韓志湘, 蔡春祥, 張功博， 姜夢云, 李 輝

(江蘇大學 環(huán)境與安全工程學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

次氯酸(HOCl)是生物體內一種重要的活性氧(ROS),可以與DNA、RNA、脂肪酸、膽固醇和蛋白等多種生物分子發(fā)生反應,具有很強的抗菌功能.然而,HOCl濃度的異常會導致神經元變性、心血管疾病、骨關節(jié)炎等疾病.與傳統(tǒng)的檢測HOCl方法相比,熒光探針法具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點,尤其是該方法可以與顯微鏡技術結合,實現(xiàn)對生物樣品中HOCl的可視化成像檢測[1].近年來,科研人員利用HOCl具有強氧化性的特點,將對甲氧基苯酚[2-3]、硫[4-10]、腙[11]、肟[12-13]、硒[14]等基團作為HOCl反應位點,發(fā)展了許多HOCl熒光探針.但目前報道的HOCl熒光探針或存在響應時間長,或探針本身熒光背景值較高,或需在堿性條件下檢測等諸多不足,影響了它的推廣應用[15-16].研制高性能HOCl熒光探針仍然是業(yè)界的研究熱點.

筆者以具有優(yōu)良光學性質的7-二乙胺基香豆素-3-羧酸為熒光團,將其與2,4-二硝基苯肼通過酰胺化反應鍵聯(lián),利用二硝基苯肼和酰肼中N—N單鍵自由旋轉的共同淬滅熒光團作用[17-18]獲得一種低熒光背景的熒光探針分子1(化合物1).同時,HOCl可高效切斷酰肼鍵[15-16],釋放出具有強熒光性能的 7-二乙胺基香豆素-3-羧酸.根據(jù)HOCl加入前后溶液熒光性質的顯著不同,構建一種具有高信噪比、高選擇性和高靈敏度的HOCl熒光探針,并將其應用于活細胞內HOCl熒光成像檢測.

1 試驗方案

1.1 試驗儀器與試劑

熒光測定使用Thermo Scientific Lumina 熒光分光光度計;紫外吸收光譜的試驗使用Shimadzu UV-2400紫外-可見分光光度計;核磁共振氫譜(1H NMR)在Varian INOVA-400核磁共振儀上獲得;溶液pH值使用瑞士Mettler Toledo FiveEasy Plus FE28型 pH計進行測定;細胞成像在Olympus公司的FV1000-MPE多光子激光共聚焦顯微鏡完成.

無水二氯甲烷、二氯亞砜和乙醚均按照標準方法干燥處理得到.TLC所用硅膠板和柱層析所用硅膠(100～200目)購自青島海洋化工廠.其余試劑均為分析純試劑,不需純化直接使用.試驗中均使用二次蒸餾水,由優(yōu)普超純水機 UPC-1-5制得.

1.2 探針分子1的合成

將7-二乙胺基香豆素-3-羧酸(化合物2,0.58 g, 2.2 mmol)加入100.00 mL圓底燒瓶中,逐滴滴加4.5 mL無水二氯亞砜.氮氣下,室溫攪拌3 h.反應結束后,抽濾,所得固體用無水乙醚洗滌,得黃色固體(0.5 g,產率81.4 %).未經純化直接投入下一步反應.探針分子1合成路線如圖1所示.

圖1 探針分子1的合成路線

在100 mL的圓底燒瓶中,將得到的7-二乙胺基香豆素-3-酰氯(0.36 g,1.3 mmol)和2,4-二硝基苯肼(0.16 g,0.8 mmol)溶解于50.00 mL無水二氯甲烷中,逐滴加入0.25 mL三乙胺.氮氣保護下,室溫攪拌18 h.反應結束后,抽濾,濾餅用二氯甲烷洗滌.真空干燥后,用V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=2 ∶ 1的石油醚-乙酸乙酯為淋洗液柱層析,旋除溶劑,得黃色固體0.25 g,產率為71.7%.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ(10-6)：10.56 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 8.89 (d,J=2.8 Hz, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.32 (dd,J=2.8 Hz, 9.6 Hz, 1H), 7.75 (d,J=9.2 Hz, 1H), 7.28 (d,J=9.6 Hz, 1H), 6.88-6.84 (m, 9.2 Hz, 1H), 6.68(d,J=2.0 Hz, 1H), 3.52 (q,J=7.0 Hz, 4H), 1.16 (t,J=7.2 Hz, 6H). ESI-MS(C20H19-N5O7): 測試值[M+H]+=442.08，[M+Na]+=464.16； 計算值[M+H]+=442.13，[M+Na]+=464.12.

1.3 測量過程

將適量的探針分子1(化合物1)溶于四氫呋喃中,得到0.001 mol·L-1探針儲備液,-20 ℃貯藏.將適量NaOCl溶液用二次蒸餾水稀釋至0.010 mol·L-1,得到NaOCl標準液.所有光譜檢測均在體積比為1 ∶ 1的四氫呋喃/PBS緩沖溶液(pH=7.40)混合體系中進行的.用移液槍分別移取20 μL探針1儲備液和一定體積NaOCl標準液,加入到2 mL測試體系中,然后對其進行光譜測定.熒光激發(fā)波長為398 nm,激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm,記錄420～600 nm光譜的熒光強度變化.紫外-分光光度計記錄吸收光譜350～500 nm范圍內吸光度變化.

2 結果與討論

2.1 光譜性質

圖2為探針1(10 μmol·L-1)與不同濃度次氯酸(HOCl)結合后的熒光光譜圖.由圖2可知:由于雙淬滅基團的存在,探針分子本身熒光很弱;加入HOCl溶液之后,體系在463 nm處的熒光強度明顯增強,并且隨著HOCl濃度的逐漸增加,體系的熒光強度逐漸增強.

這表明HOCl作用下,酰肼鍵已經斷裂,淬滅因素消除,7-二乙胺基-3-羧酸熒光恢復.當加入100 μmol·L-1的HOCl時,體系熒光強度相比于探針本身增強了134倍,這表明探針1是一個具有高信噪比的HOCl熒光探針.

圖2 探針1與不同濃度HOCl反應后的熒光光譜

圖3為探針分子溶液熒光強度比F/F0與HOCl濃度之間的關系圖,其中F0和F分別表示濃度為10.0 μmol·L-1探針分子1中加入不同濃度HOCl前后的熒光強度.由圖3的結果表明:在0.1～40.0 μmol·L-1的HOCl濃度范圍內溶液的熒光強度與HOCl濃度c(HOCl)呈現(xiàn)出很好的線性相關性(R2=0.997 7),經計算得到其濃度檢測下限為0.052 μmol·L-1.

圖3 探針分子溶液熒光強度與HOCl濃度的線性關系

圖4為探針分子1(c(探針1)=10 μmol·L-1)與不同濃度HOCl作用下的紫外-可見吸收光譜.探針分子1的最大吸收波長在434 nm;加入HOCl后吸收光譜改變顯著,434 nm處吸光度降低,而407 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰,并不斷增強(藍移27 nm),等吸光點在403 nm,表明探針1與HOCl反應生成了新物質.

圖4 探針分子1與HOCl反應后溶液的紫外吸收光譜

2.2 反應機理

為揭示探針分子1對HOCl的識別機理,將探針分子1與HOCl反應的產物進行了TLC驗證.結果顯示產物的Rf值與直接合成的7-二乙胺基香豆素-3-羧基一致,表明次氯酸的加入導致探針分子中酰肼鍵的斷裂,釋放了7-二乙胺基香豆素-3-羧基,使溶液的熒光強度增強,同時,溶液從無熒光變?yōu)樗{色強熒光.探針分子1識別HOCl的可能方式見圖5.

圖5 探針分子1與HOCl的反應機理

為了進一步理解探針自身熒光淬滅機理,通過高斯09軟件,利用密度泛函理論(DFT),在B3LYP/6-31G* *水平上進行優(yōu)化,得到了探針分子1的HOMO和LUMO軌道圖,如圖6所示.由圖6可知:2,4-二硝基苯肼(供體)軌道能級在7-二乙胺基香豆素(受體)之間,表明探針分子1中熒光淬滅是由于香豆素和2, 4-二硝基苯肼之間發(fā)生了光誘導電子轉移(PET)過程造成的.

圖6 探針1的HOMO 和LUMO軌道圖

2.3 pH影響

考察了在不同pH的溶液體系下探針分子與HOCl反應前后的熒光光譜情況,如圖7所示.由圖7可知:未加入HOCl,pH=2.0～10.0時,探針分子1的熒光強度變化不明顯,表明探針本身對酸堿度的適應性較好,探針的結構不會隨pH變化而被破壞;加入100 μmol·L-1的HOCl后,pH=2.0～5.0時,溶液體系的熒光強度稍有增強;當pH=5.0～7.4時,體系熒光強度明顯增強.考慮到在活細胞中熒光成像的應用,試驗均在pH=7.4的生理條件下進行.

圖7 加入100 μmol·L-1 HOCl前后的熒光強度變化

圖8是探針分子1對HOCl的時間響應曲線.由圖8可知:探針分子1對HOCl的響應較快(約為25 min),表明探針分子1對HOCl具有較高的靈敏度.

圖8 探針1與HOCl反應后463 nm處熒光強度的變化

2.4 選擇性

圖9為濃度皆為100 μmol·L-1的各種陰離子、HOCl和H2O2溶液等干擾物分別加入10 μmol·L-1

探針分子1溶液后的熒光強度變化情況.由圖9可知:各種陰離子及H2O2均未引起探針分子1溶液熒光強度的明顯變化;而HOCl的加入使得探針分子1溶液的熒光強度增強了134倍,表明探針分子1對HOCl表現(xiàn)出了很高的選擇性,為應用于實際樣品中HOCl的檢測提供了可能.

圖9 探針分子1對不同干擾物的選擇性試驗

2.5 細胞試驗

鑒于探針分子1對HOCl具有信噪比高、檢測下限低、響應速度快、選擇性高和可在生理條件下工作等優(yōu)點,試驗中將其用于活細胞中HOCl熒光成像，如圖10所示.HeLa細胞先用濃度10 μmol·L-1的探針分子1培養(yǎng)30 min,顯微鏡下幾乎觀察不到熒光(見圖10b);在此基礎上再與濃度10 μmol·L-1HOCl在37 ℃下孵化30 min,可觀測到非常強的綠色熒光(見圖10d).圖10a,c分別為上述兩種情況中細胞在明場下觀察到的形態(tài)圖,可見細胞形態(tài)完好,表明探針分子1對細胞具有低毒性、損傷小等優(yōu)點,且探針分子1能夠用于活細胞內HOCl的可視化識別.

圖10 明場圖及熒光成像

3 結 論

1) 設計合成了一種具有步驟簡單、選擇性高、靈敏度好和響應能力快速等優(yōu)點的HOCl熒光探針分子.

2) 由于強淬滅基團二硝基苯肼和N—N自由旋轉的共同淬滅作用,導致探針分子自身熒光極弱;探針分子對HOCl識別具有特異性和高選擇性,增強倍數(shù)較高(134倍),有利于提高探針的靈敏度.

3) 生理條件下,實現(xiàn)了活細胞中HOCl的可視化識別.