高 堃 華營鵬 宋海星 官春云 張振華 周 婷,*

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甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的鑒定與生物信息學(xué)分析

高 堃1,2華營鵬1,2宋海星1,2官春云3張振華1,2周 婷1,2,*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 湖南長沙 410128;2南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南長沙 410128;3國家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南長沙 410128

PIN家族基因是一類調(diào)控植物生長素極性運輸?shù)闹匾d體元件, PIN基因編碼生長素輸出蛋白, 介導(dǎo)生長素在植物體的運輸, 然而在基因組較復(fù)雜的甘藍(lán)型油菜中缺乏系統(tǒng)研究。本研究運用生物信息學(xué)方法在甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫篩選甘藍(lán)型油菜PIN家族基因, 對鑒定出的29個基因開展拷貝數(shù)變異、分子特征、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守基序、染色體定位、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、PIN蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測等研究, 結(jié)合高通量轉(zhuǎn)錄組測序進行低氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因拷貝數(shù)明顯多于擬南芥、甘藍(lán)和白菜所具有的PIN家族基因數(shù)量; BnPINs蛋白多屬于由堿性氨基酸組成的穩(wěn)定蛋白, 含有保守的N末端結(jié)構(gòu)域, 二級結(jié)構(gòu)與擬南芥PIN蛋白相似; 系統(tǒng)進化選擇能力分析表明,基因與甘藍(lán)和白菜PIN家族基因進化關(guān)系相近。轉(zhuǎn)錄組測序表明,、、基因主要在甘藍(lán)型油菜根部表達且受長期低氮(72 h)誘導(dǎo),和基因主要在地上部表達, 低氮會抑制表達。本研究結(jié)果為進一步研究甘藍(lán)型油菜PIN家族基因生物學(xué)功能尤其是在響應(yīng)低氮脅迫中的功能奠定基礎(chǔ), 為已知大量數(shù)據(jù)的其他物種家族基因生物信息學(xué)研究提供參考。

甘藍(lán)型油菜; 生長素;; 家族基因; 生物信息學(xué)

生長素是具有極性運輸特點的植物激素, 主要在植物葉原基、幼葉、根和發(fā)育的種子中合成, 通過極性運輸?shù)桨屑?xì)胞調(diào)節(jié)作物一系列生理反應(yīng)和生長發(fā)育[1]。生長素在細(xì)胞間的運輸依賴于細(xì)胞膜上定位的AUXIN RESISTANT1/LIKE AUX1(AUX/ LAX)和PIN-FORMED(PIN)以及ATP-Binding Cassette subfamily B/P-glycoprotein (PGP/ABCB)生長素運輸載體, AUX/LAX屬于生長素內(nèi)向型運輸?shù)鞍? 在擬南芥中有AUXIN1(AUX1)、LIKE AUX1 (LAX1)、LAX2和LAX3共4個成員; 而PIN/ PGP/ABCB屬于生長素外向型運輸?shù)鞍譡2]?；蚓幋a的蛋白是最重要的生長素外輸載體, 幾乎存在于所有單子葉和雙子葉植物中[3]。植物基因最早在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[4], AtPIN1蛋白在細(xì)胞膜上呈極性分布, 負(fù)責(zé)將生長素從胞內(nèi)運輸?shù)桨鈁5]。隨后發(fā)現(xiàn)擬南芥PIN家族蛋白共有8個成員, 命名為PIN1~PIN8[6]。PIN1蛋白在植物發(fā)育中具有重要作用, 主要參與胚的發(fā)育、葉序和葉脈的形成及維管組織分化, 負(fù)責(zé)生長素在莖尖分生組織環(huán)流及從地上部到根的運輸[7]; PIN2蛋白主要參與根的向重力生長,突變體表型為向重力生長缺陷[8];基因主要參與植物的向性生長, 組織化學(xué)染色表明其主要在維管組織和黃化苗頂端彎鉤表達[9]; PIN4蛋白極性定位在內(nèi)皮層、皮層和維管組織細(xì)胞膜上, 參與生長素向根尖靜止中心運輸[10]; PIN5蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 主要負(fù)責(zé)生長素從胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的運輸[11]; Benková等[12]研究發(fā)現(xiàn),基因在整個側(cè)根發(fā)育過程中均有表達;基因在胚發(fā)育早期就有表達, 根尖柱狀細(xì)胞定位的PIN7蛋白主要參與根的向重力生長[13];基因在花藥中特異表達, 調(diào)控花粉發(fā)育, PIN8蛋白與PIN5蛋白都定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 二者在調(diào)控配子體、孢子體發(fā)育和植物體內(nèi)生長素平衡等方面具有拮抗作用[14]; PIN1、PIN2和PIN7蛋白在異源表達系統(tǒng)被證明有向胞外運輸生長素的活性, 且該過程不需要其他因子參與[15]。生長素在植物根部有2種運輸方式, 一是通過中柱向根尖的向頂運輸, 二是根尖生長素經(jīng)表皮和皮層細(xì)胞回運的向基運輸[16], PIN1和PIN4蛋白共同調(diào)控向頂運輸, PIN2和PIN3蛋白參與向基運輸[17]。除PIN家族蛋白外, 藥物抗性糖蛋白(multidrug-resistance- p-glycoproteins, MDR/PGPs)家族成員MDR1、PGP1、PGP2、PGP4和PGP19也有向胞外輸出生長素的功能[18]。

迄今為止, 在玉米、水稻、大豆、小麥等作物上克隆了許多同源基因, 但在甘藍(lán)型油菜中尚未報道。油菜是世界上重要的油料作物, 提供人類所需的主要植物油, 其在保證食用油供給、改善食物結(jié)構(gòu)、促進養(yǎng)殖業(yè)和輕紡工業(yè)發(fā)展等方面具有重要作用[19]。甘藍(lán)型油菜(, AnAnCnCn, ~ 1345 Mb, 2=4x=38)屬于十字花科蕓薹屬油料作物[20], 是白菜(, ArAr, ~485 Mb, 2=2x=20)和甘藍(lán)(, CoCo, ~630 Mb, 2=2x=18)2個二倍體基本種在7500年前通過天然遠(yuǎn)緣雜交形成的異源四倍體作物, 全基因組包含約十萬多個蛋白編碼基因[21], 進化、遺傳的復(fù)雜性在一定程度上影響了各種功能基因在甘藍(lán)型油菜生長發(fā)育中的作用。氮是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素, 被譽為“生命元素”, 同時, 油菜對氮缺乏極其敏感[22]。已有研究表明, 生長素的極性運輸在植物的氮脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23-24]。目前并不清楚PIN家族基因是如何響應(yīng)氮素缺乏的?；谏鲜鲅芯勘尘? 本研究也開展了甘藍(lán)型油菜PIN家族基因?qū)Σ煌毓?yīng)水平的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)研究。

本研究以擬南芥PIN家族基因為參考序列, 在甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫中進行了BnPINs家族基因的鑒定, 借助生物信息學(xué)方法研究了甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的序列信息、分子特征、保守基序特征、染色體定位、系統(tǒng)進化關(guān)系、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及低氮脅迫下的表達, 旨在了解甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的遺傳信息和編碼的BnPINs蛋白結(jié)構(gòu), 為進一步揭示該家族基因的生物學(xué)功能奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究水培試驗所用甘藍(lán)型油菜品種為“湘油15”。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的鑒定 本研究中擬南芥PIN家族蛋白信息參考Paponov[3]分析結(jié)果。首先利用AtPINs為原始序列, 使用在線工具Pfam[25](http://pfam.xfam.org/)和SMART[26](http:// smart.emblheidelberg.de/)分析AtPINs序列, 分析結(jié)果顯示AtPINs具有跨膜結(jié)構(gòu)域。其次下載甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)(http://brassicadb.org/brad/), 并利用Bio Edit軟件構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫, 用含有跨膜結(jié)構(gòu)域的AtPINs序列進行本地數(shù)據(jù)庫BLAST檢索, 設(shè)定檢索參數(shù)E值

1.2.2 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因生物信息學(xué)分析

使用ExPASy (http://www.expasy.org/tools)[27]中Prot-Param和Prot Scale工具分析BnPINs蛋白的氨基酸組分和理化性質(zhì), 應(yīng)用TMHMM (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[28]預(yù)測BnPINs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 保守結(jié)構(gòu)域和保守殘基的鑒定 使用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)[26]鑒定保守結(jié)構(gòu)域, 并使用Pfam (http://pfam.xfam.org/)注釋[25]。使用Vector NTI對保守殘基進行多重比對分析。

1.2.4 甘藍(lán)型油菜PIN蛋白保守基序分布信息獲取

運用MEME Version 4.9.1 (http://meme.nbcr.net/ meme/cgi-bin/meme.cgi)[29]在線工具分析BnPINs蛋白的保守基序信息, 設(shè)置最大基序檢索值為10。

1.2.5 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

運用Clustal X version 2.1[30]對擬南芥、甘藍(lán)、白菜PIN家族蛋白的氨基酸序列和本研究鑒定的BnPINs蛋白氨基酸序列進行多重比對, 使用MEGA6.0[31]分析比對結(jié)果并采用鄰接法(neighbor- joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 設(shè)定泊松校正法計算進化距離和重復(fù)1000次的自展法(bootstrap)檢驗。

1.2.6 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因染色體定位分析

利用Pfam[25](http://pfam.xfam.org/)對本研究篩選到的基因進行結(jié)構(gòu)域判定, 去除冗余基因,確定位置信息, 利用Circos 0.6[32]構(gòu)建PIN家族基因染色體分布圖譜。

1.2.7 甘藍(lán)型油菜PIN蛋白二級結(jié)構(gòu)分析及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用2種不同的工具進行二級結(jié)構(gòu)分析: GOR4 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/page=npsagor4. html/)[33]和PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/ PSIPRED/)[34-35]。使用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html)[36]預(yù)測BnPINs蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.8 低氮脅迫下甘藍(lán)型油菜PIN家族基因時空表達和共表達網(wǎng)絡(luò)分析

1.2.8.1 營養(yǎng)液培養(yǎng)試驗 培養(yǎng)試驗在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營養(yǎng)與養(yǎng)分高效利用課題組光照培養(yǎng)室進行, 溫度設(shè)置為22oC, 光照周期為14 h (光照)/10 h (黑暗), 光照強度為300~320 μmol m–2s–1, 濕度為60%~75%。選取大小一致的油菜種子, 用1%的NaClO滅菌10 min, 將種子表面沖洗干凈后, 4oC下用滅菌超純水(>18.25 MΩ)浸泡24 h, 然后將種子播種到塑料育苗盤固定的紗布上, 育苗盤中加適量超純水。1周后將長勢一致的幼苗移栽至盛有10 L營養(yǎng)液的黑色塑料盆中, 營養(yǎng)液采用Hoagland配方[37]。試驗設(shè)置2個氮水平: 正常氮(9 mmol L–1NO3–)和低氮(0.3 mmol L–1NO3–)。

1.2.8.2 高通量轉(zhuǎn)錄組測序 油菜幼苗先在正常氮水平培養(yǎng)10 d, 然后將其移至低氮處理, 地上部(S)和根(R)在0、3和72 h取樣, 每個處理準(zhǔn)備3個獨立的生物學(xué)重復(fù)。測序平臺為Illumina Hiseq 2000[38], 每個樣品產(chǎn)生6.0-Gb測序數(shù)據(jù), 測序方式為雙末端(PE)測序, 讀長為150 bp。使用Multiple Experiment Viewer (http://www.tm4.org/mev.html)[39]繪制基因表達譜的熱圖, 使用錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05和倍數(shù)變化(log2)≥1作為鑒定差異表達基因的閾值。

1.2.8.3 基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)鑒定BnPINs家族基因相互作用的強弱并定位低氮脅迫下連接最相鄰的核心基因, 相關(guān)值閾值設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)(http://plantgrn.noble.org/DeGNServer/ Analysis.jsp), 然后用Cytoscapev.3.2.1 (http://www. cytoscape.org/)[40]進行基因共表達網(wǎng)絡(luò)圖譜的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 十字花科作物PIN家族基因拷貝數(shù)變異

以AtPINs的氨基酸序列為查詢對象, 對NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST搜索, 在異源四倍體甘藍(lán)型油菜中鑒定了29個, 明顯多于擬南芥、甘藍(lán)和白菜具有的PIN家族基因數(shù)量。然而甘藍(lán)型油菜中基因數(shù)量遠(yuǎn)少于甘藍(lán)和白菜中的總數(shù), 表明在異源多倍體過程中遭受嚴(yán)重的基因損失。29個BnPINs家族基因包括2個、6個、4個、4個、4個、2個、5個和2個(圖1)。

圖1 甘藍(lán)型油菜、擬南芥、甘藍(lán)、白菜PIN家族基因拷貝數(shù)變異

柱狀圖頂部數(shù)值為該物種拷貝的基因數(shù)目。

The number at the top of the histogram is the number of genes copied for that species.

2.2 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因分子特征

利用AtPINs數(shù)據(jù)在甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫中共檢索到29條基因序列, 鑒定結(jié)果和序列分析表明, 29個基因編碼的蛋白質(zhì)平均含有527個氨基酸。氨基酸數(shù)目最多的是BnPIN2e蛋白, 長度為643個氨基酸, 預(yù)測分子量是69.44 kDa, 理論等電點(pI)為9.24; 氨基酸數(shù)目最少的是BnPIN5a蛋白, 長度為348個氨基酸, 預(yù)測分子量是38.25 kDa, 理論等電點(pI)為5.96; 29條編碼的蛋白質(zhì)等電點變化范圍為5.96 (BnPIN5a)~9.38 (BnPIN2f), 大部分編碼氨基酸為堿性氨基酸, 僅有BnPIN4d、BnPIN5a、BnPIN5b、BnPIN5c和BnPIN5d蛋白主要由酸性氨基酸組成; BnPIN2e蛋白的外顯子/內(nèi)含子數(shù)量最多, 含有13個外顯子/12個內(nèi)含子; 根據(jù)親水性指數(shù)介于-0.5~ +0.5為兩性蛋白(GRAVY為負(fù)值表示親水性, 正值表示疏水性)的原則[41], 發(fā)現(xiàn)僅有BnPIN5a、BnPIN5b、BnPIN5c、BnPIN5d和BnPIN8a、BnPIN8b是疏水性蛋白, 其余均為兩性蛋白(表1)。

2.3 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域和氨基酸系列比對分析

使用SMART分析BnPINs蛋白保守結(jié)構(gòu)域, 由圖2可以看出, 即使BnPIN蛋白保守結(jié)構(gòu)域在同一個類別, 其位置也有差異。29個BnPINs蛋白都具有跨膜結(jié)構(gòu)域, 都在第7~641位的氨基酸殘基片段上, BnPIN1a蛋白具有最少的跨膜結(jié)構(gòu)域(5個); BnPIN5dBnPIN7bBnPIN7cBnPIN8b蛋白具有最多的跨膜結(jié)構(gòu)域(均含10個); 絕大部分BnPINs蛋白還有1~2個位于第132~453位氨基酸殘基片段的低容量跨膜結(jié)構(gòu)域(除了BnPIN7a蛋白位于第76~88位殘基片段上外), 但BnPIN2d、BnPIN3b、BnPIN5a、BnPIN5b、BnPIN5c、BnPIN7c、BnPIN8b蛋白均不含有。通過PIN家族蛋白氨基酸系列比對, 鑒定出BnPINs蛋白高度保守的氨基酸殘基, Phe-49、Pro-52、Pro-64、Val-159、Gln-161、Trp-165、Leu-170、Phe-171、Glu-174、Lys-538、Asn-542、Pro-543、Asn-544、Tyr-546、Gly-551、Trp-554、Phe-567、Ser-573、Ser-578、Gly-581、Gly-583、Met-586、Phe-587、Phe-643, 這24個氨基酸殘基在所有BnPINs蛋白系列中均高度保守(圖3)。這些結(jié)果表明, BnPINs蛋白具有參與生長素外向型運輸?shù)目缒そY(jié)構(gòu)域。

2.4 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因染色體的位置

染色體定位發(fā)現(xiàn),基因并不是均勻分布在甘藍(lán)型油菜基因組中, 29個分布于A/C亞基因組, 13個基因分別位于A亞基因組的A2、A3、A7、A8、A10染色體, 10個基因分別位于C亞基因組的C2、C3、C6、C7、C8、C9染色體。、、、位于A2染色體,、位于A3染色體,、、、位于A7染色體,位于A8染色體,、位于A10染色體, 而、位于C2染色體,、位于C3染色體,、、位于C6染色體,位于C7染色體,位于C8染色體,位于C9染色體, 其余6個基因由于基因組拼接及注釋不完整具體物理位置尚未確定(圖4)。

2.5 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守基序分布

保守基序分析發(fā)現(xiàn), BnPINs蛋白N末端具有保守1 (motif 1)基序。甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守基序數(shù)量變化具有一定規(guī)律, 數(shù)量為1~10, 除了BnaC02g20430D、BnaCnng76990D外, 其他序列都含有10個保守基序。BnaCnng54140D、BnaA10g 17940D、BnaC03907830D、BnaA03g06090D、Bna Cnng51580D和BnaA02g02480D缺失8 (Motif 8)基序(圖5)。

2.6 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因系統(tǒng)進化分析

利用鄰接法構(gòu)建甘藍(lán)型油菜、擬南芥、甘藍(lán)和白菜PIN家族基因系統(tǒng)進化樹。由圖6可知: (1)整個進化樹可分為兩大組, 第一組是~和基因, 第二組為、和基因, 該結(jié)果與Cazzonelli等[42]將擬南芥PIN蛋白分為PIN1組(AtPIN1~AtPIN4和AtPIN7)和PIN5組(AtPIN5、AtPIN6和AtPIN8)結(jié)果一致。(2) BnPINs家族基因與甘藍(lán)和白菜基因進化關(guān)系較近,和、和、和、和均位于同一個進化分支,和進化關(guān)系也相近。、和分別與、和基因進化關(guān)系密切。

藍(lán)色代表跨膜結(jié)構(gòu)域, 粉色代表低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)。

Transmembrane regions are in blue and low complexities are in pink.

2.7 甘藍(lán)型油菜PIN蛋白二級結(jié)構(gòu)分析和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用GOR4和SPIPRED進行BnPINs蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析, GOR4和SPIPRED預(yù)測結(jié)構(gòu)類似(圖7)。運用Phyre2數(shù)據(jù)庫、分析的保守氨基酸殘基和PIN蛋白二級結(jié)構(gòu)對BnPINs蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖8)。由BnPIN5b蛋白二級結(jié)構(gòu)和BnPIN2a蛋白三級預(yù)測結(jié)構(gòu)可知, α螺旋是BnPINs蛋白的主要結(jié)構(gòu), BnPIN5b蛋白二級結(jié)構(gòu)特征為, α螺旋>延伸鏈>無規(guī)則卷曲>β轉(zhuǎn)角, 這些結(jié)果與PIN蛋白向胞外運輸生長素的功能緊密聯(lián)系。

圖3 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白氨基酸序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析

黃色區(qū)域為高度保守的氨基酸位點。

The yellow area is a highly conserved amino acid site.

圖4 23個甘藍(lán)型油菜PIN基因染色體分布

圖5 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守基序分布

左側(cè)為蛋白系列名稱, 右側(cè)不同顏色分別對應(yīng)不同的保守基序在系列上的位置。

The different colors on the right correspond to the positions of different conserved motifs on the series, respectively.

2.8 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因在低氮脅迫下時空表達和基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

由圖9可以看出,、、基因主要在甘藍(lán)型油菜根部表達且受長期低氮(72 h)誘導(dǎo);和基因主要在地上部表達, 低氮會抑制表達。為了進一步確定29個中哪一個是核心基因, 又構(gòu)建了基因共表達網(wǎng)絡(luò),被鑒定為核心基因, 在低氮脅迫下, 29個基因在地上部的表達有一定規(guī)律(圖10-A); 基因表達量幾乎都隨著低氮脅迫時間延長而先下降后上升, 且在3 h出現(xiàn)最低值, 但在根部未出現(xiàn)這一規(guī)律(圖10-B)。

3 討論

生長素的極性運輸與植物生長發(fā)育密切相關(guān), 如植物的向光性、向地性、頂端優(yōu)勢、根形成、花發(fā)育、胚胎形態(tài)建成、維管組織形成等[43]。隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展, 在生長素結(jié)合蛋白、外輸載體和相關(guān)基因克隆等領(lǐng)域已取得一系列進展。鑒定了多種擬南芥生長素運輸載體, 對其功能和運輸機制進行了研究, 而在其他作物中的此類研究十分有限。本研究發(fā)現(xiàn)BnPINs家族基因與甘藍(lán)和白菜基因進化關(guān)系相近, 但在遺傳和進化過程中基因遭受嚴(yán)重?fù)p失,基因拷貝數(shù)丟失。BnPINs蛋白多為堿性氨基酸組成的穩(wěn)定蛋白, 定位在細(xì)胞質(zhì)膜上, 具有保守的N末端結(jié)構(gòu)域和5~6次跨膜折疊, 二級結(jié)構(gòu)與AtPIN蛋白相似, 這些結(jié)構(gòu)與BnPINs蛋白向胞外運輸生長素的功能緊密相關(guān)。因此, 鑒定并獲得不同物種PIN家族基因的遺傳和進化信息, 了解其編碼的PIN蛋白結(jié)構(gòu), 對于進一步研究PIN家族基因生物學(xué)功能和探索生長素外向型運輸載體(PIN蛋白)定位機制、影響定位的因素和運輸載體之間的相互作用具有重要意義。

圖6 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因系統(tǒng)進化分析

不同顏色代表不同的進化分支, I、II代表家族2個亞組。

Different clades are in different colors, I and II above clades indicate the two subgroups offamily.

圖7 甘藍(lán)型油菜BnPIN5b蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

GOR4和PSIPRED分別是進行二級結(jié)構(gòu)分析的2種不同的工具。

GOR4 and PSIPRED are two tools for the secondary structure analysis.

圖8 甘藍(lán)型油菜BnPIN2a蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

三級結(jié)構(gòu)預(yù)測該晶體為轉(zhuǎn)運子。

The three-dimensional structure predicts that the crystal is a transporter.

近年來, PIN蛋白通過調(diào)控生長素調(diào)控植物逆境脅迫的研究層出不窮, 且在植物響應(yīng)營養(yǎng)元素缺乏或毒害中也有報道。缺硼時, 擬南芥通過調(diào)控基因的表達調(diào)控生長素在根系的分布從而影響根系生長[44]; 磷鎂互作時可能通過介導(dǎo)、和基因在根中的表達調(diào)控根系構(gòu)型[45]; 超表達水稻基因緩解了水稻根系鋁毒[46], 延遲了體內(nèi)磷素由營養(yǎng)器官向生殖器官的轉(zhuǎn)移[47]。

油菜對氮素養(yǎng)分具有較高的營養(yǎng)需求, 但其氮素利用率很低, 缺氮會嚴(yán)重抑制油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的提高[22]。已有研究表明, 缺氮會增加擬南芥主莖中生長素的極性運輸水平, 從而增強頂端優(yōu)勢, 造成地上部分枝數(shù)減少[23]。氮素缺乏可能通過改變生長素極性運輸基因的表達, 從而影響植株的生長表型, 最終影響產(chǎn)量。由此可見,基因與氮素營養(yǎng)的互作在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),基因的表達具有較強組織特異性,、、基因主要在油菜根部表達且受長期低氮(72 h)誘導(dǎo),和基因主要在地上部表達, 低氮會抑制表達, 反映了PIN家族基因時空表達的特性[48]。上述研究結(jié)果為進一步揭示甘藍(lán)型油菜PIN家族基因在低氮脅迫下調(diào)控生長素的極性運輸作用奠定了研究基礎(chǔ), 為發(fā)展氮高效油菜新品種選育提供了新方向。

圖9 低氮脅迫下甘藍(lán)型油菜PIN家族基因轉(zhuǎn)錄組分析

S: 地上部; R: 根; 0、3、72 (h)代表缺氮脅迫的時間。圖中結(jié)果表示3次生物學(xué)重復(fù)的平均值。

S: shoot; R: root; 0, 3, and 72 (h) represent the time course of nitrogen deficiency. The results represent the average of three biological replicates.

圖10 低氮脅迫下甘藍(lán)型油菜PIN家族基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析和表達量分析

A: 共表達網(wǎng)絡(luò)分析; B: 基因表達量分析; 圓圈節(jié)點代表基因, 節(jié)點的大小代表節(jié)點之間相互作用的能力, 兩個節(jié)點之間的連線代表基因之間的相互作用; S: 地上部; R: 根; 0、3、72 (h)代表缺氮脅迫的時間。圖中結(jié)果表示3次生物學(xué)重復(fù)的平均值。

A: co-expression network analysis; B: expression of PIN family genes; cycle nodes represent genes, and the size of the nodes represents the power of the interrelation among the nodes by degree value, edges between two nodes represent interactions between genes; S: shoot; R: root; 0, 3, and 72 (h) represents the time course of nitrogen deficiency. The results represent the average of three biological replicates.

4 結(jié)論

十字花科作物PIN家族基因拷貝數(shù)存在差異, 甘藍(lán)型油菜比與它進化關(guān)系相近的甘藍(lán)和白菜具有更多同源基因,基因分別位于A/C亞基因組的A2、A3、A7、A8、A10、C2、C3、C6、C7、C8、C9染色體。BnPINs蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上, 主要是α螺旋結(jié)構(gòu), 多為兩性蛋白, 具有高度保守的氨基酸殘基位點、N端保守基序和多個跨膜結(jié)構(gòu)域, 表明BnPINs蛋白可作為細(xì)胞質(zhì)膜上的運輸載體參與生長素向胞外運輸?；虮磉_具有組織特異性, 低氮脅迫顯著改變了一些基因的表達豐度, 進而可能影響生長素在作物體內(nèi)的分配, 最終影響作物生長發(fā)育。

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Identification and Bioinformatics Analysis of thePIN Family Gene in

GAO Kun1,2, HUA Ying-Peng1,2, SONG Hai-Xing1,2, GUAN Chun-Yun3, ZHANG Zhen-Hua1,2, and ZHOU Ting1,2,*

1College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China;2Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, Hunan, China;3Hunan Branch, National Oil Crops Improvement Center, Changsha 410128, Hunan, China

The PIN family is a type of important carrier elements that regulate the polar transportation of auxin. Thegenes encode auxin efflux carriers with multiple transmembrane domains that mediate auxin transport in plants. However, there is a lack of systematic research in the genome of complexity. In this study, thegenes were screened from theDatabase using bioinformatics, and study on molecular characteristics of BnPIN proteins, such as copy number variations, transmembrane domains, conserved motifs, chromosomal locations, phylogenetic relationships, secondary and three-dimensional structures, and high-throughput transcriptome sequencing was used to analyze the transcriptional level under low nitrate stress. The results showed that most of the BnPIN proteins which is belonged to the stable protein consisting of basic amino acids. TheBnPIN family proteins contained secondary structures similar to those of Arabidopsis PINs accompanied by conserved N-terminal domains. The phylogenetic analysis showed thatgenes were similar to the corresponding homologs ofand. High-throughput transcriptome analysis showed that the,, andgenes were mainly expressed in roots ofunder long-term (72 h) low nitrate (NO3–) stress. Theandgenes were mainly expressed in the shoot and limited NO3–repressed theexpression. This study is valuable for the research that the roles of thefamily in the regulation of auxin transport. Our results also provide reference for the integrated genomic and transcriptomic studies of gene family in plant species with complex genomes.

; auxin;; gene family; bioinformatics

2018-01-30;

2018-06-12;

2018-06-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.01334

周婷, E-mail: zhoutingplant@foxmail.com

E-mail: gaokun0874@foxmail.com

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0200103), 國家自然科學(xué)基金項目(31101596, 31372130), 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)新進教師科研啟動基金項目(30555|550100100021), 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年基金項目(17QN40)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資助。

This study was supported by the National Key R&D Program of China (2017YFD0200103), the National Natural Science Foundation of China (31101596, 31372130), the Research Starting Foundation for New Teachers of Hunan Agricultural University (30555|550100100021), the Youth Foundation of Hunan Agricultural University (17QN40), and the China Agriculture Research System.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180628.1740.004.html