秦世榮 趙琪? 程振國 蘇麗霞 單崇新?

1)(鄭州大學物理工程學院,材料物理教育部重點實驗室,鄭州 450000)

2)(鄭州大學基礎醫(yī)學院,分子腫瘤學研究中心,鄭州 450052)

1 引 言

近年來,隨著納米醫(yī)學的發(fā)展,納米材料在生物醫(yī)學領域的應用研究受到了越來越多的關注[1?4].如半導體量子點、碳量子點、稀土上轉換納米粒子等具有良好的熒光特性,可用作熒光探針對癌細胞進行標記,以實現腫瘤的定位和癌細胞擴散的追蹤[5?7].此外,納米粒子獨特的尺寸和表面結構特性使其可以負載藥物并將藥物輸運至癌癥部位,實現靶向治療[8,9].因此,納米材料在納米醫(yī)學領域具有廣泛的應用前景.傳統(tǒng)的納米藥物載體包括碳納米管、脂質體、聚合物納米粒子、金屬納米粒子等,可以通過化學連接,物理包覆等方式進行藥物裝載[10?14],取得了良好的藥物治療效果.然而,由于這些材料具有化學性質不夠穩(wěn)定、制備過程較為復雜、成本較高等缺點,從而限制了其大規(guī)模的應用.納米金剛石(nanodiamond,ND)是一種新穎的碳納米材料,化學穩(wěn)定性良好、生物毒性極低且具有良好的生物相容性,是目前已知毒性最低的納米材料[15?17],因此受到了越來越多的關注.此外,ND可通過成熟的爆轟法合成,方法簡單,且可大批量生產.爆轟法合成的納米金剛石的尺寸可小至3—5 nm,擁有較大的比表面積和豐富的表面官能團,通過對納米金剛石進行特定的表面修飾可以實現表面功能化,功能化的ND可以通過物理吸附或化學嫁接的方式裝載小分子物質或核酸,用于藥物運輸或組織支架等[18?22],這使爆轟法ND展現出良好的應用前景.然而,爆轟法納米金剛石尺寸較小,表面官能團復雜,顆粒間可通過的范德瓦爾斯力、氫鍵等相互吸引,形成團聚體,導致其在溶液中的分散性較差,從而限制了其在生物醫(yī)學上的應用[23?25].雖然有研究人員對納米金剛石的分散進行了一些探究[26],然而對分散后的ND的藥物裝載和釋放性能以及生物毒性的探究還未見報道.

基于以上考慮,本文選取爆轟法納米金剛石作為碳納米材料,通過機械研磨和超聲分散的方法對其進行了分散,然后通過酸洗使納米金剛石表面具有均一的化學官能團,改善了ND在溶液中的分散性;探究了表面功能化的ND對阿霉素的吸附和釋放特性以及功能化ND和載藥ND對SGC-7901胃癌細胞系的生物毒性(圖1).整體上,本文對納米金剛石作為藥物運輸載體的性質進行了系統(tǒng)的研究,這對于促進其在藥物運輸領域的應用具有重要的借鑒意義.

圖1 納米金剛石的分散、修飾及藥物裝載與釋放機理Fig.1.The disintegration,functionalization,drug loading and release of nanodiamond.

2 實 驗

2.1 實驗試劑與儀器

主要化學藥品包括:鹽酸阿霉素(上海阿拉丁生化科技有限公司)、納米金剛石粉末(鄭州華晶微鉆股份有限公司),濃鹽酸(A.R.)、濃硫酸(A.R.)、濃硝酸(A.R.)(洛陽化學試劑廠)、氫氧化鈉(A.R.)(上海阿拉丁生化科技有限公司).

主要儀器:傅里葉變換紅外譜儀 (FTR,Thermol Nicolet iz10,美國),Zetasizer Nano ZS90(Malvern,英國)、透射電子顯微鏡 (TEM,FEOL-2010,日本),X射線粉末衍射儀 (XRD,D/MAX-3B,日本)、分光光度計 (UH-4150,Hitachi日本)、酶標儀(Thermo Fisher,美國).

2.2 納米金剛石的分散

本文采用氯化鈉機械研磨和超聲破碎法對ND進行分散.具體步驟為:首先將10 g氯化鈉晶體與0.25 g ND粉末置于瑪瑙研缽中混合并研磨30 min,隨后將混合物溶于20 mL去離子水中并轉移至50 mL燒杯中.使用超聲波發(fā)生器在60%輸出功率下對燒杯中的液體超聲破碎100 min(頻率60 kHz).超聲結束后,將溶液配置成100 mL去離子水溶液,分別裝入兩個50 mL eppendorf離心管中,以8000 r/min離心10 min,得到納米金剛石沉淀.然后將沉淀物重新分散于100 mL去離子水中并再次離心處理,在12000 r/min轉速下離心1 h.最后,倒掉上清液并將沉淀置于真空干燥箱中干燥48 h得到分散的納米金剛石.

2.3 納米金剛石的表面修飾

首先,將0.25 g的爆轟法納米金剛石置于馬弗爐中,在425?C下退火4 h.隨后,將退火的納米金剛石粉末分散于68 mL強氧化性的混合酸液中(H2SO4:HNO3=3:1)并在200 W的功率下超聲分散1 h,然后將其轉移到100 mL圓底燒瓶中于80?C恒溫攪拌48 h.攪拌結束后,待混合液冷卻至室溫,以8000 r/min離心5 min得到ND沉淀,先用RO水洗滌兩次后,再分別用0.1 M NaOH和HCl溶液對納米金剛石沉淀在100?C下各攪拌洗滌2 h,將沉淀離心干燥得到羧基化的納米金剛石粉末ND-COOH.

2.4 鹽酸阿霉素吸收標準曲線的測定

根據Lambert-Beer定律,物質對某一波長的吸收度與物質的濃度呈線性關系.因此,利用Lambert-Beer定律,在一定濃度范圍內可以根據溶液中阿霉素的吸收度計算得到溶液中阿霉素的濃度.而這需要首先得到濃度與吸收度的標準曲線.為了繪制標準曲線,將鹽酸阿霉素配置成0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125 mg/mL等一系列不同濃度的水溶液,然后使用紫外可見分光光度計分別測量不同濃度阿霉素溶液的吸收譜,從而得到500 nm處的吸光度值隨濃度的變化關系,通過origin線性擬合,得到阿霉素的吸收度-濃度標準曲線.

2.5 納米金剛石的藥物負載與藥物釋放性能測試

將10 mg羧基化的納米金剛石分散于50 mL去離子水中超聲振蕩10 min使納米金剛石得到充分分散,隨后向溶液中加入5 mg鹽酸阿霉素并持續(xù)攪拌.隨后,以特定的時間間隔取2 mL溶液進行離心得到上清液,并使用分光光度計測上清液中阿霉素的吸光度,根據標準曲線計算得到阿霉素的含量.然后將不同時間點阿霉素含量的數據進行線性擬合,得到阿霉素的裝載量隨時間變化的標準曲線.負載藥物后得到的ND-藥物復合體記為ND-dox.

在藥物釋放實驗中,將5 mg ND-dox藥物復合體溶于12 mL去離子水中分散均勻,然后分別裝入三個透析袋中.將透析袋放入100 mL pH 5.0,6.5,7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,在37?C恒溫攪拌(300 r/min).在特定的時間點取PBS溶液進行吸光度測量,持續(xù)20 h.最后,根據吸收度標準曲線計算阿霉素的釋放量,進而得到阿霉素的累積釋放量隨時間的變化曲線.

2.6 細胞毒性和細胞殺傷性能檢測

將SGC-7901胃癌細胞系培植于96孔板中,每孔密度為8000,然后在37?C,5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h.隨后,用新鮮的DMEM培養(yǎng)液沖洗細胞,向每孔加入100μL新鮮的DMEM培養(yǎng)液并加入不同濃度的羧基化納米金剛石ND-COOH以及ND-dox,在37?C,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h.最后,向細胞板的每個孔中加入10μL MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,培養(yǎng)2 h.最后,使用酶標儀測量每孔細胞在490 nm處的吸光度,計算出每孔細胞的活性.

3 結果與討論

3.1 ND的形貌和結構

如圖2(a)所示,從TEM圖中可以看到ND由于顆粒之間的范德瓦耳斯力和氫鍵等相互作用而形成了團聚體.雖然爆ND單晶粒的尺寸為5 nm左右(圖2(a)插圖),然而其團聚體的尺寸則達到了幾百納米,這不利于其進一步的應用.從圖2(b)中高分辨率透射電鏡圖可以看到明顯的衍射條紋,條紋間距為0.206 nm,與金剛石(111)面的晶格衍射相符合[19].圖2(c)所示為ND粉末的XRD譜,在2θ =43.57?和2θ =75.15?處出現了明顯的衍射峰.與金剛石標準pdf卡片對比,ND的衍射峰與pdf卡片中金剛石的衍射峰符合得較好,表明43.57?和75.15?的衍射峰分別來自納米金剛石(111)面和(022)面的晶格衍射.以上結果表明,雖然爆轟法ND單晶的粒徑為3—5 nm,但是其形成了較大尺寸的團聚體(<200 nm),因此對其進行進一步的分散是必要的.

圖2 (a)ND的透射電鏡圖;(b)ND的高分辨率透射電鏡圖;(c)ND的X射線衍射譜圖Fig.2.(a)TEM;(b)HRTEM;(c)XRD spectrum of ND.

圖3 納米金剛石的粒徑分布和膠體 (a)研磨分散前的粒徑分布;(b)研磨分散后的粒徑分布;(c)0 h時納米金剛石膠體照片;(d)12 h時納米金剛石膠體圖片Fig.3.Size distribution and colloidal of nanodiamond:(a)Before deaggregation and(b)after deaggregation;(c)the colloidal of nanodiamond at 0 h;(d)the colloidal of nanodiamond at 12 h.

圖4(a)ND的FTIR譜;(b)溶液中ND與ND-COOH的zeta電勢Fig.4.(a)FTIR spectra of nanodiamond;(b)zeta potential of ND and ND-COOH in solution.

ND顆粒之間由于相互吸引作用形成的大尺寸團聚體使其在水溶液中的分散性較差.為了提高ND在水溶液中分散性,我們采用NaCl機械研磨與超聲破碎相結合的方法對其團聚體進行解離.將10 g NaCl晶體與0.25 g ND混合后,ND團聚體被均勻地分散在NaCl中,在機械研磨的外力作用下,ND團聚體受到周圍NaCl晶體持續(xù)的碰撞和碾壓,在碰撞和碾壓過程中提供的能量足以破壞ND顆粒之間的范德瓦耳斯、氫鍵等相互作用能,從而對ND團聚體進行解離.最后再使用超聲破碎儀對解離后的ND進行進一步的破碎,并用動態(tài)光散射法測量納米金剛石分散前后的粒徑分布.結果如圖3所示,分散之前ND的粒徑集中分布在230,1483以及4800nm處,平均粒徑為1525 nm(圖3(a)).而研磨超聲分散之后,ND的粒徑集中分布在91 nm附近,平均粒徑為215 nm,與分散之前相比減小了6倍(圖3(b)).圖3(c)和圖3(d)分別展示了ND分散前后其膠體溶液分散狀態(tài)隨靜置時間的變化.分散之前的ND膠體(標記為H)在0 h呈均勻的膠體分散狀態(tài)(圖3(c)),而12 h之后溶液上半部分逐漸變澄清,這是因為大顆粒的ND團聚體迅速沉降在了樣品池底部(圖3(d)).相比之下,經過機械分散后的ND由于具有更小的粒徑,其膠體(標記為J)在12 h內的狀態(tài)沒有發(fā)生明顯變化,表現出良好的膠體穩(wěn)定性.這說明通過研磨和超聲破碎對ND進行分散,有效減小了納米金剛石團聚體的粒徑,從而明顯提升了ND膠體的穩(wěn)定性,改善了ND的分散效果.

ND表面具有豐富的化學結構如sp2碳,C—H,C—O等,為了使ND可以應用于生物醫(yī)學領域,對其表面進行功能化得到均一的表面官能團具有重要意義.本文通過混合酸氧化的方法在ND表面修飾了均一的羧基官能團(—COOH),得到了羧基修飾的納米金剛石(ND-COOH).ND-COOH在水溶液中電離出H+從而具有負的表面電勢,可以吸引帶正電的小分子[19].如圖4(a)紅外譜所示,與未經修飾的ND相比,酸洗處理后的納米金剛石FTIR譜中2930 cm?1附近C—Hx的伸縮振動峰消失,同時在1758 cm?1出現了明顯的C=O吸收峰,這來自—COOH中C=O伸縮振動,表明酸洗后ND表面C—Hx等化學結構被氧化并生成了—COOH.圖4(b)界面電勢結果顯示,酸洗后的ND-COOH具有負的表面zeta電位,這是因為NDCOOH表面羧基—COOH水解出H+后,轉變成帶負電的—COO?使ND-COOH表面呈現出負電性.未修飾的ND表面官能團種類較為繁雜不均一,因此未修飾的ND顯示出微弱的正電性.因此,通過對ND進行表面功能化修飾,得到了表面官能團均一的羧基化納米金剛石ND-COOH,其表面的羧基官能團在水溶液中呈現出負電性.

3.2 藥物的負載與釋放性能

本文采用鹽酸阿霉素(dox)作為模型藥物來探究納米金剛石的藥物負載與釋放性能,并采用吸光光度法對阿霉素的裝載和釋放進行定量探究.根據Lambert-Beer定律,溶質的吸光度與濃度在一定范圍內呈線性關系:

(1)式中A為吸光度;T為透射比,是出射光強度與入射光強度的比值;K為摩爾吸收系數,與物質的性質及入射光波長有關;c為物質的濃度(mol/L);b為吸收層厚度(cm).

在吸光度檢測中,定義樣品池厚度b0,則樣品吸收層厚度也為b0,當選定入射光波長為500 nm后,阿霉素的摩爾吸收系數K0也為常數,此時吸光度A0與阿霉素濃度c0呈線性關系,因此有

由于實驗條件等外界因素會對儀器測量結果造成誤差,從而使A0與c0之間不成嚴格的正比關系,所以實際上

式中K0b0和h均為常數.

在本實驗中,如圖5(a)所示,阿霉素的吸光度隨濃度的減小而不斷下降.取阿霉素吸收譜中500 nm處的吸光度A0與濃度c0的數據點進行擬合得到:

與(3)式比較得到

(5)式表明阿霉素的吸光度與濃度呈線性關系,符合Lambert-Beer定律(圖5(b)).利用(5)式,可以根據吸光度計算溶液中阿霉素的含量.

為了探究ND-COOH對藥物的負載能力并得到藥物復合體,將ND-COOH與鹽酸阿霉素混合溶于水中攪拌進行藥物裝載.在藥物負載過程中,ND-COOH在水溶液中電離出H+后轉變?yōu)樨撾娦缘腘D-COO?(如圖4(b)),這使其能夠吸附帶正電的小分子物質.鹽酸阿霉素分子鏈端的氨基在水溶液中質子化后轉變?yōu)閹д姷腘H+3使阿霉素分子帶正電,因此鹽酸阿霉素可以通過靜電相互作用吸附在ND-COOH表面.如圖6(a)所示,ND對阿霉素的累積吸附量隨時間而緩慢增加,在24 h左右趨于穩(wěn)定,此時阿霉素在納米金剛石表面的吸附與脫附過程達到平衡,平衡時藥物吸附量為325μg/mg(Dox:ND),遠高于目前已報道的ND的藥物裝載量[27].這是因為納米金剛石團聚體被分散后增大了總體的表面積,提高了表面的吸附位點,從而增加了對阿霉素的吸附量[28].所得到的負載藥物后的納米金剛石即為藥物復合體ND-dox.

圖5 阿霉素的標準曲線 (a)不同濃度阿霉素溶液的吸收譜;(b)吸收度與濃度關系的擬合曲線Fig.5.Standard curve of dox:(a)Absorbance of dox aqueous solution with different concentration;(b) fitting curve of absorbance versus concentration of dox.

圖6 (a)ND-COOH對阿霉素的吸附量隨時間的變化;(b)阿霉素與納米金剛石藥物復合體(ND-dox)的FTIR譜Fig.6.(a)The variation of loading quantity of dox versus time;(b)FTIR spectra of ND-dox compound.

為了進一步驗證藥物復合體ND-dox的化學成分,采用FTIR分別對dox和ND-dox進行了檢測.結果如圖6(b)所示,在鹽酸阿霉素的FTIR譜中出現了特定化學結構的特征峰,其中1727 cm?1處的吸收峰來自N—H彎曲振動,而1576,1005 cm?1處的吸收峰分別來自—CHx和C—OH鍵的彎曲振動[29],這些峰位與阿霉素的分子結構特征峰相符.在ND-dox的FTIR譜中,在1766 cm?1處出現了羧基的C=O伸縮振動,這來自于ND表面的羧基官能團,此外在1727,1576以及1005 cm?1附近也同時出現了阿霉素分子的特征吸收峰,進一步說明了藥物復合體中ND與阿霉素同時存在.

圖7 (a)在pH 5.0,6.5以及7.4的PBS中阿霉素的累積釋放量隨時間的變化;(b)阿霉素的脫吸附與環(huán)境pH的關系示意圖Fig.7.(a)The variation of cumulative release of dox in pH 5.0,6.5 and 7.4 PBS solutions;(b)schematic illustration of the desorption/adsorption process of dox.

納米粒子裝載抗腫瘤藥物在體內循環(huán)過程中會經歷不同pH的生理環(huán)境.一般情況下,腫瘤組織部位pH為5.5左右呈酸性,明顯低于正常血液的pH 7.4,因此可以利用不同pH的PBS溶液模擬人體內不同pH的生理環(huán)境.將裝有等量ND-dox藥物復合體的透析袋分別置于pH 5.0,6.5和7.4的PBS溶液中攪拌,并定時檢測溶液中阿霉素吸光度變化,然后利用標準曲線將溶液吸光度的變化轉變?yōu)榘⒚顾貪舛鹊淖兓?得到鹽酸阿霉素的累積釋放量.如圖7(a)所示,整體上,ND-dox在不同pH環(huán)境中的累積釋放量均隨時間的增加而緩慢增加,并在18 h之后趨于平穩(wěn),此時阿霉素的脫附與吸附達到動態(tài)平衡.其中,在pH 5.0的PBS中阿霉素的累積釋放達到85%,而在pH 6.5和7.4的PBS中,阿霉素的累積釋放則分別為58%和37%,表明溶液酸性越強越有利于阿霉素的釋放,從而表現出pH依賴藥物釋放特性.前面提到,ND-dox中,ND-COOH與dox之間通過羧酸根和氨基的靜電相互作用結合在一起(圖6),因此ND-dox的pH響應依賴釋放行為來自于納米金剛石羧基與阿霉素分子之間的靜電相互作用強度隨環(huán)境pH值的變化.如圖7(b)所示,在低pH溶液中,H+濃度較高,此時ND-COOH表面的—COO?被還原為—COOH,減弱了ND-COOH與阿霉素分子之間的靜電相互作用,從而促進了阿霉素的釋放,且H+濃度越高,ND-COOH表面的—COO?越少,平衡狀態(tài)下阿霉素的釋放量越大,從而呈現出pH依賴藥物施放特性.一般情況下,人體腫瘤組織的pH為5.5左右,比正常組織的pH低[30,31],因此利用ND-COOH對阿霉素的pH響應釋放特性,可用ND-COOH作為納米載體實現藥物輸運和pH觸發(fā)靶向釋放,這將有助于提高藥物的利用率并降低藥物對正常組織的毒副作用.

3.3 細胞毒性

納米粒子的生物毒性及其載藥治療效果是納米粒子在生物醫(yī)學領域應用的重要指標,因此本文采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)檢驗了ND的生物毒性及其藥物復合體ND-dox對細胞的殺傷力.MTT檢測結果如圖8所示,在0—150μg/mL濃度范圍內,雖然SGC-7901細胞活性隨濃度增加有所下降,但整體上均大于85%,說明ND-COOH具有較低的生物毒性.而藥物復合體ND-dox對腫瘤細胞的體外殺傷實驗結果(如圖8)表明,在0—80μg/mL濃度范圍內,SGC-7901細胞的活性沒有明顯變化,而當濃度大于80μg/mL時,ND-dox對SGC-7901細胞產生了明顯的抑制作用,這是因為隨著DMEM中ND-dox含量的增加,dox的累積釋放量也不斷上升,從而增強了對腫瘤細胞的殺傷.因此,綜合以上結果,經過分散和表面功能化的ND對SGC-7901細胞的活性沒有顯著影響,具有較低的生物毒性,而其負載藥物后可實現藥物的體外釋放和細胞有效殺傷.

圖8 ND與ND-dox對SGC-7901細胞活性的影響(n=3,p<0.05)Fig.8.In fluence of ND and ND-dox on the viability of SGC-7901(n=3,p<0.05).

4 結 論

本文對ND的分散、功能化修飾、藥物裝載與釋放特性以及細胞毒性進行了系統(tǒng)的探究和討論.通過氯化鈉研磨和超聲破碎法對爆轟法納米金剛石進行解離,使其團聚體粒徑減小了6倍.通過強酸氧化處理得到了表面羧基化的納米金剛石NDCOOH,其在水溶液中由于羧基電離后呈現出較高的負Zeta電位?30.6 mV,這使其可以與阿霉素分子之間通過靜電相互作用相結合,從而實現阿霉素的負載得到ND-dox.由于納米金剛石的有效分散提高了納米金剛石表面吸附位點數量,因此納米金剛石對鹽酸阿霉素的裝載率達到了325μg/mL.此外,由于高濃度H+會導致ND-COOH與dox分子之間靜電相互作用減弱,因此ND-dox藥物復合體在低pH的PBS溶液中具有較高的藥物釋放速率,表現出顯著的pH依賴藥物釋放特性,這個特點使其有望用于pH觸發(fā)靶向藥物輸運.最后,ND-COOH的細胞毒性和ND-dox對SGC-7901細胞系的殺傷實驗結果初步表明,羧基功能化后的ND具有較低的細胞毒性,而載藥后的ND-dox則可以對SGC-7901細胞系產生顯著的治療效果,表明ND作為藥物載體可以裝載藥物后進行有效的腫瘤細胞殺傷.這些結果表明了納米金剛石在生物醫(yī)學領域具有一定的發(fā)展?jié)摿?此外,本工作為納米金剛石在藥物運輸載體方面的應用提供了借鑒.

感謝鄭州大學物理工程學院“金剛石光電材料與器件”課題組所有老師和同學在材料表征、理論分析等方面提供的幫助;感謝鄭州大學醫(yī)學科學院王堯河老師和鄭州大學第一附屬醫(yī)院樊慧杰老師在生物醫(yī)學實驗上提供的支持.