龍海馨 邱海陽 Muhammad UZAIR 房靜靜 趙金鳳 李學(xué)勇

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水稻窄葉突變體的表型分析與基因定位

龍海馨 邱海陽 Muhammad UZAIR 房靜靜 趙金鳳 李學(xué)勇*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程, 北京 100081

葉片作為植物光合作用的主要器官, 其面積的大小影響著光能利用率和最終產(chǎn)量。為了研究水稻葉片形態(tài)建成的分子機(jī)制, 利用60Co-γ射線誘變粳稻品種春江06, 在M2代中得到1份窄葉突變體, 命名為()。該突變體葉片變窄、株高降低、分蘗增多、莖節(jié)間縮短、抽穗期提前。本研究重點(diǎn)調(diào)查了3片功能葉的形態(tài), 發(fā)現(xiàn)突變體葉片寬度減少了50%, 葉片長度變化較小。細(xì)胞學(xué)觀察表明, 葉片變窄主要是由于表皮細(xì)胞數(shù)目的減少, 而細(xì)胞大小變化不大。遺傳分析表明, 該突變體表型受1對隱性基因控制。利用具有多態(tài)性的InDel分子標(biāo)記及與Dular配制的F2定位群體, 將該基因定位于第7染色體著絲粒區(qū)1.9 Mb范圍內(nèi)。二代測序結(jié)果表明, 在該范圍內(nèi)有455 kb的大片段缺失。本研究結(jié)果為窄葉基因的克隆和功能分析奠定了良好基礎(chǔ), 也為水稻株型改良提供了基因資源和育種材料。

水稻; 葉片; 窄葉突變體; 抽穗期; 基因定位

水稻(L.)作為全世界最重要的糧食作物之一, 其產(chǎn)量關(guān)系著糧食生產(chǎn)安全。隨著人口數(shù)量的增加和耕地面積的減少, 進(jìn)一步提高水稻單位面積的產(chǎn)量是育種家們長期以來的育種目標(biāo)。在水稻中超過90%的物質(zhì)積累來源于葉片光合作用, 只有少部分來自于根部吸收[1], 故葉片形態(tài)是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一。葉片形態(tài)的改變會(huì)直接影響光合作用、呼吸作用、蒸騰作用和最終生物學(xué)產(chǎn)量。因此研究調(diào)控水稻葉片形態(tài)的分子機(jī)制對提高糧食產(chǎn)量有很重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

葉片是植物生長中的重要器官, 其發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過程, 主要通過一系列的極性發(fā)育和細(xì)胞分化來完成[2-3]。葉片起始發(fā)育于頂端分生組織(shoot apical meristem, SAM)附近的細(xì)胞, 在一定濃度的生長素誘導(dǎo)下通過細(xì)胞分裂沿著近端和遠(yuǎn)端迅速地延伸生長。起始細(xì)胞在遠(yuǎn)端橫向生長, 在近端葉柄處持續(xù)細(xì)胞分裂。早期葉片發(fā)育主要是指從葉片遠(yuǎn)端到葉片基部的發(fā)育, 主要以細(xì)胞分裂方式為主[3-4], 在此階段產(chǎn)生了很多大小、形狀一致的細(xì)胞, 細(xì)胞數(shù)目大量增加。在隨后的葉片發(fā)育進(jìn)程中細(xì)胞分裂逐漸減弱直至停止, 新細(xì)胞的生長主要以細(xì)胞增大為主, 直至形成成熟的葉片[5], 故葉片的最終形態(tài)是由細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目共同決定的。

近年來, 隨著分子克隆技術(shù)的快速發(fā)展, 愈來愈多的水稻窄葉突變體被深入研究, 通過對突變基因的圖位克隆和功能研究, 逐步揭示了水稻葉片發(fā)育的分子機(jī)制。通常認(rèn)為, 水稻的窄葉性狀受質(zhì)量性狀等位基因控制。根據(jù)Gramene網(wǎng)站和水稻數(shù)據(jù)庫報(bào)道, 目前已報(bào)道11個(gè)窄葉突變體, 分別為、、、和以單基因控制為主, 主要分布在第1、第3、第4、第11和第12染色體上[6], 且以第3、第4染色體居多, 其中、已被克隆并進(jìn)行了部分功能分析。比如基因位于水稻第4染色體上, 編碼一個(gè)與生長素極性運(yùn)輸有關(guān)的植物特異性蛋白, 但該蛋白的生化功能仍未知。突變體主要表現(xiàn)為葉片寬度變窄, 而葉片長度的變化比較小[7]。基因功能缺失導(dǎo)致突變表型的出現(xiàn)[8]。基因位于水稻第3染色體短臂上, 編碼一個(gè)與生長素生物合成有關(guān)的YUCCA家族蛋白。突變體的葉片主要表現(xiàn)為寬度變窄、卷曲, 但是在葉片長度上沒有明顯的改變[9-10]。與生長素缺乏突變體類似, 生長素響應(yīng)因子ARF11 (auxin-response factor 11)的功能缺失突變體的葉片也適度變窄, 劍葉角度減小, 株高輕度降低[11]?；蛭挥谒镜?2染色體上, 編碼一個(gè)類纖維素合成酶蛋白D4 (OsCSLD4)。突變體主要表現(xiàn)為葉片寬度變窄和長度變短[12-14]。和是2個(gè)WUSCHEL-related homeobox (WOX)同源基因, 分別位于水稻第11和第12染色體上, 與玉米和擬南芥基因同源。特別是, 只在雙突變體中才會(huì)出現(xiàn)突變性狀, 單一突變體性狀正常。突變體主要表現(xiàn)為葉片變窄、分蘗數(shù)目增多、側(cè)根數(shù)目減少等。進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)突變體的窄葉性狀主要是由于頂端分生組織異常, 導(dǎo)致葉片生成細(xì)胞缺陷[15-17]。()基因位于水稻第11染色體短臂上, 編碼核糖體大亞基L3B (RPL3B)。突變體表現(xiàn)為延遲生長、維管束缺陷和葉片變窄。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明, RPL3B蛋白的突變導(dǎo)致核糖體60S亞基和多核糖體減少, 證明RPL3B蛋白在調(diào)控水稻正常葉片形態(tài)和植物結(jié)構(gòu)方面起重要作用[18]。

隨著越來越多新技術(shù)的應(yīng)用, 耗時(shí)的傳統(tǒng)葉片性狀測量方式已被高通量葉片評分技術(shù)(high- throughput leaf scoring, HLS)代替。該技術(shù)可對水稻葉片數(shù)目、面積、顏色、形態(tài)等性狀進(jìn)行評估, 比傳統(tǒng)測量方式更省時(shí)、精準(zhǔn), 并可與全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)相結(jié)合, 成為一種新型尋找控制水稻葉片性狀遺傳位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法[19]。

水稻不僅是世界上最重要的糧食作物之一, 還是單子葉植物的模式植物。盡管葉片形態(tài)對植物光合效率起著關(guān)鍵作用, 但是目前對其遺傳機(jī)制的研究并不深入, 特別是單子葉植物。本研究利用60Co-γ射線誘變粳稻品種春江06, 獲得了一個(gè)窄葉突變體, 命名為, 對其進(jìn)行了表型分析、細(xì)胞學(xué)觀察、遺傳分析和基因定位, 為進(jìn)一步了解調(diào)控葉片寬度的分子機(jī)制提供了良好的遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種春江06經(jīng)60Co-γ射線誘變處理后, M1代按單株收種, M2代按株系種植, 每個(gè)株系插秧12株。從其中1個(gè)株系中篩選獲得了窄葉突變體, 經(jīng)多代自交, 其窄葉性狀能夠穩(wěn)定遺傳。遺傳分析和基因定位所用的父本材料為表型正常的廣親和秈稻品種Dular。

1.2 突變體的表型鑒定

在水稻抽穗期分別統(tǒng)計(jì)突變體()和野生型(春江06)各20株的株高、分蘗數(shù)、葉片形態(tài)(主莖倒一葉、倒二葉和倒三葉)、抽穗期、主莖穗型、主莖穗粒型等形態(tài)指標(biāo)。其中主要重點(diǎn)觀察和測定倒一葉(劍葉)、倒二葉、倒三葉的長度和最寬處的寬度。劍葉面積可通過公式進(jìn)行計(jì)算: 劍葉面積(cm2): FLA = FLL×FLW×0.75 (FLA: flag leaf area; FLL: flag leaf length; FLW: flag leaf width)[28]。

1.3 葉片下表皮觀察

在水稻抽穗期時(shí), 挑選長勢正常的野生型和突變體各10株, 分別取植株主莖的倒一葉(劍葉)、倒二葉和倒三葉, 共30片葉子, 截取每片葉子最寬處5 cm。根據(jù)Yoshikawa等[20]的方法, 將葉片標(biāo)記好, 置FAA固定液(95 mL 70%酒精 + 5 mL 37%乙醛 + 5 mL冰醋酸), 固定24 h以上。用于以下2個(gè)葉片試驗(yàn)。

1.3.1 大小葉脈分析 取出固定好的3個(gè)部位的葉片, 分別截取1 cm, 以清水簡單沖洗后, 用吉列刀片切取適宜寬度(可將葉片夾在切好的土豆條中, 用腕力切取), 置載玻片上, 在體視鏡(Olympus SZX16)下觀察, 統(tǒng)計(jì)葉片大小葉脈數(shù)目, 照相并記錄。

1.3.2 表皮細(xì)胞大小 將固定的葉片依次按照50%、70%、90%、100%乙醇逐級脫水(其中100%乙醇洗脫兩次效果更佳), 每次脫水1 h; 將脫水后的材料轉(zhuǎn)入3 mol L–1水合氯醛, 96°C加熱1~2 h, 轉(zhuǎn)入蒸餾水, 浸泡一會(huì)兒, 用刀片輕輕刮除葉片上部, 直至剩余單層的下表皮。制作臨時(shí)裝片, 用光學(xué)顯微鏡觀察(Olympus BX53), 統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目, 測量細(xì)胞寬度并照相。由于單個(gè)細(xì)胞的寬度較小, 難以準(zhǔn)確測量, 故實(shí)際操作中可以一次橫向選取多個(gè)細(xì)胞, 測量其總寬度, 再根據(jù)選取細(xì)胞的數(shù)目, 計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的平均寬度[21]。

1.4 F2定位群體的構(gòu)建與遺傳分析

將窄葉突變體與秈稻品種Dular雜交, F1代單株自交獲得F2代種子。F2群體按單株插秧, 在抽穗期統(tǒng)計(jì)正常和突變個(gè)體的株數(shù), 用于遺傳學(xué)分析, 并收取突變表型單株作為基因定位群體。

1.5 群體DNA提取及檢測

從F2突變表型單株和2個(gè)親本(父本Dular; 母本)每株取約0.1 g葉片, 采用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法[4]提取水稻基因組DNA, 用于基因定位。參照分離群體分組分析法(bulked segregant analysis, BSA)[22], 分別構(gòu)建親本和突變個(gè)體混池。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 調(diào)節(jié)兩個(gè)親本DNA濃度使其一致, 等量混合構(gòu)成親本混池; 選取亮度一致的10株F2代突變體DNA, 等量混合構(gòu)成突變個(gè)體混池, 用于后續(xù)連鎖標(biāo)記的篩選。

1.6 基因初步定位

根據(jù)秈稻、粳稻之間序列的差異, 設(shè)計(jì)均勻分布在水稻12條染色體上的170對InDel (insertion and deletion)標(biāo)記, 對突變個(gè)體和親本混池進(jìn)行BSA分析, 初步篩選出與窄葉突變體表型可能連鎖的標(biāo)記, 并用20株F2代突變個(gè)體對可能的連鎖標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。其中使用的PCR體系為10 μL, 包含2× Mix buffer 5 μL、兩端引物(10 μmol L–1)各0.5 μL、模板DNA 1 μL和ddH2O 3 μL。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min, 94°C變性30 s, 56°C退火30 s, 72°C延伸30 s, 共35個(gè)循環(huán), 72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及0.1% AgNO3銀染后, 統(tǒng)計(jì)每個(gè)F2突變個(gè)體的基因型。

1.7 基因精細(xì)定位

根據(jù)初步定位結(jié)果, 利用本實(shí)驗(yàn)室已測序的秈稻品種Dular全基因組序列(未發(fā)表)與NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供的粳稻品種日本晴基因組序列的比對結(jié)果, 在與目的基因連鎖的區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)新的InDel標(biāo)記(表2)。擴(kuò)大F2代定位群體, 從而縮小定位區(qū)間, 鎖定目的基因。

1.8 候選基因分析

通過水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Annotation Project)網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu. edu/), 進(jìn)行基因預(yù)測, 查閱位于基因精細(xì)定位的區(qū)間內(nèi)所有開放閱讀框, 初步了解每個(gè)基因功能, 并分析可能的候選基因。

1.9 突變材料的二代測序

選取突變體抽穗期的葉片(2~3片), 采用CTAB法提取DNA, 由北京諾禾致源生物信息科技有限公司對突變體全基因組進(jìn)行二代測序。根據(jù)反饋的測序結(jié)果和初步定位的區(qū)間深入分析, 尋找突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 窄葉突變體nal20的葉片表型分析

在抽穗期, 突變體主要突變性狀表現(xiàn)在葉片形態(tài)上(葉寬變窄和葉長縮短), 并且不同位置的突變程度有所差異。分別調(diào)查劍葉(倒一葉)、倒二葉和倒三葉, 發(fā)現(xiàn)突變體葉片寬度顯著變窄(圖1-A), 與野生型春江06相比分別減少47.04%、50.25%和49.56% (圖1-B)。在葉片長度上也有一定程度上的變短, 比野生型分別減少2.38%、16.26%和21.92% (圖2-B), 在倒二葉、倒三葉上的表型較為明顯, 但在劍葉上表現(xiàn)不太明顯(圖2-A)。另外, 突變體葉片寬度的變窄程度不受環(huán)境條件的影響。例如, 在北京昌平長日照和海南冬季短日照條件下, 與野生型相比, 突變體劍葉寬度分別減少43.05%和47.06% (表1)。

圖1 野生型和突變體nal20的葉片寬度

A: 野生型(左)和突變體(右)抽穗期的劍葉形態(tài)比較, 標(biāo)尺為10 mm; B: 劍葉、倒二葉和倒三葉葉片寬度比較。以測驗(yàn)計(jì)算值, 柱形圖中**表示突變體在<0.01水平差異顯著(= 20)。

A: flag leaf size of wild type and themutant at heading stage (bar = 10 mm); B: leaf width comparison of flag, top second, and top third leaves between WT and.-values were analyzed using Student’s-tests. ** significantly different at< 0.01 (= 20).

2.2 窄葉突變體nal20葉片的細(xì)胞學(xué)觀察

水稻的葉片主要由表皮(上表皮和下表皮)、葉肉和葉脈構(gòu)成。為進(jìn)一步研究突變體葉片變窄的機(jī)制, 我們對野生型春江06和突變體的大小葉脈和下表皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察, 分別比較兩者抽穗期時(shí)倒一葉、倒二葉和倒三葉的差異。突變體與野生型葉脈形態(tài)差異較一致(圖3-A~F), 在大葉脈數(shù)目上,突變體的倒一葉、倒二葉和倒三葉分別比野生型減少26.62%、35.57%和14.63% (圖3-G); 在小葉脈數(shù)目上, 與野生型相比, 突變體3個(gè)位置的葉片分別減少37.27%、41.25%和38.91% (圖3-H), 其中小葉脈數(shù)目的減少幅度比大葉脈更明顯。在葉片下表皮, 突變體的倒一葉、倒二葉和倒三葉并未出現(xiàn)畸形細(xì)胞, 整體細(xì)胞形態(tài)與野生型沒有明顯變化(圖4-A, B)。但是在細(xì)胞大小和數(shù)目上有比較明顯的差異, 沿著葉寬方向, 突變體3個(gè)位置的細(xì)胞寬度分別比野生型減少14.56%、16.40%和18.41% (圖4-C), 其細(xì)胞數(shù)目分別減少42.11%、35.24%和32.51% (圖4-D)。因此,葉片變窄主要是葉片橫軸方向細(xì)胞數(shù)目減少造成的。

圖2 野生型和突變體nal20的葉片長度

A: 野生型(左)和突變體(右)抽穗期的劍葉形態(tài)比較, 標(biāo)尺為5 cm; B: 劍葉、倒二葉和倒三葉葉片長度比較。測驗(yàn)計(jì)算值, 柱形圖中 *表示突變體在<0.05水平差異顯著; **表示突變體在< 0.01水平差異顯著(= 20)。

A: top leaf size of wild type and themutant at heading stage (bar = 5 cm); B: length comparison of flag, second, and top third leaves between WT and.-values were analyzed using Student’s-tests. *< 0.05, **< 0.01 (= 20).

2.3 窄葉突變體nal20的其他表型

由圖5和圖6可見, 與野生型春江06相比, 突變體還表現(xiàn)出株高變矮、分蘗數(shù)目增多、節(jié)間縮短、抽穗期提前等表型。

在整體形態(tài)上, 突變體的平均植株高度為84.35 cm, 為野生型的80% (圖5-A, B), 分蘗數(shù)目比野生型增加了13.3% (圖5-A, C)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn), 突變體株高的降低主要是由于突變體各個(gè)節(jié)間長度與野生型相比都有不同程度的縮短, 從第1莖節(jié)到第5莖節(jié)分別減少了14.03%、31.39%、40.62%、61.37%和66.14%; 莖節(jié)間數(shù)目上也有一定程度的減少, 突變體與野生型相比缺少一個(gè)節(jié)間(第6莖節(jié))(圖6-C, D), 主要是在第3莖節(jié)到第6莖節(jié)的縮短最為顯著。

圖3 野生型和突變體nal20葉脈數(shù)目比較

A, C, E: 野生型劍葉、倒二葉和倒三葉的葉脈, 標(biāo)尺為1 mm; B, D, F: 突變體劍葉、倒二葉和倒三葉的葉脈, 標(biāo)尺為1 mm; 圖中﹡表示大葉脈, 2個(gè)大葉脈中的圓點(diǎn)表示小葉脈; G, H: 野生型和突變體大葉脈數(shù)目(G)和小葉脈數(shù)目(H)的比較。測驗(yàn)計(jì)算值, 柱形圖中**表示突變體在< 0.01水平差異顯著(= 20)。

A, C, E: leaf vein shape of the flag leaf, top second leaf and top third leaf in the wild type (bars = 1 mm); B, D, F: leaf vein of the flag leaf, top second leaf and top third leaf in the mutant (bars = 1 mm); G: comparison of large vein number in the wild type and mutant; H: comparison of small vein number in the wild type and mutant.-values were analyzed using Student’s-tests. **< 0.01 (= 20).

圖4 野生型和突變體nal20葉片細(xì)胞大小和數(shù)目

A, B: 野生型(A)和突變體(B)成熟期劍葉下表皮細(xì)胞形態(tài), 標(biāo)尺為50 μm; C, D: 野生型和突變體抽穗期的葉片下表皮細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目的比較。測驗(yàn)計(jì)算值, **表示突變體在< 0.01水平差異顯著(= 20)。

A, B: Epidermal cell shape of flag leaf in the wild-type (A) and mutant (B) (bars = 50 μm); C, D: comparison of epidermal cell width and cell number along leaf-width axis.-values were analyzed from Student’s-tests. **< 0.01 (= 20).

圖5 野生型和突變體nal20的整體株型

A: 野生型(左)和突變體(右)抽穗期的株型比較, 標(biāo)尺為5 cm; B: 植株高度比較; C: 分蘗數(shù)目比較。測驗(yàn)計(jì)算值, 柱形圖中**表示突變體在< 0.01水平差異顯著(= 20)。

A: plant type of wild type andthemutant at heading stage (bar = 5 cm). Comparison of plant height (B) and tiller number (C) between WT and.-values were analyzed using Student’s tests. **< 0.01 (= 20).

在主莖穗部形態(tài)和發(fā)育上, 從圖6-A中可以看出, 突變體的穗形與野生型沒有太大差別, 但是與野生型相比, 突變體的主莖穗粒數(shù)顯著減少17.25% (圖6-B)。特別是在長日照條件下, 突變體的抽穗期明顯提前(圖5-A和表1), 而在短日照條件下兩者的抽穗時(shí)間并沒有明顯差異(表1)。

2.4 窄葉突變體nal20的遺傳分析

用窄葉突變體與葉片表型正常的秈稻品種Dular雜交, F1代植株葉片表型正常, 自交后得到的F2群體葉片性狀分離, 分為正常葉型與窄葉型。在田間隨機(jī)調(diào)查的200株中, 有46株表現(xiàn)出窄葉表型, 正常葉型和窄葉型的分離比例為3.4∶1.0, 經(jīng)卡方檢驗(yàn)得知(χ2= 0.28 < χ20.05= 3.84), 符合孟德爾遺傳3∶1的分離比例, 推斷窄葉突變體受1對隱性基因控制。

2.5 突變體nal20的基因定位

選取10株F2代窄葉表型明顯的突變體, 構(gòu)建突變體DNA混池, 采用BSA方法對覆蓋水稻全基因組的170對具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析, 發(fā)現(xiàn)目的基因可能與第7染色體的2個(gè)InDel標(biāo)記R7-4和R7-7連鎖(表2)。隨后用38株F2突變個(gè)體DNA驗(yàn)證, 將突變體目的基因初步定位在R7-4和R7-7標(biāo)記之間(圖7-A)。

為了進(jìn)一步精細(xì)定位目的基因, 將F2群體擴(kuò)大到667株突變個(gè)體, 在R7-4和R7-7標(biāo)記之間新開發(fā)了6個(gè)新的InDel標(biāo)記, 即C7-1、C7-2、C7-3、C7-4、C7-5和C7-6 (圖7-B和表2)。利用這些標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析, 最終將目的基因定位在C7-2和C7-4之間, 物理距離約為1.9 Mb (圖7-B)。

圖6 野生型和突變體nal20穗型和莖節(jié)長度

A: 野生型(左)和突變體(右)抽穗期的主莖穗形態(tài); B: 主莖穗粒數(shù)比較,測驗(yàn)計(jì)算值, 柱形圖中**表示突變體在< 0.01水平差異顯著(= 20); C: 野生型(左)和突變體(右)抽穗期的節(jié)間形態(tài); D: 節(jié)間長度比較(由上而下分別是穗長、穗莖節(jié)、第1莖節(jié)、第2莖節(jié)、第3莖節(jié)、第4莖節(jié)、第5莖節(jié)、第6莖節(jié))。

A: panicle shape of wild type andthemutant at heading stage; B: comparison of grain number per panicle. The-values were analyzed from student’s-tests. **< 0.01 (= 20); C: internodes of wild type andthemutant at heading stage; D: comparison of internode length (from the top to bottom is panicle, panicle internode, the first internode, the second internode, the third internode, the fourth internode, the fifth internode, and the sixth internode).

表1 葉片寬度和抽穗天數(shù)在不同日照條件下的比較

**表示0.01顯著水平。**Significant at the 0.01 probability level.

圖7 突變體nal20的基因定位圖譜

A: 初步定位結(jié)果; B: 精細(xì)定位結(jié)果; C: 目的基因所在區(qū)域, 虛線表示455 kb片段缺失。A, B圖中橫線上方為定位所用標(biāo)記, 下方數(shù)字為交換單株個(gè)數(shù)。

A: primary mapping result; B: fining mapping result; C: target gene region. The dashed line represents the 455 kb deletion. In panels A and B, the InDel markers and number of recombinants are marked above and below the horizontal line, respectively.

表2 InDel分子標(biāo)記

2.6 nal20突變體的重測序

通過對窄葉突變體的精細(xì)定位, 最終將目的基因定位于C7-2和C7-4標(biāo)記之間, 即Chr.7: 9020319-10974087 (Os-Nipponbare-Reference-IRGSP- 1.0 pseudomolecules)。由于該區(qū)域位于第7染色體的著絲粒區(qū), 發(fā)生重組交換的頻率很低, 而且多為重復(fù)序列, 很難開發(fā)特異性的分子標(biāo)記來縮短定位區(qū)間。為了能夠快速找到目的窄葉基因, 對突變體全基因組進(jìn)行了二代重測序, 發(fā)現(xiàn)在突變體第7染色體目標(biāo)區(qū)間內(nèi)有455 kb的缺失(g.9074601- g.9529600)(圖7-B)。利用Rice Genome Annotation (水稻基因組注釋系統(tǒng))網(wǎng)站(http://rice.plantbi-ology.msu.edu/)查看此缺失區(qū)間內(nèi)基因編碼蛋白的詳細(xì)功能信息, 發(fā)現(xiàn)在此缺失區(qū)間內(nèi)共有60個(gè)基因,其中12個(gè)具有已知的生化功能, 12個(gè)表達(dá)蛋白功能未知, 5個(gè)假定蛋白(表3), 以及31個(gè)轉(zhuǎn)座子或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。其中一個(gè)功能基因LOC_Os07g15770, 是已報(bào)道的基因。它是一個(gè)多效性基因, 能夠延遲抽穗期、增加植株高度和每穗粒數(shù), 顯著提高水稻產(chǎn)量[23], 還對調(diào)控劍葉面積起重要作用[24]。推測窄葉突變體的窄葉表型可能與基因的缺失有關(guān)。

表3 455 kb缺失區(qū)間內(nèi)的基因

3 討論

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 其葉片形態(tài)對最終產(chǎn)量有著至關(guān)重要的影響, 但是目前與葉片發(fā)育相關(guān)基因的研究大多集中在雙子葉模式植物擬南芥中, 因此研究單子葉植物水稻的葉片發(fā)育分子機(jī)制具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。我們通過60Co-γ射線誘變粳稻品種春江06, 在M2代中得到了穩(wěn)定遺傳的窄葉突變體, 其葉片寬度減少為野生型的一半左右。圖位克隆結(jié)果顯示基因位于第7染色體著絲粒區(qū), 進(jìn)一步的二代測序結(jié)果表明在目標(biāo)區(qū)域(1.9 Mb)內(nèi)有455 kb缺失, 涵蓋了60個(gè)基因, 其中1個(gè)基因()已報(bào)道與葉片發(fā)育相關(guān)。在本研究中, 由圖位克隆結(jié)果可知, 目標(biāo)突變區(qū)域位于著絲粒附近, 此處發(fā)生重組交換的頻率極低, 需要使用數(shù)目非常龐大的F2代的突變個(gè)體來縮小目標(biāo)區(qū)域, 是極其耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)過程。目前, 二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)日漸成熟, 具有高通量、快速、精準(zhǔn)、費(fèi)用低等特點(diǎn), 應(yīng)用該技術(shù)已經(jīng)成為生物信息學(xué)研究及基因檢測的發(fā)展趨勢。在本研究中采用二代測序技術(shù)尋找目標(biāo)突變位點(diǎn)無疑是一種快速有效的實(shí)驗(yàn)方法。

是一個(gè)多效基因, 對水稻的植株高度(plant height, PH)、抽穗期(heading date, HD)和每穗穎花數(shù)(spikelet number per panicle, SPP)都有很大的效應(yīng)[23]。此外, 通過調(diào)查近等基因系的FLL (劍葉長度)、FLW (劍葉寬度)和FLA (劍葉面積) 3個(gè)性狀, 發(fā)現(xiàn)對其有較大的遺傳效應(yīng), 即對調(diào)控劍葉面積起重要作用。相關(guān)性分析表明, 每穗穎花數(shù)與3個(gè)劍葉性狀之間的相關(guān)性最高, 說明通過產(chǎn)生較大的葉面積來保證充足的光合作用, 從而滿足產(chǎn)生更多的穎花數(shù)的需求[24]。由于能夠提高產(chǎn)量, 目前在水稻生產(chǎn)上也得到了非常廣泛的應(yīng)用?；驎?huì)延遲HD, 增加PH和SPP值[25]。還可能在水稻開花途徑中和基因的上游起作用, 在長日照條件下提高這2個(gè)控制花期基因的表達(dá)[26-27]。對基因在水稻自然群體中的多態(tài)性分析(點(diǎn)突變或插入缺失)發(fā)現(xiàn),基因的不同等位變異(或稱單倍型)具有不同的效應(yīng), 其中Ghd7蛋白多樣性是調(diào)節(jié)表型變異的關(guān)鍵因素。比較的3個(gè)性狀發(fā)現(xiàn), 只有在長日照條件下HD和SPP的變化極顯著。在熱帶地區(qū)的單倍型能夠調(diào)控植物迅速適應(yīng)當(dāng)?shù)厣L季節(jié)的增長而增加產(chǎn)量, 而在溫帶地區(qū)的單倍型會(huì)縮短水稻生命周期以保證結(jié)實(shí)率[23,25]。的自然變異對水稻適應(yīng)和遺傳改良有很大的貢獻(xiàn), 使得這個(gè)多效基因能被靈活應(yīng)用于現(xiàn)代分子育種中。同時(shí)還可為了滿足不同生態(tài)類型的品種需求, 開發(fā)特定的分子標(biāo)記來選擇合適的單倍型。

本研究中的突變體植株高度明顯低于野生型(圖5); 劍葉面積比野生型減少44.6%; 穗部發(fā)育上, 在長日照條件下, 抽穗時(shí)間比野生型提前37 d (圖5-A和表1), 而在短日照下沒有明顯差異(表1)。野生型和突變體的穗粒數(shù)分別為93.95和77.75, 突變體的每穗粒數(shù)減少17.24%。綜上所述, 突變體表現(xiàn)為株高降低、開花期提前、每穗粒數(shù)減少、劍葉面積減少, 與已報(bào)道的基因效應(yīng)相反, 故我們推測突變體表型很可能是缺失基因功能所致。但是, 由于目標(biāo)區(qū)域缺失范圍內(nèi)還有其他功能基因, 還需要通過轉(zhuǎn)基因的方式來證實(shí)基因缺失是導(dǎo)致葉片變窄的根本原因。

4 結(jié)論

利用60Co-γ射線誘變粳稻品種春江06獲得了一個(gè)窄葉突變體, 從劍葉到倒三葉均表現(xiàn)葉片寬度減少50%、植株高度降低、抽穗時(shí)間提前。葉片寬度變窄主要是細(xì)胞數(shù)目減少所致。該突變體基因定位于第7染色體著絲粒區(qū), 目標(biāo)區(qū)域內(nèi)有455 kb大片段缺失,的突變表型可能與基因的缺失有關(guān)。

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Phenotypic Analysis and Gene Mapping of the Rice Narrow-leaf Mutant

LONG Hai-Xin, QIU Hai-Yang, Muhammad UZAIR, FANG Jing-Jing, ZHAO Jin-Feng, and LI Xue-Yong*

National Key Facility for Crop Gene Resource and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Leaf is the major organ for photosynthesis in plant, and its area influences the light energy utilization efficiency and grain yield. To study the molecular mechanism of rice leaf morphology, we mutagenized thecultivar Chunjiang 06 through60Co-γ radiation. A stable narrow leaf mutant named as()was obtained in the M2population. Themutant showed narrow leaf, reduced plant height, increased tiller number, shortened internodes, and earlier heading date. Here we mainly focused on the morphology of the flag leaf, the second top leaf and the third top leaf. We found that the blade width of the mutant reduced by 50%, compared with the wild type. Meanwhile, the variation on the blade length was relatively small. Cytological observation of leaf epidermal cells indicated that the reduced leaf width was mainly due to the decreased cell number, but not the cell size. Genetic analysis indicated that the narrow leaf phenotype was controlled by a recessive gene. Using the mutant plants from the F2mappingpopulation derived from a cross betweenand Dular, the candidate mutation locus was mapped to 1.9 Mb within the centromere of chromosome 7 by using polymorphic InDel markers. The next-generation sequencing result showed that a deletion of 455 kb occurred in the predicted region. Our study lays a good foundation for the cloning and functional study of thegene and provides gene resources and breeding materials for the improvement of rice plant architecture.

rice; leaf; narrow-leaf mutant; heading date; gene mapping

2018-02-07;

2018-06-12;

2018-07-02.

10.3724/SP.J.1006.2018.01301

李學(xué)勇, E-mail: lixueyong@caas.cn, Tel: 010-82107409

E-mail: lhxbling@126.com

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2016ZX08009-003)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08009-003).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180702.0909.006.html