P63理論最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2，2333和2383理論最佳培養(yǎng)基組合為A1B2C1，垂柳和紫柳理論最佳培養(yǎng)基組合為A2B4C1。采用本試驗(yàn)確定的最佳理論組合對(duì)柳樹花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)，P102，P63，2333，2383，垂柳和紫柳的萌發(fā)率分別為80.2%，81.1%，75.6%，66.8%，82.8%和84.7%，均高于或接近正交試驗(yàn)的最高萌發(fā)率，表明各最佳組合穩(wěn)定合理。

表3 柳樹花粉離體培養(yǎng)正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

表4 柳樹花粉正交試驗(yàn)極差分析

2.1.2 光暗條件和最佳觀測(cè)時(shí)間篩選 以選擇出的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，6個(gè)不同柳樹親本及雜交種個(gè)體在光照和黑暗2個(gè)條件下花粉離體培養(yǎng)的萌發(fā)率隨著培養(yǎng)時(shí)間變化情況如圖1所示。在光照和黑暗2種條件下，培養(yǎng)前期各柳樹的花粉離體萌發(fā)率均出現(xiàn)快速上升；隨著培養(yǎng)時(shí)間的持續(xù)增加，花粉離體萌發(fā)率逐漸趨于平穩(wěn)。光照和黑暗對(duì)花粉的離體萌發(fā)率影響不大，在相同的培養(yǎng)時(shí)間下差異不顯著(P> 0.05)。6個(gè)不同柳樹親本及雜交種個(gè)體花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)間以10—12 h為宜，其中P102，P63，2333和2383花粉離體培養(yǎng)最佳時(shí)間為12 h，而垂柳和紫柳則為10 h。

2.1.3 最佳培養(yǎng)溫度篩選 6個(gè)不同柳樹親本及雜交種個(gè)體分別用最佳培養(yǎng)基進(jìn)行花粉離體培養(yǎng)。結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)溫度的不斷升高，不同柳樹個(gè)體花粉離體萌發(fā)率均呈現(xiàn)出先高后低的變化趨勢(shì)，且與其他各個(gè)溫度間有顯著差異(P< 0.05)，花粉離體萌發(fā)的最佳溫度均為25 ℃(見(jiàn)表5)。

表5 溫度對(duì)不同柳樹花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)率的影響

同列數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)后不同小寫字母表示在P<0.05水平上存在顯著性差異

圖1 光照及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)柳樹花粉離體培養(yǎng)的影響

2.2 花粉生活力測(cè)定方法比較

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，確定藍(lán)墨水染色法、I2-KI 染色法和TTC 染色法均可用于柳樹花粉生活力的測(cè)定。將離體培養(yǎng)法與3種染色法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。4種測(cè)定方法在P102，P63和垂柳上均差異顯著(P<0.05)，花粉活力順序?yàn)樗{(lán)墨水染色法>離體培養(yǎng)法> I2-KI 染色法>TTC 染色法。藍(lán)墨水染色法和離體培養(yǎng)法在雜交子代2333上不存在顯著差異(P>0.05)，但顯著(P<0.05)高于I2-KI 染色法和TTC 染色法，花粉活力順序?yàn)樗{(lán)墨水染色法=離體培養(yǎng)法>TTC 染色法> I2-KI 染色法，且TTC染色法僅能將2333染色。在2383和紫柳中藍(lán)墨水染色法和離體培養(yǎng)法之間不存在顯著差異(P>0.05)，但顯著(P<0.05)高于I2-KI 染色法和TTC 染色法，花粉活力順序?yàn)樗{(lán)墨水染色法=離體培養(yǎng)法> I2-KI 染色法>TTC 染色法。

每個(gè)供試材料圖中，不同小寫字母表示花粉活力測(cè)定值之間存在顯著性差異(P<0.05)圖2 柳樹花粉離體培養(yǎng)法與染色法之間的花粉活力比較

3 結(jié)論與討論

3.1 培養(yǎng)條件對(duì)花粉離體培養(yǎng)的影響

在一定的培養(yǎng)條件和溫度控制下，花粉活力可根據(jù)其離體培養(yǎng)時(shí)的萌發(fā)率來(lái)判定，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單、迅速、合理，并可完全定量[9]。但花粉萌發(fā)條件對(duì)離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力時(shí)影響較大，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)溫度與時(shí)間、礦質(zhì)元素等[10-11]。

蔗糖不僅是花粉萌發(fā)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以調(diào)節(jié)萌發(fā)環(huán)境中的滲透壓，適宜的蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)花粉離體萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用[12]，但當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基中滲透壓增大，會(huì)導(dǎo)致花粉失水，產(chǎn)生質(zhì)壁分離和花粉管破裂等現(xiàn)象，從而抑制花粉離體萌發(fā)[13-15]。最適蔗糖質(zhì)量濃度因樹種不同而存在差異[16-18]。硼酸參與果膠質(zhì)的合成和糖分的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等，從而促進(jìn)花粉的離體萌發(fā)[19-21]。在花粉管的極性、頂端和定向生長(zhǎng)中，可通過(guò)添加外源Ca2+的量來(lái)促進(jìn)花粉管的伸長(zhǎng)，但外界Ca2+質(zhì)量濃度過(guò)高可導(dǎo)致?tīng)恳偷腃a2+通道受損，從而抑制花粉管的生長(zhǎng)[22]。而本研究的結(jié)果表明，不同柳樹親本及雜交種個(gè)體對(duì)培養(yǎng)基中蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2的需求差異較大。

溫度對(duì)花粉離體培養(yǎng)影響不同，溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于花粉的萌發(fā)。不同植物的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的最適溫度存在差異。如伊朗杏樹花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)平均溫度為24.2 ℃[23]；黃連木花粉離體培養(yǎng)的平均最適溫度為23.9 ℃[24]，棗樹花粉萌發(fā)的適宜溫度為 25 ℃[25]，而本研究中不同柳樹個(gè)體花粉萌發(fā)的最適溫度均為25 ℃。

光照對(duì)花粉培養(yǎng)也有不同的影響。如馬尾松花粉黑光下易于萌發(fā)[26]，但東方百合光照條件下的花粉萌發(fā)率高于黑暗條件[27]，而光照和黑暗對(duì)桂花花粉萌發(fā)無(wú)顯著影響[28]，甚至有研究表明光照對(duì)棗樹花粉萌發(fā)表現(xiàn)出的抑制作用強(qiáng)弱與品種有關(guān)[25]。本研究中，柳樹花粉光照培養(yǎng)萌發(fā)率略高于暗培養(yǎng)，但差異不顯著。

花粉的萌發(fā)過(guò)程需要在一定的時(shí)間內(nèi)完成，不同植物的花粉達(dá)到萌發(fā)最大值所需的時(shí)間不同。如石榴“泰山紅”花粉最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 h[29]，懸鈴木花粉培養(yǎng)24 h后萌發(fā)率最高[30]。本研究中，柳樹花粉0.5 h后開始萌發(fā)， 10—12 h后萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，繼續(xù)培養(yǎng)則花粉管過(guò)長(zhǎng)，不利于觀察。因此，柳樹花粉適宜培養(yǎng)時(shí)間為10—12 h，其中灌木柳為12 h，喬木柳為10 h。

3.2 花粉活力測(cè)定方法比較

離體萌發(fā)測(cè)定法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，可直接區(qū)分有活力和無(wú)活力的花粉，但需要根據(jù)不同的樹種配制培養(yǎng)基，優(yōu)化不同的培養(yǎng)時(shí)間和溫度等條件，時(shí)間消耗相對(duì)過(guò)長(zhǎng)。染色法測(cè)定相對(duì)簡(jiǎn)單，可用于花粉活力的快速測(cè)定，但由于受花粉自身的特性影響，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定程度的偏差[10]。因此，不同植物所適合的染色法也不盡相同。如金娃娃萱草適宜的染色劑為TTC[14]；而槐樹花粉僅適用于培養(yǎng)基萌發(fā)法，I2-KI染色法與TTC染色法均無(wú)法進(jìn)行測(cè)定[31]。本研究中，TTC法僅能將雜交子代個(gè)體2333染色且測(cè)定的花粉活力較低，這可能與其他種的個(gè)體花粉外壁太厚，TTC溶液未能進(jìn)入花粉細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。I2-KI染色法雖可將花粉染色，測(cè)定的花粉活力顯著低于離體培養(yǎng)法。藍(lán)墨水染色法在2383，2333和紫柳3種柳樹花粉活力的測(cè)定中與離體培養(yǎng)法間差異不顯著，故可代替離體培養(yǎng)法對(duì)2383，2333和紫柳等3種柳樹花粉的生活力進(jìn)行快速測(cè)定。