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        輸合配穴針刺法促進脂多糖LP S早產(chǎn)鼠腦損傷中MAG及NgR表達的研究*

        2018-09-11 12:52:02胡曉麗王雪峰
        西部中醫(yī)藥 2018年6期
        關鍵詞:乳鼠腦性新生

        李 楠,胡曉麗,王雪峰

        遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032

        人類新生兒尤其是早產(chǎn)兒存在高風險的腦損傷。腦性癱瘓定義了一組非進行性機能損害綜合征,明顯存在于胎兒期或出生后早期生活階段。每千名新生兒中就有2.5名腦性癱瘓兒童[1]。然而腦性癱瘓早前被認為主要是由于產(chǎn)時窒息缺氧引起的,實際上這個原因只占了引起兒童腦性癱瘓原因的一小部分。最近的研究證明了胎兒或羊膜腔感染與腦性癱瘓有相關性,可以引起神經(jīng)發(fā)育障礙如神經(jīng)分裂癥[1]和帕金森氏?。?]。然而,引起腦性癱瘓大部分的病因仍然未知。近年來,流行病學研究顯示產(chǎn)婦感染包括泌尿系感染,牙周感染都有可能與子宮內(nèi)的炎癥、早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量、子癇前期和腦性癱瘓有關[3-4]。盡管細菌脂多糖(LPS)、活性氧、促炎細胞因子參與了發(fā)病機理,但產(chǎn)婦或胎兒感染危及胎兒發(fā)育的機制尚不清楚。LPS可以直接誘導炎癥反應(如IL-6)和抗炎細胞因子(如IL-10)。LPS進一步誘發(fā)介質(zhì)本身的氧化應激誘導細胞因子的產(chǎn)生[5]。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實驗動物 由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供孕17天SD大鼠13只,平均體質(zhì)量320克,動物實驗合格證號:SCXK(京)2007-0001。

        1.1.2 脂多糖(LPS)溶液的配制 將1 mg LPS由Sigma公司提供(Lipopol-ysaccharides,Escherichia coli 055:B5溶于10mL生理鹽水中。

        1.2 方法

        1.2.1 造模方法 將10只脂多糖組孕鼠從孕17天開始到出生,每12小時注射200 μg/kg脂多糖,3只生理鹽水組孕鼠給予腹腔注射同劑量的生理鹽水[6]。設定孕22天前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠。本實驗將LPS足月產(chǎn)乳鼠剔除,新生早產(chǎn)鼠隨機分配為針刺組和非干預組。觀察者采用盲法的方式隨機分配每只孕鼠接受脂多糖或生理鹽水注射以減少偏差。

        1.2.2 動物分組 本實驗中5只孕鼠腹腔注射脂多糖后于孕22天前分娩仔鼠56只,其中6只死亡,剩余50只仔鼠隨機分為針刺組(n=30)和非干預組(n=20)。此外,3只孕鼠腹腔注射生理鹽水后,于孕22天分娩仔鼠30只,無死亡,從中隨機選出20只做為對照組。到生后21天為止,針刺組和非干預組均死亡5只,對照組無死亡。

        1.2.3 干預方法 選取出生后3日齡針刺組仔鼠給予針刺治療,按照“輸合配穴”理論選取“曲池”“三間”“足三里”“陷谷”進行手針治療,日一次不留針,干預至仔鼠3周齡。非干預組及對照組正常喂養(yǎng)不予干預措施,全部乳鼠每日進行一次神經(jīng)行為學檢測。

        1.3 觀察指標

        1.3.1 新生鼠發(fā)育測試結(jié)果 按照Wu等[7]人提出的新生鼠13項生長發(fā)育測試,分別為平面翻正、覓食反射、懸崖回避、負趨地性、前肢放置、前肢抓握、耳朵抽搐、驚愕反射、空中翻正、活動力、睜眼時間、懸吊試驗、曠野試驗。全部新生乳鼠從出生后第1天至第21天,每天從第1項至第11項進行一次測試,出生后第21天對第12項和第13項進行測試以避免出現(xiàn)選擇偏倚。觀察者采用盲法,兩人為一組對乳鼠進行評估。反應時間設定為30秒內(nèi),無反應計分為30秒。

        1.3.2 病理觀察 乳鼠出生后,取胎盤做HE染色,以觀察孕鼠宮內(nèi)感染情況,以大量中性粒細胞浸潤做為判斷標準。

        1.3.3 MAG及NgR表達的測定 針刺組和非干預組2組分別于仔鼠出生后7天,14天及21天各隨機選5只斷頭取腦用于制作石蠟切片,應用western blot方法觀察MAG及NgR的表達。

        1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包,計量資料采用(±s)表示,采用方差分析方法(ANOVA)進行比較。P<0.05表示有差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 新生鼠發(fā)育測驗結(jié)果 平面翻正、懸崖回避及驚愕反射針刺組、非干預組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。前肢放置測試針刺組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),非干預組與與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。懸崖回避測試針刺組與非干預組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。懸吊實驗、曠野實驗3組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。負趨地性測試和耳朵抽搐測試這2項未測出結(jié)果。見表1。

        表1 新生乳鼠神經(jīng)生長發(fā)育測試結(jié)果 分

        2.2 蛋白免疫印跡結(jié)果

        2.2.1 MAG的表達 脂多糖新生乳鼠生后7天即可見MAG的表達,生后14天逐漸升高,生后21天逐漸下降但仍高于生理鹽水組。針刺組和對照組生后7天相對光密度值分別為(0.251±0.006)和(0.149±0.006),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);生后 14 天分別為(0.267±0.017)和(0.155±0.014),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);生后21天分別為(0.310±0.007)和(0.166±0.005),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1—2。

        圖1 乳鼠腦組織MAG免疫印跡分析,1-3分別為對照組生 7d、14d、21d;4-6 分別為針刺組生后 7d、14d、21d

        圖2 MAG不同時間點相對光密度值, 各組比較有顯著性差異(P<0.01)

        2.2.2 NgR的表達 隨發(fā)育成熟NgR的表達逐漸增強。生后7天即可見NgR的表達,生后14天至生后21天NgR的表達逐漸增強。針刺組及對照組生后7天相對光密度值分別為 (0.234±0.006)和(0.114±0.004),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);生后 14 天分別為(0.289±0.006)和(0.131±0.003),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);生后21天分別為(0.335±0.007)和(0.186±0.004),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3—4。

        圖3 乳鼠腦組織NgR免疫印跡分析,1-3分別為對照組 生后 7d、14d、21d;4-6 分別為針刺組生后 7d、14d、21d

        圖4 NgR不同時間點相對光密度值, 各組比較有顯著性差異(P<0.01)

        3 討論

        腦白質(zhì)損傷的特征是喪失前髓鞘少突膠質(zhì)細胞,是早產(chǎn)兒腦損傷最常見的形式,并伴有神經(jīng)發(fā)育障礙的高風險[8]。其中最嚴重的損害發(fā)生在不成熟的大腦,可以導致類似于腦性癱瘓的終身運動、姿勢及認知的失調(diào)[9-10]。WMI的病理生理學是很復雜的,產(chǎn)婦感染是其發(fā)育過程中的重要因素[11-12]。

        《靈樞·邪氣藏府病形》曰:“滎輸治外經(jīng),合治內(nèi)府?!本褪钦f輸穴多治療經(jīng)脈的外周病證,肢節(jié)竣痛及五臟病變。五輸穴之井、滎、輸、經(jīng)、合與人體皮、脈、肉、筋、骨、臟腑的對應關系也具有相似對應的主治規(guī)律。合穴位于肘膝關節(jié)附近,是經(jīng)氣由此深入進而會合于臟腑的部位,歷來醫(yī)家多認為其具有較強的健脾強胃,扶正培元,提高臟腑功能的作用,則多治臟腑的內(nèi)在疾患。通過上述分析,本實驗中選用的輸合配穴法,至陰經(jīng)即為原合配穴法,陰經(jīng)之五輸穴中合穴為井穴之母,根據(jù)針灸中“補母瀉子法”,進針時兩穴均采用補法,可直接調(diào)節(jié)五臟之原氣,激發(fā)患兒原動力;至陽經(jīng)進針時采用瀉輸補合之手法,以舒筋通脈,調(diào)節(jié)筋肉不利之癥。從而起到和內(nèi)調(diào)外,標本兼治的作用。

        髓磷脂相關糖蛋白(MAG)表達于CNS的少突膠質(zhì)細胞和PNS的雪旺細胞,是髓鞘的重要組成成分。隨著后來研究的深入發(fā)現(xiàn)MAG具有雙重作用,即一方面可以抑制發(fā)育中的小腦、成熟胚胎背根神經(jīng)節(jié)(DRG)及NG108-15細胞軸突的生長,另一方面能夠促進新生DRG軸突的生長,主要取決于神經(jīng)元的年齡。國外有研究報道NgR基因可以影響小鼠的行為。

        此實驗首次采用國外對于腦癱乳鼠機能和認知發(fā)育評估使用的神經(jīng)生長發(fā)育測試項目,對新生乳鼠從出生后第1天至第21天每天進行系統(tǒng)檢測。通過對孕鼠腹腔注射脂多糖后可以引起乳鼠腦白質(zhì)損傷,但是并不能出現(xiàn)與中度至重度腦癱患兒一致的腦性癱瘓表型。此外,通過神經(jīng)行為學鑒定后發(fā)現(xiàn),使用“輸合配穴”針刺法治療還是有效的。

        本動物實驗設計的目的是,研究通過慢性刺激的炎癥反應引起未成熟少突膠質(zhì)細胞損傷增加。但是由于研究的時間過短,并沒有觀察到LPS處理組老鼠表現(xiàn)出腦性癱瘓的表型特點。今后進一步的研究將重新設定LPS使用時間和劑量,以及神經(jīng)行為學觀測時間,以觀察LPS處理組老鼠從幼年期到成年期的變化。

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