吳建民 ，劉 曉 ，謝 千 ，李 寧

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州市靖遠(yuǎn)路社區(qū)衛(wèi)生中心；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎是骨傷科常見病之一，本病是由于膝關(guān)節(jié)滑膜受到急性創(chuàng)傷等刺激引起的滑膜水腫、滲出產(chǎn)生關(guān)節(jié)積液的一種非感染性炎癥反應(yīng)，屬中醫(yī)“痹癥”“鶴膝風(fēng)”等范疇［1］。輕者可見膝關(guān)節(jié)腫痛、屈伸不利，嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形甚至功能喪失。目前西醫(yī)治療主要以激素、非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥、封閉抽吸法治療，但不良反應(yīng)較多，效果不理想。近年來，中醫(yī)藥在治療滑膜炎方面顯示出良好的療效，并且痛苦小、不良反應(yīng)較少［2］。馬鈴薯外敷藥膏是我科在長期的臨床實(shí)踐中總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，對膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎的治療具有良好的消炎鎮(zhèn)痛效果，為探討其治療的作用機(jī)制，本研究選用新西蘭大白兔為研究對象，觀察馬鈴薯外敷藥膏對白介素1β(IL-1β)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級新西蘭大白兔40只，雌雄各半，3～4 月齡，體質(zhì)量 2.2～2.8 kg，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK(軍)2012-0029。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飲水飼料充足，光照節(jié)律 12 L/12D(7∶00-19∶00)，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%。

1.2 藥物與儀器 馬鈴薯外敷藥膏制備材料：馬鈴薯(自購)、明礬及冰片(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，批號：1714590，5707600)；制備方法：將馬鈴薯洗凈，放入器皿中搗成泥，撒上明礬和冰片(比例為馬鈴薯∶明礬∶冰片 =100∶4∶1)，充分?jǐn)噭颍洳乇４?制作1次馬鈴薯外敷藥膏最多為2天用藥量)；扶他林(北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990291)。兔IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒(大連范邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司)；3%戊巴比妥鈉、8%硫化鈉(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。鋼制兔臺、千分卡尺(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；“英迪”KWD-808-I型脈沖針灸治療儀(廣州康哲醫(yī)療器械有限公司)；HADAIA360型全自動(dòng)熒光磁微粒酶免分析系統(tǒng)/酶聯(lián)免疫分析儀(日本)。

1.3 造模方法 借鑒易世宏等［3］建立的膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎動(dòng)物模型，具體方法如下：將新西蘭大白兔固定，剪去右后肢膝關(guān)節(jié)周圍的毛，用8%的硫化鈉將剪剩的毛褪去，暴露皮膚。用3%戊巴比妥鈉按照1 mL/kg的比例由造模兔耳緣靜脈緩慢推注麻醉，然后將兔側(cè)臥于實(shí)驗(yàn)臺上，造模肢朝上，用針灸針垂直刺入兔造模肢股四頭肌中點(diǎn)和腓腸肌中點(diǎn)，連接“英迪”KWD-808-I型脈沖針灸治療儀，使用連續(xù)波波形，頻率始終保持為50 Hz，強(qiáng)度固定在6.0 mA，使其膝關(guān)節(jié)不停地重復(fù)被動(dòng)屈伸從而造成膝關(guān)節(jié)滑膜的損傷，每天2次，每次45分鐘，連續(xù)進(jìn)行10天。

1.4 分組與給藥 將40只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、馬鈴薯外敷藥膏組和扶他林乳膠劑組，每組10只。剔除大白兔膝關(guān)節(jié)周圍體毛，馬鈴薯外敷藥膏組給藥劑量約為18 g/次，扶他林乳膠劑組給藥劑量約為1.2 g/次，分別涂于受試兔右后肢膝關(guān)節(jié)損傷部位，范圍在膝關(guān)節(jié)上下各4 cm以內(nèi)，每天敷藥2次，每次90分鐘，連續(xù)進(jìn)行5天。正常組和模型組未給予藥物處理。

1.5 標(biāo)本采集與存儲 干預(yù)治療完成后，隔日采用空氣栓塞法將新西蘭大白兔處死，切開各組受試兔右后肢膝關(guān)節(jié)囊，用1 mL生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，回抽收集關(guān)節(jié)液將關(guān)節(jié)液置于已硅化試管中，4℃、1800r/min離心10分鐘，將上清液置于-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.6 指標(biāo)檢測與方法

1.6.1 大體觀察 通過肉眼大體觀察各組動(dòng)物受試膝關(guān)節(jié)周圍的皮色、關(guān)節(jié)液的色質(zhì)和滑膜厚度的變化情況。

1.6.2 受試關(guān)節(jié)周徑的測定 模型建立開始(第1天)至治療結(jié)束(第15天)，在各組大白兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)外兩側(cè)用記號筆標(biāo)記好固定的2點(diǎn)，使用千分卡尺和尼龍帶在固定點(diǎn)每天測量受試膝關(guān)節(jié)周徑，觀察各組之間的變化情況。

1.6.3 受試關(guān)節(jié)表面溫度測定 在各組大白兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)標(biāo)記固定不變的2個(gè)點(diǎn)，用數(shù)字體溫計(jì)探針在標(biāo)記的固定點(diǎn)每天測量造模開始至干預(yù)治療結(jié)束后各組動(dòng)物受試膝關(guān)節(jié)溫度，觀察之間的變化情況。

1.6.4 白細(xì)胞介素1β(IL-1β) IL-1β測定嚴(yán)格按照試劑盒檢測說明書操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。具體步驟：稀釋對照品→加樣品及對照品→加酶→顯色液→加入終止液→15分鐘內(nèi)450nm波長測OD值，根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值代入相應(yīng)公式計(jì)算最終濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)皮色、關(guān)節(jié)液色質(zhì)及滑膜厚度 各組大白兔膝關(guān)節(jié)皮色、關(guān)節(jié)液色質(zhì)及滑膜厚度大體觀察結(jié)果。見表1。

表1 各組兔膝關(guān)節(jié)皮色、關(guān)節(jié)液色質(zhì)及滑膜厚度大體觀察

2.2 兔膝關(guān)節(jié)周徑及表面溫度 大白兔膝關(guān)節(jié)周徑及表面溫度的測定結(jié)果。見表2。

2.3 馬鈴薯外敷藥膏對大白兔IL-1β表達(dá)的影響 與空白組相比，IL-1β的表達(dá)模型組最高，馬鈴薯外敷藥膏組次之，扶他林乳膠劑組最少；各組IL-1β與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；馬鈴薯外敷藥膏組與扶他林乳膠劑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義(P＞0.05)。見表3。

表2 各組兔膝周徑及表面溫度結(jié)果比較(±s)

表2 各組兔膝周徑及表面溫度結(jié)果比較(±s)

注：＊表示與模型組比較，P＜0.01，#表示與扶他林乳膠組比較，P＞0.05

組別 只數(shù) 關(guān)節(jié)周徑/cm 表面溫度/℃空白組 10 0.13±0.03＊ 35.81±0.24＊模型組 10 0.43±0.07 37.32±0.26馬鈴薯外敷藥膏組 10 0.23±0.02＊# 37.01±0.11＊#扶他林乳膠劑組 10 0.22±0.03＊ 36.97±0.15＊

表3 各組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β和TN F-α表達(dá)比較(±s)

表3 各組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β和TN F-α表達(dá)比較(±s)

注：＊表示與模型組比較，P＜0.01；△表示與扶他林乳膠組比較，P＞0.05

組別 只數(shù) IL-1β/(pg·mL-1)空白組 10 11.07±0.23＊模型組 10 13.82±0.82馬鈴薯外敷藥膏組 10 11.26±0.34＊Δ扶他林乳膠劑組 10 11.24±0.22＊

3 討論

膝關(guān)節(jié)是人體最復(fù)雜、滑膜分布最廣的關(guān)節(jié)，且關(guān)節(jié)負(fù)重大、活動(dòng)頻繁、易受到損傷，成為滑膜炎的高發(fā)部位［4］?；な艿綋p傷后，血管擴(kuò)張，產(chǎn)生大量滲出液，同時(shí)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生大量黏液素［5］。有效緩解膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎患者關(guān)節(jié)疼痛癥狀，減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)損傷軟骨修復(fù)被認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎臨床治療的關(guān)鍵［6］。本病屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹證”“鶴膝風(fēng)”等范疇，由內(nèi)因和外因相互作用而發(fā)病，先天稟賦不足、虛損勞倦為內(nèi)因，外感風(fēng)寒濕邪、筋脈瘀阻為外因，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)經(jīng)脈失養(yǎng)，氣機(jī)不暢，不榮則痛，不通則痛。治療以活血化瘀、消腫止痛、利水滲濕為主。

馬鈴薯外敷藥膏是我科在臨床實(shí)踐中總結(jié)的治療膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎的經(jīng)驗(yàn)方，該方由馬鈴薯、明礬及冰片組成，方中馬鈴薯性平味甘，具有解毒消腫、生肌止痛之功效；明礬性寒，味酸澀，有解毒殺蟲，燥濕止癢等功效；冰片辛、苦，微寒，具有開竅醒神，清熱止痛的功效。三藥合用，共奏消腫止痛、活血祛瘀、清熱解毒之功?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯抗菌抗炎的主要成分有生物活性肽、糖苷生物堿及酚類化合物等。黃志宏等［7］通過小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)、大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)馬鈴薯總糖苷生物堿具有較強(qiáng)的抗炎活性。唐霞珠等［8］研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯片外敷能明顯降低靜脈炎發(fā)生率，減輕炎性程度。陳文等［9］以銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌為研究對象，通過抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)明礬混懸液具有較強(qiáng)的體外抑菌作用。冰片有效成分主要為右旋龍腦、左旋龍腦或異龍腦等。常頌平等［10］研究發(fā)現(xiàn)冰片的最低抑菌濃度為5%、殺菌濃度為10%，并且在電鏡下觀察到冰片能破壞真菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使真菌溶解。

在滑膜炎發(fā)生發(fā)展中，有多種細(xì)胞因子參與并介導(dǎo)其炎癥過程，其中IL-1β在全身性及局部性炎癥中起著關(guān)鍵性的作用。Benito等［11］研究發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中出現(xiàn)炎性因子的過度表達(dá)，而這些炎性因子是該疾病進(jìn)展的重要遞質(zhì)，主要有IL-1β、TNF-α等。本研究結(jié)果表明，IL-1β的表達(dá)模型組最高，馬鈴薯外敷藥膏組次之，扶他林乳膠劑組最少。與模型組比較，馬鈴薯外敷藥膏組IL-1β的表達(dá)水平顯著降低，提示其能夠抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，在分子水平上揭示了馬鈴薯外敷藥膏治療膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性滑膜炎的療效機(jī)制。然而，本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處，雖然馬鈴薯外敷藥膏可以抑制IL-1β的表達(dá)，但其抑制IL-1β表達(dá)的最佳時(shí)間、最佳濃度仍需進(jìn)一步去探索。