石 磊 ，韓亞飛 ，賈博宜 ，郭 一 ，丁龐華 ，謝添泓 ，孫中美 ，原文靜 ，譚 祥 ，李軍祥

1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 10029；2北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是屬于炎癥性腸病中最常見的一類疾病，好發(fā)于中青年，臨床主要癥狀為腹痛、腹瀉、排黏液膿血便，或伴隨多系統(tǒng)的腸外表現(xiàn)，此外還具有病程長、易復(fù)發(fā)等特點，給患者造成身體、心理、社會和經(jīng)濟上的多重壓力，嚴重者甚至威脅生命。目前，UC的確切發(fā)病機制仍不明確，相關(guān)研究［1］認為與腸屏障損傷、腸道菌群失常、抗原識別和免疫應(yīng)答的失常有關(guān)。其中，炎性細胞因子在UC的免疫發(fā)病機制中起到了重要作用，接導(dǎo)致組織損傷并影響其炎癥程度［2］。因此，研究藥物對炎性因子的具體作用，將會對UC的治療起到一定提示作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方可以明顯改善UC患者的臨床癥狀，降低疾病相關(guān)評分，促進鏡下黏膜修復(fù)［3］，并對 2，4，6- 三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitroBenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的腸炎大鼠腸黏膜有保護作用［4］。本研究試圖觀察清腸溫中方對TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠炎性因子的影響，尋找清腸溫中方在UC中的可能作用靶點，為清腸溫中方的臨床使用提供更多的實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，12 h/12 h：光照 / 黑夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度 50%～60%，自由飲食飲水。

1.2 試藥與試劑 清腸溫中浸膏方(黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，木香6 g等組成)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供；烏梅丸(由烏梅16 g，干姜10 g，黃柏6 g，桂枝6g等組成)購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒劑藥房；美沙拉秦緩釋顆粒(艾迪莎，中國上海愛的發(fā)制藥有限公司，國藥準字H20143164)；5%TNBS(w/v)(P2297)(美國 Sigma 公司)；無水乙醇、便潛血試劑盒(中農(nóng)博信(北京)科技有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)(EK0526)、白介素 6(IL-6)(EK0412)、干擾素(IFN-γ)(EK0374)、白介素13(IL-13)(EK0900)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；抗Occludin(ab31721)、抗 NF-κB p50(ab28849)抗體(美國Abcam公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將70只大鼠隨機分為空白組，模型組，清腸溫中方高劑量組(2.0 g浸膏/kg)、中劑量組(1.0 g浸膏/kg)、低劑量組(0.5 g浸膏/kg)，美沙拉秦組(400mg/kg)和烏梅丸組(8.4g生藥/kg)共7組，每組各10只。采用TNBS/無水乙醇改良復(fù)合法復(fù)制UC模型［4］。除空白組外，所有大鼠禁食不禁水12小時，10%水合氯醛(0.003mL/g)腹腔注射以麻醉大鼠，將石蠟油浸潤嬰兒灌腸管10 cm圓頭，由肛門緩慢插入8 cm，將終濃度33.3%無水乙醇的TNBS(100 mg/kg)溶液0.6 mL1分鐘內(nèi)一次性緩慢推注入內(nèi)，每只大鼠使用新灌腸管。保持仰臥位15分鐘后，放回籠內(nèi)棉花保暖至清醒。第4天起所有大鼠行常規(guī)飲食，同時連續(xù)10天給予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)(0.01 mL/g)，模型組用蒸餾水進行對照。實驗期間每天記錄大鼠體質(zhì)量，觀察一般情況和便質(zhì)，化驗便潛血。

1.3.2 標(biāo)本采集處理 實驗結(jié)束時以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，采血管靜置2小時后，4℃離心15分鐘(3 000 rpm)分離血清，分裝后-80℃冷凍備用；分離遠端結(jié)腸(距肛門10 cm)2 cm，于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片包埋，4 μm切片，抗原修復(fù)后采用DAB顯色法免疫組化染色觀察核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)p50蛋白表達。

1.3.3 疾病活動指數(shù)(Disease Activity Index，DAI)［5］體質(zhì)量下降率：無下降 0 分；1%～5%記 1 分；5%～10%記 2 分；10%～15%記 3 分；大于 15%記 4 分。便質(zhì)：正常0分，稀軟便2分；水樣便4分；便潛血：陰性0分；陽性2分；肉眼血便4分。DAI評分為3項評分的平均值。

1.3.4 免疫組化結(jié)果陽性表達 采用Image J軟件(1.37c NIH，USA)對染色結(jié)果進行分析，用平均光密度值(AOD=IntDen/Area)表示目標(biāo)蛋白染色強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用(±s)描述，用單因素方差分析進行檢驗，方差齊用LSD-t，不齊用Tamhane′s T2。不符合正態(tài)分布的計量資料及計數(shù)資料用中位數(shù)、p25和p75描述，用獨立樣本非參數(shù)檢驗的K-W檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清炎性因子 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6及IFN-γ與空白組比較明顯升高，經(jīng)藥物干預(yù)治療后的大鼠血清含量均有所下降，其中以中劑量和美沙拉秦組下降最為明顯。模型組血清IL-13含量比空白組明顯降低，經(jīng)藥物治療后，各組含量均明顯增多。見表1。

表1 各組血清炎性因子含量比較(±s) pg/mL

表1 各組血清炎性因子含量比較(±s) pg/mL

注：＊表示與空白組比較，P＜0.01；#表示與模型組比較，P＜0.01；##表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) TNF-α IL-6 IFN-γ IL-13空白組 10 67.53±14.88 90.49±5.08 21.64±2.46 44.49±7.15模型組 6 98.38±23.06＊ 181.39±58.67＊ 69.12±10.26＊ 21.01±4.87＊高劑量組 7 79.97±6.05 117.65±32.21## 39.86±5.70## 35.80±3.61#中劑量組 8 73.93±10.04## 99.93±19.50# 26.61±6.47# 40.31±5.79#低劑量組 7 79.59±21.52 154.30±80.55 50.06±6.95 34.92±2.60#美沙拉秦組 8 73.01±5.33## 92.73±14.10# 23.49±2.27# 42.15±1.46#烏梅丸組 8 78.38±16.44## 115.02±27.52## 34.89±4.69## 39.68±2.82#

2.2 D A I及一般情況 造模過程中，空白組大鼠表現(xiàn)正常，造模大鼠出現(xiàn)活動度下降、進食飲水量減少、喜蜷縮靜臥，毛發(fā)缺乏光澤、大便稀軟甚至出現(xiàn)黏液狀糞便等表現(xiàn)并逐漸加重。造模期間除空白組外，每組均死亡1只大鼠。用藥干預(yù)期間，模型組大鼠一般狀態(tài)仍然較差，進食量和體質(zhì)量持續(xù)下降，部分大鼠一直存在便潛血陽性甚至可見肉眼血便，治療期間死亡3只。其余大鼠整體狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，隨著藥物干預(yù)，進食和體質(zhì)量均逐漸增加，部分大鼠在治療結(jié)束前便潛血可轉(zhuǎn)陰性。治療期間，高劑量、低劑量組各死亡2只，中劑量、美沙拉秦組和烏梅丸組各死亡1只。最后1天DAI結(jié)果提示，與空白組相比，模型組評分顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較，清腸溫中方中劑量、美沙拉秦和烏梅丸組評分下降(P＜0.05)。見圖1。

圖1 DAI評分圖

2.3 N F-κBp50 免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，UC模型組大鼠腸道NF-κB p50表達量明顯高于空白組(P＜0.01)，陽性蛋白的表達范圍和染色強度均明顯升高。與模型組比較，清腸溫中方中劑量、美沙拉秦組和烏梅丸組，其陽性蛋白表達均有明顯下調(diào)(P＜0.01)。蛋白表達含量見圖2，免疫組化染色見圖3。

圖2 NF-κB p50蛋白表達含量差異圖

圖3 NF-κB p50蛋白免疫組化染色圖(x200)

3 討論

本實驗采用TNBS/無水乙醇復(fù)合法建立UC模型，前期我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNBS/無水乙醇復(fù)合法可以成功誘導(dǎo)大鼠實驗性腸炎［6］。UC的發(fā)病機制中，異?；罨拿庖邞?yīng)答一直是研究的熱點。其免疫學(xué)紊亂的特征在于：1)腸上皮損傷，包括黏液的異常生成和修復(fù)機制缺陷；2)由腸道菌群驅(qū)使的炎癥擴大和大量的細胞浸潤到固有層中；3)控制炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)失常，使炎癥級聯(lián)反應(yīng)進一步加大。因此，細胞因子在腸道炎癥的起始、介導(dǎo)、持續(xù)、控制和組織損傷方面不容忽視，而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的異?；罨蜁鹧仔砸蜃拥拇罅考せ詈歪尫?，引起一系列過激的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)［7］。

生理情況下，細胞質(zhì)中的NF-κB與抑制蛋白IκB以無活性的復(fù)合物形式存在于細胞中。內(nèi)在膜受體的介導(dǎo)會使一些胞外信號激活I(lǐng)κB激酶，使IκB磷酸化而發(fā)生解離，導(dǎo)致NF-κB活化；活化的 NF-κB 會參與 TNF-α、誘生型 NO、IL-1β、血管細胞黏附分子-1、IL-6、IL-8等多種炎癥因子或介質(zhì)的分泌，而這些細胞因子與UC的各個階段密切相關(guān)［8］。本實驗通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠結(jié)腸黏膜層NF-κB p50表達明顯增多，這可能與NF-κB的異常激活有關(guān)，而后者的激活會直接導(dǎo)致促炎因子、IFN-γ等表達上調(diào)，同時又直接參與到了TNF-α信號通路。

TNF-α通過旁分泌和自分泌形式在UC腸黏膜局部發(fā)揮作用，一方面活化內(nèi)皮細胞表面整聯(lián)素的表達、募集中性粒細胞、誘導(dǎo)NO合酶異構(gòu)體產(chǎn)生大量NO直接損傷細胞；另一方面與IFN-γ共同作用于腸屏障，破壞腸屏障完整，增加其通透性。此外也能促使IL-6等炎性因子的釋放，后者通過STAT-3途徑進一步激活NF-κB誘導(dǎo)黏附因子等的表達［9］。而IL-13作為具有抗炎效應(yīng)的一種Th2細胞因子，能從轉(zhuǎn)錄水平對G-CSF產(chǎn)生抑制，調(diào)節(jié)中性粒細胞的存活、增生和分化，并能增強成熟中性粒細胞功能，在抗感染的細胞免疫中起重要作用［10］。

清腸溫中方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李軍祥教授總結(jié)多年臨床的經(jīng)驗方，在UC治療中取得了很好的效果。李教授認為UC活動期屬于中醫(yī)的“腸澼”范疇，此病病位在腸，與脾胃關(guān)系密切；病性為本虛標(biāo)實，寒熱錯雜；本虛為脾虛、脾陽不足，標(biāo)實為濕熱內(nèi)蘊，夾有瘀血。治療當(dāng)以清腸溫中、化瘀止血，用于寒熱錯雜，濕熱瘀阻證。癥見腹瀉黏液膿血便，腹部冷痛，里急后重，口干口苦，小便短赤，肛門灼熱，苔黃厚膩，脈滑數(shù)或濡數(shù)。該方主要由黃連、炮姜、三七、木香等組成。研究顯示木香能夠下調(diào)大鼠血漿中前列腺素E2表達水平，而抑制炎性細胞，減輕腸道炎癥，通過啟動UC腸黏膜組織的防御機制，從而增強結(jié)腸黏膜屏障的防御機能［11］。黃連的主要成分黃連素可以通過抑制IL-6/STAT3信號通路而起到了緩解癥狀、減輕炎癥程度的治療作用［12］。而炮姜的有效成分6-姜酚對脾胃虛寒模型大鼠具有顯著的溫中散寒作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠以上促炎因子表達都明顯高于空白組，而當(dāng)藥物治療后，表達都能有所下降；因此推測炎性因子可能是清腸溫中方治療UC的作用靶點之一。清腸溫中方可能通過抑制TNF-α分泌激活和NF-κB的轉(zhuǎn)錄，減少了IFN-γ、IL-6等促炎因子表達，并上調(diào)IL-13這類抗炎因子，從而通過減輕和維持正常炎癥反應(yīng)，起到治療UC的作用。此外我們還發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方中劑量和美沙拉秦組在所有藥物治療組中，對炎性因子的作用最為明顯，這也為清腸溫中方的使用劑量和有效性提供了一定的實驗室數(shù)據(jù)支持。但本實驗樣本例數(shù)較少，有待進一步研究。

綜上所述，促炎因子相互間作用形成網(wǎng)絡(luò)，而抗炎因子的表達受抑制，使整體上擴大了炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致UC的發(fā)生。