王振召 魏斌斌 陳 崢 諸宏偉 沈桂平 馮江華*

1(廈門大學電子科學系， 福建省等離子體與磁共振重點實驗室， 廈門 361005)2(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院， 蚌埠 233004)

1 引 言

尿毒癥是多數(shù)慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期階段所表現(xiàn)出的臨床綜合征，它的發(fā)生會引起代謝性酸中毒以及多種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝紊亂，同時造成多數(shù)器官及系統(tǒng)病變，包括皮膚損害、心血管病變、胃腸道受損和腦出血等[1～3]，并常伴有多種并發(fā)癥狀。

近年來，尿毒癥的發(fā)病逐漸從中老年人群轉(zhuǎn)移到青壯年[4]，由于早期癥狀不明顯，患者常不重視，進入到尿毒癥期卻未發(fā)現(xiàn)，錯過了最佳治療時期，甚至一些已經(jīng)確診的尿毒癥患者會因為擔心透析治療的副作用而拒絕接受合理的治療。因此，對尿毒癥的診斷與檢查顯得尤為重要。在慢性腎臟病的早期，臨床上常表現(xiàn)為原發(fā)癥狀，對于尿毒癥的傳統(tǒng)檢查手段主要包括血常規(guī)檢查、尿常規(guī)檢查、腎功能檢測、血生化分析以及一些影像學檢查[5～8]。目前，關(guān)于尿毒癥的研究多集中在尿毒癥造成的多種并發(fā)癥及對部分代謝物的影響，如Madsen等[9]研究了尿毒癥通過調(diào)節(jié)體內(nèi)主動脈平滑肌細胞的表型來加速動脈粥樣硬化；Mclntire等[10]考慮到尿毒癥患者食品利用率降低，研究了必需氨基酸亮氨酸在尿毒癥的營養(yǎng)治療中的合成代謝效應；Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥能使生長激素刺激的胰島素樣生長因子-1表達減弱；Kumar等[12]研究了甲狀旁腺激素在終末期腎臟病中的代謝情況；王中華等[13]研究了多種代謝物在大鼠腎臟中的分布。同時，也有大量的文獻描述了胃腸道在腎臟損傷中的影響[14,15]。然而，目前尚缺少對尿毒癥總體的代謝機制變化的研究，對其具體的代謝特征描述不清楚，使其相應的診斷和有效治療相對滯后。尿液作為腎臟的排泄物，包含眾多小分子代謝物的信息，能夠較為直觀地反映腎臟代謝環(huán)境的變化。尿毒癥是與腎損傷有關(guān)的疾病，體內(nèi)的代謝變化多由腎損傷引起，所以通過分析尿樣了解尿毒癥具有明顯的優(yōu)勢。尿樣容易獲得，且其中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量低，可以體現(xiàn)核磁共振的檢測特點，已成為基于核磁共振的代謝組學研究特別是腎臟疾病代謝組學研究中主要的生物樣品[16]。本研究應用基于核磁共振技術(shù)的尿樣代謝組學的方法，以期獲取可用于表征尿毒癥的定性和定量指標，闡明尿毒癥體內(nèi)代謝機制和機體的生理變化，進而輔助臨床上尿毒癥的確認診斷和對癥治療。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

邁瑞B(yǎng)S-350E全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；AVANCE III 600MHz核磁共振譜儀(德國Bruker公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

含0.5%的三甲基硅基丙酸鈉 (TSP)的重水(Sigma-Aldrich公司)；K2HPO4、NaH2PO4(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1樣品的采集與配制關(guān)于臨床尿毒癥的代謝組學研究采用對照的設(shè)計原則，建立尿毒癥實驗組及正常對照組。尿毒癥患者臨床癥狀復雜，常表現(xiàn)出厭食、嘔吐、腹瀉、口腔潰爛、呼氣有尿味、少尿、面色蒼白灰暗、消瘦、浮腫、全身瘙癢，并伴有頭痛、神志恍惚、乏力、失眠等一系列寒熱、虛實錯雜之象[17]。本研究的尿毒癥患者及健康對照組尿樣均來自安徽省蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病科，其中包括29例臨床尿毒癥患者的尿樣及39例正常健康志愿者的尿液樣本，所有尿樣均在同一時間段采集，并記錄性別、年齡等信息。在采集樣本前均告知入試者本研究的內(nèi)容，所有參與研究的患者和健康志愿者均簽署知情同意書。尿樣采集后，加入0.1% NaN3，同時進行液氮速凍后,——80℃保存。

進行實驗時，將所采集到的尿液樣品平均分為兩份，分別用于生化分析和代謝組學分析。

尿生化指標檢測采用邁瑞B(yǎng)S-350E全自動生化分析儀，對比較重要的臨床尿生化指標，包括尿素、尿酸、葡萄糖和肌酐，利用隨機軟件獲取相應的分析結(jié)果。對于代謝組學分析樣本，取出保存的尿液樣本進行室溫解凍，充分融化后搖勻。離心，取500 μL上清液，與50 μL磷酸鹽重水緩沖溶液(1.5 mol/L， pH=7.4，含0.5% TSP)混合，振蕩10 s使混合均勻，于4℃以10000 g離心10 min，取上清液500 μL，移至5 mm核磁管中進行核磁共振檢測。

2.2.2核磁共振氫譜數(shù)據(jù)采集及處理

尿樣的1H-NMR實驗在600MHz核磁共振譜儀上進行，1H共振頻率為600.13 MHz。實驗溫度為298 K，采用帶有NOESYPR1D脈沖序列(RD-90°-t1-90°-tm-90°-Acq)進行采樣。實際采樣中，使用5 mm的CPBBO正向觀察寬帶探頭，空掃次數(shù)為8次，弛豫延遲為4.0 s，采樣點數(shù)為32 K，采樣時間2.66 s， 累加次數(shù)為32次，譜寬為20 ppm。

對采集到的譜圖利用MestReNova (Version 9.0.1, Mestrelab Research S.L., Spain)軟件將原始FIDs信號充零到128 K，同時乘以線寬為1.0 Hz的指數(shù)窗函數(shù)。傅里葉變換后，將時域信號譜圖進行人工的相位校正和基線調(diào)整，并以TSP在0 ppm處的單峰進行定標。切除化學位移6.20～5.45 ppm及5.20～4.45 ppm范圍內(nèi)的譜圖, 消除尿素峰及殘留水峰對譜圖的影響，同時保留4.67 ppm處β-葡萄糖雙峰以討論β-葡萄糖的變化情況，對每個譜圖以0.005 ppm為積分間距進行等間距分段積分，積分范圍為9.50～0.60 ppm，對積分數(shù)據(jù)相對于譜圖的總積分面積進行歸一化。

2.2.3統(tǒng)計學分析及通路分析使用SIMCA (version14.1, Umetrics AB, Umea Sweden)對歸一化的數(shù)據(jù)進行基于多變量統(tǒng)計的模式識別分析。首先進行主成分分析(PCA)，采用中心化換算(Ctr)的數(shù)據(jù)標度換算方式獲取尿毒癥患者與健康對照組之間的代謝輪廓和差異。進一步進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，采用自適換算(UV)的數(shù)據(jù)標度換算方式，最大化地凸顯模型內(nèi)部疾病組與對照組之間的差異。然后，通過排列實驗隨機多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應不同的隨機Q2值對模型的有效性進行進一步的檢驗，同時獲取代謝物差異特征相關(guān)的相關(guān)系數(shù)值(r)和變量重要性(VIP)值。

同時，為了更好地進行特征代謝物的篩選，對積分數(shù)據(jù)進行了單變量統(tǒng)計學分析，從相應信號的積分區(qū)域?qū)Ω鞔x物的相對濃度進行了定量分析。為了避免譜圖中重疊峰造成干擾，選擇了具有最少重疊的特征峰對有意義的代謝物進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析的結(jié)果用差異倍數(shù) (Fold-change) 值和t檢驗進行評估，其中t檢驗值轉(zhuǎn)化為p值，用來統(tǒng)計差異的顯著性，以此獲得有顯著變化的代謝產(chǎn)物。Fold-change值是兩組代謝物濃度的比值，用來表示具有差異的代謝物的變化情況。

使用Fold-change值和t檢驗值，并結(jié)合OPLS-DA中導出的相關(guān)系數(shù)值和VIP值，完成火山圖的繪制，用于總結(jié)和識別潛在的生物標志物。篩選差異代謝物的標準為：相關(guān)系數(shù)的絕對值(|r|)>0.85、VIP值取前10%及p值(t-test值轉(zhuǎn)換而來)<0.001(即縱坐標值>3)，篩選出的差異代謝物可作為潛在的生物標志物。

在篩選出潛在的生物標志物后，為了更進一步了解尿毒癥患者與健康人群之間的代謝組學差異。利用HMDB(Human Metabolome Database, http://www.hmdb.ca)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.kegg.jp)以及MetaboAnalyst3.0在線分析工具(http://www.metaboanalyst.ca/)等公開的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫，對模型的差異代謝物的代謝信息進行分析，探究其中與尿毒癥相關(guān)的代謝通路，最后給出合理的生物化學解釋。

3 結(jié)果與討論

3.1 尿液的生化分析

首先對采集到的尿樣進行狀態(tài)觀察和生化分析。對比健康對照組和尿毒癥患者的尿樣發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者的尿樣呈現(xiàn)出清如水的狀態(tài)，樣品澄清無沉淀，這可能是由于血液透析造成的結(jié)果，而健康對照組的尿樣呈現(xiàn)出正常的尿黃色，且其中有少量沉淀。同時，尿樣生化指標分析結(jié)果(表1)表明，尿毒癥患者尿注中尿酸、尿素和肌酐的含量顯著偏低，而尿中葡萄糖的含量明顯偏高，表明尿毒癥患者體內(nèi)腎小管細胞大量受損，同時，體內(nèi)葡萄糖的氧化分解通路受阻，大量糖分分解為葡萄糖，卻不能得到充分而有效的利用[18～20]。

表1 尿毒癥患者和健康人群尿液主要臨床生化指標

Table 1 Primary urinary biochemical index of uremia patients and health control

3.2 核磁共振譜圖分析

圖1為尿毒癥患者(U)和健康對照組(C)的尿液樣本的核磁共振氫譜平均積分譜圖(通過Matlab重新繪制)。根據(jù)文獻[21]、經(jīng)驗以及參考公用數(shù)據(jù)庫的代謝組學相關(guān)數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database, http://www.hmdb.ca)，對譜圖進行代謝物的準確歸屬。本研究從譜圖中歸屬出70種代謝物，相應的代謝物的詳細信息見表2。肉眼可見尿毒癥患者和健康對照組的特征性核磁共振譜圖，并發(fā)現(xiàn)其中兩組具有明顯的代謝差異，在尿毒癥患者的譜圖中，大多數(shù)代謝物特別是低場區(qū)(9.50～6.20 ppm)明顯偏低，證實了尿毒癥的代謝擾動影響終端尿液的代謝產(chǎn)物，使其表現(xiàn)出極大的變化。從譜圖中可分辨出一些特征性的差異代謝物，如尿毒癥組中具有較高濃度的乙酸、乳酸、葡萄糖和牛磺酸等。

圖1 尿毒癥患者(U)和健康對照人群(C)尿液的平均1H NMR譜圖(9.50～0.60 ppm)。譜圖中去除了6.20～5.45 ppm處尿素峰及5.20～4.68 ppm和4.64～4.45 ppm兩處水峰及其影響的譜峰區(qū)域，虛線框起來的區(qū)域分別放大了相應的倍數(shù)，使譜峰清晰可辨。圖中各代謝物的編號及詳細歸屬信息見表2Fig.1 Mean 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectra (9.50-0.60 ppm) of urine obtained from uremia patients (U) and healthy control subjects (C). The spectral regions in the dashed boxes are respectively vertically expanded compared with the spectral region of 3.00-6.20 ppm for the clarity. The keys for the numbers of assigned metabolites are given in Table 2

表2 人尿液1H NMR譜圖鑒定出的代謝物

Table 2 Identified metabolites from the NMR spectra of human urine

編號No.代謝物Metabolites化學位移(峰型)1H chemical shift(ppm)(multiplicity)11-甲基組氨酸 1-Methylhistidine(1-MH)7.04(sa),7.69(s)22-羥基異丁酸2-Hydroxyisobutyrate(HIB)1.36(s)32-氧異戊酸 2-Oxoisovalerate(OIV)1.11(d)43-羥基丁酸3-Hydroxybutyrate(3-HB)1.19(d),2.28(dd),2.40(dd),4.16(m)53-甲氧基-4-羥基扁桃體酸3-Methoxy-4-hydroxymandelate(MHM)6.98(d)6乙酰胺 Acetamide(AD)1.99(s)7乙酸 Acetate(Ace)1.92(s)8乙酰乙酸 Acetoacetate(AA)2.28(s)9丙酮 Acetone(Act)2.24(s)10乙酰膽堿 Acetylcholine(Ach)3.23(s)11腺苷 Adenosine(Ads)8.34(s)12丙氨酸 Alanine(Ala)1.49(d)13尿囊酸 Allantoate(Alt)5.35(m)14尿囊素 Allantoin(All)5.39(s)15氨基馬尿酸Aminohippurate(AH)6.91(d),7.71(d)16新煙堿 Anabasine(Ab)8.53(d)17天冬酰胺 Asparagine(Asn)2.83(m),2.91(m)18苯甲酸 Benzoate(Ben)7.48(t),7.87(d)19甜菜堿 Betaine(Bet)3.90(s)20膽汁酸 Bile acid(BA)0.65(m),0.75(m)21丁酸 Butyrate(Bu)0.91(t),1.56(m),2.19(m)22膽堿 Choline(Cho)3.20(s)23檸檬酸 Citrate(Ci)2.54(d),2.68(d)24肌酸 Creatine(Cr)3.04(s),3.94(s)25肌酐 Creatinine(Cn)3.05(s),4.06(s)26二甲胺 Dimethylamine(DMA)2.72(s)27乙醇 Ethanol(Eth)1.20(t),3.65(q)28乙醇胺 Ethanolamine(EA)3.15(t)29葉酸 Folic acid (FA)8.68(s)30甲酸 Formate(For)8.47(s)31富馬酸 Fumarate(Fum)6.53(s)32谷氨酸 Glutamate(Glu)2.07(m),2.13(m),2.35(m),3.78(m)33谷氨酰胺 Glutamine(Gln)2.46(m)34甘氨酸 Glycine(Gly)3.57(s)35乙醇酸 Glycolate(Gla)3.96(s)36胍基乙酸鹽Guanidoacetate(GA)3.80(s)37馬尿酸 Hippurate(Hip)3.97(d),7.56(t),7.64(t),7.84(d)38組氨酸 Histidine(His)7.12(s),7.93(s)39次黃嘌呤 Hypoxanthine(HX)8.20(s),8.22(s)編號No.代謝物Metabolites化學位移(峰型)1H chemical shift(ppm)(multiplicity)40吲哚-3-乳酸Indole-3-lactate(IL)7.18(d),7.21(d),7.75(d)41異丁酸 Isobutyrate(IB)1.07(d)42異亮氨酸 Isoleucine(Ile)0.94(t),1.01(d)43乳酸 Lactate(Lac)1.34(d),4.12(q)44亮氨酸 Leucine(Leu)0.97(t)45賴氨酸 Lysine(Lys)1.46(m),1.74(m),1.89(m),3.03(t)46蘋果酸 Malate(Mal)4.30(m)47丙二酸 Malonate(M)3.12(s)48間-羥基苯乙酸m-Hydroxyphenylacetate(m-HPA)6.79(m),6.80(m)49甲醇 Methanol(Mol)3.37(s)50蛋氨酸 Methionine(Met)2.14(s),2.16(m),2.66(t)51甲基丙二酸Methylmalonate(MM)1.25(d)52N,N-二甲基甘氨酸N,N-Dimethylglycine(DMG)2.93(s)53N-乙酰丙氨酸N-Acetylalanine(NAA)2.03(s)54煙堿 Nicotinamide(NA)8.28(m),8.72(d)55N-甲基煙酰胺N-Methylnicotinamide(NMN)8.18(m),8.91(d),8.97(d),9.29(s)56泛酸 Pantothenate(Pan)0.84(s),0.94(s)57對-羥基苯乙酸p-Hydrxoyphenylacetate(p-HPA)6.86(d),7.17(d)58苯乙酰甘氨酸Phenylacetylglycine(PAG)3.68(s),3.75(d),7.29(m),7.36(m),7.43(m)59吡啶甲酸 Picolinate(PA)7.51(d),7.90(d),8.55(m)60丙酮酸 Pyruvate(Py)2.35(s)61肌氨酸 Sarcosine(Sar)2.76(s),3.60(s)62琥珀酸 Succinate(Suc)2.41(s)63琥珀酰亞胺 Succinimide(Sum)2.79(s)64?；撬?Taurine(Tau)3.29(t),3.45(t)65反式烏頭酸t(yī)rans-Aconitate(Aco)6.60(s)66葫蘆巴堿Trigonelline(Tri)4.44(s),8.10(m),8.84(t),9.13(s)67N-氧-三甲胺Trimethylamine N-oxide(TMAO)3.27(s)68纈氨酸 Valine(Val)0.99(d),1.05(d)69α-葡萄糖α-Glucose(α-Glc)3.42(t),3.54,3.71(t), 3.84(m),5.24(d)70β-葡萄糖β-Glucose(β-Glc)3.25, 3.41(t),3.46(m), 3.49(t),3.72(dd), 3.90(dd)注:a 峰型: s, 單峰; d, 雙重峰; t, 三重峰; q, 四重峰; dd, 雙重雙重峰; m, 多重峰a Multiplicity: s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; dd, doublet of doublets; m, multiplet.

為進一步獲取其詳細的定量生物化學信息，從而對尿毒癥組和正常對照組之間的差異進行客觀系統(tǒng)的評估，需要對譜圖導出的積分數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學相關(guān)分析。

3.3 統(tǒng)計結(jié)果分析

由尿毒癥患者和健康對照人群的主成分分析(PCA)得分圖(圖2A)可見，尿毒癥組和正常對照組出現(xiàn)了明顯區(qū)別，表明兩者存在顯著的代謝差異，說明尿毒癥確實影響到了機體的代謝功能。另外，尿毒癥患者團聚性較差，可能是由于這些患者來自于不同發(fā)展期的尿毒癥造成的。進一步對兩組進行組間正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，進而獲取兩者之間顯著性的代謝差異。從其模型參數(shù)和排列實驗的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)尿毒癥組與對照組具有明顯區(qū)別(圖2B和圖2C)，反映了尿毒癥造成的體內(nèi)的代謝紊亂。

通過核磁共振譜圖的積分數(shù)據(jù)進行單變量統(tǒng)計學分析，使用相應特征峰信號的積分區(qū)域?qū)Ω鞔x物的相對濃度進行定量分析，可以獲得尿毒癥患者和健康對照人群尿樣中代謝物含量的差異倍數(shù) (fold-change) 值和通過t檢驗后轉(zhuǎn)化的p值。并結(jié)合多變量統(tǒng)計分析中模型的相關(guān)系數(shù)(r)和變量重要性(VIP)值，可以構(gòu)建四維(r值、VIP值、p值和fold-change值)火山圖(圖2D)。進而可以系統(tǒng)性地對代謝物進行統(tǒng)計學分析，以獲得有顯著差異的潛在的特征代謝產(chǎn)物[22]。彩色火山圖表明尿毒癥組與對照組之間的代謝物變化，其中X軸為log2(Fold-change)，Y軸為——lgp，圓的大小為VIP值(按照取值分為10%、20%和剩余部分3部分，圓越大表示VIP值越靠前)，圓的顏色深淺表示相關(guān)系數(shù)的絕對值(圓的顏色越溫暖表示相關(guān)系數(shù)的絕對值越大)。使用三標準可以篩選得到尿毒癥患者的潛在的特征代謝物：相關(guān)系數(shù)的絕對值(|r|)>0.85、VIP值取前10%及p<0.001(即縱坐標值>3)。火山圖中的代謝物用縮寫表示，詳細信息參見表2和表3。

圖2 尿毒癥患者(U)與健康對照組(C)尿樣的主成分分析得分圖(A)、OPLS-DA得分圖(B)、模型的排列實驗交叉驗證圖(C)和相應的火山圖(D)Fig.2 Principal component analysis(PCA)(A), orthogonal partial least square-discriminate analysis(OPLS-DA)(B), cross validation by permutation test (C) and corresponding volcano plots (D) based on NMR data of urine obtained from the uremia patients (U) and healthy controls (C)

表3 火山圖中差異代謝物的詳細信息

Table 3 Summary of metabolites statistical data

從火山圖(圖2D)可見，相較于健康對照組，尿毒癥患者尿液中的肌氨酸、天冬酰胺、2-羥基異丁酸、丁酸、乙醇胺、肌酐、N,N-二甲基組氨酸、谷氨酸、檸檬酸、3-羥基丁酸、丙酮、乙醇和賴氨酸的含量顯著偏低，而?；撬?、α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量顯著偏高。這些代謝物的變化可以作為潛在的變化信息用于表征尿毒癥患者的代謝情況。

3.4 代謝通路分析

整體性的代謝擾動需要通過代謝通路圖來進行描述。借助于KEGG數(shù)據(jù)庫可以得到差異代謝物(圖2D和表3)之間的相互關(guān)系，進而通過Visio繪制出相應的代謝通路圖。從尿毒癥對體內(nèi)造成干擾的代謝通路圖(圖3)可見，這些代謝途徑主要涉及到糖代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝中的部分代謝。

在尿毒癥患者尿液內(nèi)，支鏈氨基酸(包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)的含量明顯偏高。支鏈氨基酸通常是重要而有效的營養(yǎng)補充劑。人體內(nèi)的支鏈氨基酸的來源主要是日常蛋白質(zhì)類食物的攝入及體內(nèi)相關(guān)蛋白的分解，正常人體內(nèi)蛋白質(zhì)與氨基酸的代謝處于動態(tài)平衡，體內(nèi)氨基酸的含量維持在穩(wěn)定水平，不會出現(xiàn)有差異性的變化。支鏈氨基酸相較于其它氨基酸能夠產(chǎn)生更多的能量[23]，釋放大量的ATP，同時能夠分解成相應的輔酶A，參與到三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))中，被進一步用作轉(zhuǎn)化為其它氨基酸、促進蛋白質(zhì)的合成與分解、促進糖的異生以及合成其它營養(yǎng)物質(zhì)等[24]，并且支鏈氨基酸具有調(diào)節(jié)免疫的作用[25,26]。支鏈氨基酸含量偏高，表明其參與的代謝反應受阻，三者的含量在體內(nèi)造成了積累。支鏈氨基酸產(chǎn)生能量減少，一定程度上造成了體內(nèi)供能不足，同時免疫功能受到影響，體內(nèi)合成抗體減少，機體進一步受損。

圖3 尿毒癥對體內(nèi)造成干擾的代謝通路圖。圖中橢圓形框中彩色的代謝物為出現(xiàn)明顯差異的代謝物。其中，紅色和綠色分別表示該代謝物在尿毒癥患者尿液中含量顯著偏高和偏低。不同的代謝路徑用不同顏色的大方框表示Fig.3 Disturbed metabolic pathways involved in uremia. The higher, lower and no significantly changed levels of the metabolites are represented by red, green and black ellipses. The different metabolic pathways are indicated by the different font colors

支鏈氨基酸能夠轉(zhuǎn)化為天冬酰胺并進一步轉(zhuǎn)氨基生成天冬氨酸，天冬氨酸被用作蛋氨酸、蘇氨酸和賴氨酸等的原料[27]，支鏈氨基酸含量的升高造成了天冬酰胺的減少，使得向天冬氨酸的代謝途徑受到影響。

N,N-二甲基甘氨酸(DMG)是氨基酸的衍生物，肌酸又稱N-甲基甘氨酸，兩者均為機體內(nèi)膽堿向甘氨酸代謝的中間產(chǎn)物，DMG在體內(nèi)多種代謝中作為的甲基供體，肌氨酸在ATP能量代謝中可促進ATP的合成[28]，兩者含量的減少表明相關(guān)代謝的紊亂。肌酐作為小分子量毒物，腎臟正常時幾乎全部隨尿排出，含量不受影響，而尿毒癥患者往往會在體內(nèi)蓄積造成通過尿液的排出含量較少。

賴氨酸和谷氨酸含量的減少，可能是受到了TCA循環(huán)的影響。賴氨酸具有保持體內(nèi)正常的滲透壓、增強免疫力的作用[29]，其含量的減少會導致機體的進一步損傷。

能量代謝受到的影響不僅包括支鏈氨基酸的功能減弱，葡萄糖的糖酵解及TCA循環(huán)也會影響到能量代謝，尿毒癥患者尿液中α-葡萄糖、β-葡萄糖及乳酸的含量增加，檸檬酸含量減少。檸檬酸是TCA循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，檸檬酸含量的減少表明了TCA循環(huán)的異常，造成線粒體功能的紊亂，并進一步導致細胞的凋亡和分化。葡萄糖含量的增加表明體內(nèi)大量的營養(yǎng)物質(zhì)被分解，同時乳酸含量升高表明被分解的營養(yǎng)物質(zhì)有氧呼吸參與較少，大都參與到了無氧糖酵解中分解成乳酸并產(chǎn)生少量的ATP。由于尿毒癥導致體內(nèi)有氧代謝及其它產(chǎn)能方式受阻，糖酵解成為了患者獲取能量的主要來源，而糖酵解產(chǎn)生能量較少，需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)分解成葡萄糖，造成了葡萄糖及乳酸含量的升高。

?；撬崾且环N含硫氨基酸，游離于細胞液和體液中，具有清除自由基、調(diào)節(jié)滲透壓、維持體液平衡等作用[30]。腎臟會根據(jù)體內(nèi)牛磺酸的含量調(diào)節(jié)它的排泄[31]，尿毒癥患者的腎臟受損，導致尿液中牛磺酸的含量升高。而丙酮和乙醇在體內(nèi)蓄積使得尿液中兩者的含量減少。

丁酸是短鏈脂肪酸的一種，主要來源于腸道內(nèi)微生物對未吸收的碳水化合物以及蛋白質(zhì)發(fā)酵的產(chǎn)物中，在人類體內(nèi)能夠促進壞死的組織快速恢復[32]，其含量的減少可能導致組織壞死的進一步惡化。3-羥基丁酸主要是人體內(nèi)脂肪酸代謝的產(chǎn)物之一，同時與體內(nèi)能量代謝紊亂有關(guān)[33]。乙醇胺參與體內(nèi)磷脂代謝，并與ATP反應生成ADP和磷酸乙醇胺[34]。3-羥基丁酸和乙醇胺的減少表明了脂質(zhì)代謝和能量代謝的紊亂。

結(jié)合尿毒癥患者和健康對照組尿液的分析，可以發(fā)現(xiàn)二者存在顯著的差異代謝物，主要集中在支鏈氨基酸的代謝、葡萄糖的能量代謝、三羧酸循環(huán)代謝和脂代謝，而其代謝狀況表明尿毒癥造成了體內(nèi)嚴重的代謝紊亂。

4 結(jié) 論

尿毒癥會引起體內(nèi)多種代謝紊亂。本研究應用基于1H-NMR的尿樣代謝組學方法，通過對尿毒癥患者與正常健康組尿樣的對比分析，分析了尿毒癥引起的代謝紊亂情況，明確了一些潛在的特征代謝物的發(fā)生發(fā)展特征，并用于初步闡述尿毒癥的生化機制和病理特征。后續(xù)的研究中，會結(jié)合尿毒癥早期及通過手術(shù)手段治療后恢復的情況進行研究，為尿毒癥的診斷和治療提供更好的實驗依據(jù)。