郭榮榮，林 玲，周思泓，韓佳宇，張 瑛 *，白先進(jìn)

(1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007；2. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007)

【研究意義】葡萄是世界上栽培面積最為廣泛，人們最喜愛和加工產(chǎn)品最為豐富的水果之一。近年來，我國(guó)鮮食葡萄和釀酒葡萄的栽培面積和產(chǎn)量一直處于增長(zhǎng)狀態(tài)。葡萄一年兩收栽培技術(shù)是指一年生產(chǎn)兩造葡萄的栽培模式，是充分利用葡萄芽一年多次分化的特點(diǎn)，利用綠枝夏芽、冬芽當(dāng)年開花，或打破老熟枝條冬芽休眠，形成兩季葡萄產(chǎn)量，可實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)，并延長(zhǎng)葡萄供應(yīng)期[1-2]。廣西地處亞熱帶氣候區(qū)，冬季較短，夏季較長(zhǎng)，年平均氣溫在16～23 ℃，≥10 ℃的有效年積溫為5036.7～8017.4 ℃，全年無霜期多在300 d以上，適合研究和推廣葡萄一年兩收栽培技術(shù)。但是由于受到廣西上半年多雨、寡日照等自然條件的限制，部分品種(如主栽品種‘夏黑’)生長(zhǎng)旺盛，二季果花芽分化不穩(wěn)定或成花很少，使二季果產(chǎn)量難以保證，在一定程度上阻礙了葡萄一年兩收栽培技術(shù)的推廣和優(yōu)良品種的引進(jìn)。進(jìn)行葡萄花序形成關(guān)鍵基因TFL1A上游的調(diào)控因子篩選的研究，可以為解析葡萄花序形成的調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TERMINALFLOWER1(TFL1)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)基因家族的成員[3]。葡萄中的TFL1包含3個(gè)序列，分別為VvTFL1A，VvTFL1B和VvTFL1C，它們可能與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及分生組織的不確定有關(guān)[4]。Boss 等(2006)發(fā)現(xiàn)在擬南芥和煙草中過量表達(dá)VvTFL1基因會(huì)使其開花顯著延遲，且在部分轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中花序分生組織較模糊，在發(fā)育的角果中還會(huì)出現(xiàn)新的花序[5]。而Carmona等(2007)的研究則表明過量表達(dá)VvTFL1A不會(huì)影響開花時(shí)間，但是會(huì)影響花分生組織的確定，極大的改變花序結(jié)構(gòu)[4]。Crane等(2012)通過比較同一根枝條上結(jié)實(shí)芽和非結(jié)實(shí)芽發(fā)育過程中決定花分生組織去向的主要調(diào)控因子的表達(dá)水平，將TFL1(花分生組織特征的負(fù)調(diào)節(jié)子)的表達(dá)與結(jié)實(shí)芽聯(lián)系起來，將花分生組織特征的正調(diào)節(jié)子與非結(jié)實(shí)芽聯(lián)系起來[6]。此外，通過分析施加外源CK對(duì)離體培養(yǎng)的卷須表型及卷須中VvTFLA、VAP1和VvLFY表達(dá)量的影響，以及對(duì)VvTFL1A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)高水平的CK上調(diào)VvTFL1A，延遲花分生組織確定，增加分枝的形成，最終形成花序[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)從一季果花前3 d到一季果花后18 d，較高水平的TFL1A的表達(dá)會(huì)促進(jìn)夏黑葡萄二季果花序原基的形成和發(fā)育[7]，但其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。酵母單雜交技術(shù)可以有效地檢測(cè)出與啟動(dòng)子上順式作用元件專一性互作的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[8]。郇蕾等(2017)利用該方法篩選桃PpABI5啟動(dòng)子的上游轉(zhuǎn)錄因子，獲得PpDAM3和PpDAM5兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并通過該方法進(jìn)一步證實(shí)PpDAM3和PpDAM5可以與PpABI5啟動(dòng)子結(jié)合，表明篩選出的這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控PpABI5的轉(zhuǎn)錄[9]。郭育強(qiáng)等(2016)運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建了木薯酵母單雜交cDNA文庫，篩選MeCWINV6啟動(dòng)子的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并篩選出鋅指蛋白、組氨酸蛋白H1.2和AT-hook核定位蛋白三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以及一個(gè)線粒體受體TOM5，為進(jìn)一步研究MeCWINV6基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了候選轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[10]。【本研究切入點(diǎn)】目前，對(duì)葡萄中TFL1A基因功能的研究較多，但對(duì)其調(diào)控機(jī)理的研究報(bào)道很少。弄清楚作用在該基因上游的調(diào)控因子，有助于完善其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步解析葡萄花序發(fā)育的調(diào)控機(jī)理?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以VlTFL1A基因的啟動(dòng)子序列構(gòu)建誘餌載體，并構(gòu)建酵母單雜交文庫，篩選與其啟動(dòng)子順式作用元件相結(jié)合的調(diào)節(jié)因子，為研究VlTFL1A在葡萄花序發(fā)育中的調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究于2017年4-5月進(jìn)行，供試品種為8年生夏黑葡萄，種植于南寧市明陽工業(yè)園區(qū)，植株種植株行距為1.5 m×3.3 m，采用簡(jiǎn)易避雨雙十字V型架栽培模式，群體通風(fēng)條件良好，管理水平中上。2017年1月上中旬對(duì)夏黑葡萄進(jìn)行修剪，2月上旬催芽，4月上旬開花。構(gòu)建酵母單雜交文庫及克隆VlTFL1A基因啟動(dòng)子序列所用材料為夏黑葡萄一季果冬芽。

1.1.2 主要試劑 SD/-Ura DO Supplement、SD/-Leu DO Supplement、Aureobasidin A(AbA)和cDNA文庫構(gòu)建試劑盒購(gòu)自Clontech公司；Adenine Sulfate(Ade)為Amresco公司產(chǎn)品。各種工具酶、Marker購(gòu)自TaKaRa公司。PCR引物合成和測(cè)序由華大完成。

1.2 方法

1.2.1VlTFL1A基因啟動(dòng)子序列分析及pAbAi-pTFL1A誘餌載體構(gòu)建 提取夏黑葡萄基因組DNA，在NCBI上查找歐洲葡萄黑比諾中VlTFL1A的啟動(dòng)子序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物VlTFL1A-F (KpnI) (5′-ctggtaccCCCTACAAAGGGGAGATTTCTTTGCTTGCT-3′)和VlTFL1A-R (SalI) (5′-ctagtcgATGAGAGAGAG AGAGAGAGGAGAGACGAGG-3′)，克隆VlTFL1A基因的啟動(dòng)子序列并測(cè)序。利用啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)軟件PlantCARE (http://bio-informatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對(duì)該啟動(dòng)子序列進(jìn)行在線分析。

將VlTFL1A啟動(dòng)子的質(zhì)粒和pAbAi表達(dá)載體分別用KpnI和SalI酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別純化回收后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞中，活化后涂布于LB固體培養(yǎng)基上(內(nèi)含30 ng/mL Amp)，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，然后選取陽性單克隆送華大基因測(cè)序，測(cè)序正確的即為誘餌載體pAbAi-pTFL1A。

1.2.2 誘餌載體和陽性對(duì)照轉(zhuǎn)化酵母菌株 將誘餌載體pAbAi-pTFL1A和陽性對(duì)照p53-AbAi質(zhì)粒用Bbs 1酶進(jìn)行線性化，然后轉(zhuǎn)入Y1HGold菌株中，用SD/-Ura和SD/-Ura/AbA(200 ng/mL)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，30 ℃培養(yǎng)4～5 d后，挑SD/-Ura/AbA平板上的單菌落，用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Clontech)做菌液PCR，一管不加模板為負(fù)對(duì)照，一管加入0.5 μl對(duì)照質(zhì)粒作為正對(duì)照，用于確定陽性菌落。然后選取誘餌載體pAbAi-pTFL1A上的一個(gè)陽性單菌落，以及陽性對(duì)照p53-AbAi上的一個(gè)菌落，在SD/-Ura/AbA(200 ng/mL)培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)3 d，即構(gòu)建Y1H[pAbAi-pTFL1A] 和Y1H[p53-AbAi]酵母菌株。

1.2.3 用于構(gòu)建文庫的cDNA合成 采用Trizol法提取葡萄冬芽總RNA，然后采用Oligotex mRNA Kit (Qiagen) 分離純化mRNA，利用SMART逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得cDNA第一鏈，再通過LD PCR合成雙鏈的SMART ds-cDNA，最后用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 文庫cDNA轉(zhuǎn)化誘餌菌株 用Eppendorf電轉(zhuǎn)化儀電轉(zhuǎn)線性化質(zhì)粒pGADT7-Rec和文庫cDNA于構(gòu)建好的誘餌菌株Y1H[pAbAi-pTFL1A]感受態(tài)中。涂布200 μl轉(zhuǎn)化后的菌液于SD/-Leu/AbA(200 ng/mL)平板上，30 ℃培養(yǎng)4～5 d，以初步篩選陽性克隆。

1.2.5 陽性克隆的確認(rèn)及序列分析 挑取SD/-Leu/AbA(200 ng/mL)平板上的單菌落接種于YPDA液體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)3～4 d后再劃線于SD/-Leu/AbA(200 ng/mL)平板上，培養(yǎng)3～4 d后挑取長(zhǎng)出的單菌落搖菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。利用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2做菌液PCR，產(chǎn)物經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將500～2000 bp間有條帶的菌液用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送華大基因測(cè)序。在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上利用Blast工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，初步分析篩選得到的cDNA序列。

表1 夏黑葡萄中VlTFL1A啟動(dòng)子的順式作用元件

圖1 線性化的pAbAi-pVlTFL1A轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母感受態(tài)后涂布在SD/-Ura(a)和SD/-Ura/AbA(b)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 The growth situation of linearized pAbAi-pVlTFL1A transformed Y1HGold yeast competent on SD/-Ura (a) and SD/-Ura/AbA (b) medium

2 結(jié)果與分析

2.1 VlTFL1A基因啟動(dòng)子的序列分析

啟動(dòng)子序列分析表明，VlTFL1A啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)組成型核心啟動(dòng)子順式作用元件，如CAAT-box 和TATA-box；還含有多種植物激素響應(yīng)元件，如AuxRR-core、GARE-motif和P-box；光響應(yīng)元件box4、CATT-motif、GA-motif、GAG-motif、GATA-motif、GT1-motif、I-box、Sp1、TCCC-motif和as-2-box；響應(yīng)環(huán)境脅迫的元件，如Box-W1、MBS和TC-rich repeats；參與玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)的O2-site；參與胚乳表達(dá)的Skn-1 motif；參與枝條特異表達(dá)的as-2-box以及參與生物鐘控制的circadian等(表1)。

2.2 誘餌菌株的構(gòu)建

將克隆獲得的VlTFL1A啟動(dòng)子序列連接到誘餌載體pAbAi上，將經(jīng)Bbs 1酶線性化的pAbAi-pVlTFL1A轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母感受態(tài)，涂平板培養(yǎng)4～5 d后，發(fā)現(xiàn)其能在SD/-Ura培養(yǎng)基上出現(xiàn)正常生長(zhǎng)的菌落，表明轉(zhuǎn)化成功；而在SD/-Ura/AbA培養(yǎng)基(AbA濃度為200ng/mL)上未長(zhǎng)出菌落，表明當(dāng)AbA濃度為200 ng/mL時(shí)可以完全抑制誘餌菌株生長(zhǎng)(圖1)。

M:2Kb DNA marker，1:葡萄冬芽總RNAM：DL2000 DNA marker, 1:Total RNA extracted from latent buds of Summer Black圖2 夏黑葡萄冬芽總RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoresis of total RNA extracted from latent buds of Summer Black

2.3 cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)化誘餌菌株

提取的葡萄冬芽總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶比較清晰，且28S rRNA亮度約為18S rRNA的2倍(圖2)，說明所提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于構(gòu)建cDNA文庫。

將文庫cDNA與線性化的pGADT7載體共轉(zhuǎn)化誘餌菌株Y1H[pAbAi-pVlTFL1A]感受態(tài)細(xì)胞，涂布200 μl轉(zhuǎn)化后的菌液于SD/-Leu/AbA平板上。負(fù)對(duì)照在SD/-Leu/AbA平板上不能生長(zhǎng)(圖3a, b)，正對(duì)照在SD/-Leu/AbA平板上生長(zhǎng)(圖3c)，表明該篩選系統(tǒng)沒有問題。將cDNA與線性化的pGADT7載體共轉(zhuǎn)化誘餌菌株Y1H[pAbAi-pVlTFL1A]感受態(tài)細(xì)胞后，涂布在SD/-Leu/AbA平板上有菌落生長(zhǎng)(圖3d)，表明是因?yàn)楂C物蛋白與誘餌基因發(fā)生互作從而激活A(yù)bA抗性基因轉(zhuǎn)錄。

2.4 VlTFL1A啟動(dòng)子片段與葡萄cDNA文庫的酵母單雜交篩選

挑取2.3中在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大于500 bp的陽性克隆9個(gè)(圖4)。對(duì)9個(gè)陽性克隆分別進(jìn)行測(cè)序，在NCBI中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這9個(gè)陽性克隆編碼的蛋白分別為信號(hào)識(shí)別受體ɑ亞基(XP_002278056.1)、鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白(NP_001268169.1)、轉(zhuǎn)酮醇酶(XM_002266458.4)、木葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶(XM_003635370.3)、F-box蛋白At2g32560-like(XP_019076275.1)、冠毒素不敏感基因1(COI1，JQ281907.1)、UV-B誘導(dǎo)蛋白At3g17800(XM_002267245.4)和重金屬相關(guān)的異戊二烯蛋白39(XR_002032177.1)，此外還有一個(gè)未知蛋白LOC100254834(XP_010652413.1)。

(a)[pAbAi-pVlTFL1A]+pGADT7陰性對(duì)照。(b)[pAbAi-pVlTFL1A]陰性對(duì)照。(c)[pAbAi-p53]+pGADT7-p53陽性對(duì)照。(d)[pAbAi-pVlTFL1A]+pGADT7-prey(a) Negative control [pAbAi-pVlTFL1A]+pGADT7. (b) Negative control [pAbAi-pVlTFL1A]. (c) Positive control [pAbAi-p53]+pGADT7-p53. (d) [pAbAi-pVlTFL1A]+pGADT7-prey圖3 pGADT7-prey轉(zhuǎn)化Y1H[pAbAi-pVlTFL1A]誘餌菌株感受態(tài)在SD/-Leu/AbA平板上生長(zhǎng)的結(jié)果，AbA濃度為200 ng/mLFig.3 The growth results of pGADT7-prey transformed Y1H[pAbAi-pVlTFL1A] yeast competent on SD/-Leu/AbA medium, the concertration of AbA as 200 ng/mL

泳道M:DNA marker DL2000M:DNA marker DL2000圖4 cDNA文庫插入片段的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of cDNA library inserts

3 討 論

本研究通過構(gòu)建酵母單雜交cDNA文庫，篩選與VlTFL1A啟動(dòng)子結(jié)合的上游調(diào)控因子，最終獲得信號(hào)識(shí)別受體ɑ亞基、鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)酮醇酶、木葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶、F-box蛋白At2g32560-like、冠毒素不敏感基因1(COI1)、UV-B誘導(dǎo)蛋白At3g17800、重金屬相關(guān)的異戊二烯蛋白39等8個(gè)蛋白和一個(gè)未知功能蛋白。

前人研究表明TFL1A基因在葡萄始原基分化為花序原基或卷須原基的過程中起重要調(diào)控作用[6]。課題組前期通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)中除了LFY蛋白和bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族中的FD蛋白外，其余均為核糖體蛋白[7]。本研究中篩選獲得的與VlTFL1A啟動(dòng)子結(jié)合的9個(gè)上游調(diào)控因子在葡萄花序形成中的作用尚不明確。

F-box蛋白在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自交不親和以及花器官發(fā)育等許多生理過程中都具有重要功能[11]。擬南芥中的UFO基因編碼一個(gè)F-box蛋白，該基因在花器官的形成和花分生組織特征的確定中發(fā)揮重要作用[12]。AtUFO基因在矮牽牛中的同源基因DOT可以調(diào)節(jié)花分生組織特征基因的表達(dá)，從而影響花形成的時(shí)間和位置[13]。但本研究中篩選出的F-box蛋白At2g32560-like與上述蛋白的同源性較低，在葡萄中的生物學(xué)功能尚不明確。

COI1也是一個(gè)F-box蛋白，在擬南芥中該蛋白與Skp1-like 1、Skp1-like 2、cullin 1以及ring-box蛋白1形成SCFCOI1 E3泛素連接酶復(fù)合體，該復(fù)合體對(duì)植物響應(yīng)茉莉酸是必需的，而茉莉酸信號(hào)分子對(duì)包括植物防衛(wèi)反應(yīng)和生殖在內(nèi)的多種生物學(xué)功能來說都是必需的[14-15]。目前尚未有COI1參與植物成花調(diào)控的報(bào)道。

信號(hào)識(shí)別受體ɑ亞基對(duì)尚不成熟的多肽穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜來說是必不可少的，這種行為是通過信號(hào)識(shí)別顆粒所介導(dǎo)的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的[16]。鈣調(diào)蛋白是廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞中的多功能信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控蛋白，通過與響應(yīng)靶蛋白結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)生物體內(nèi)多種鈣離子依賴的細(xì)胞功能和酶體系都有重要的調(diào)節(jié)作用[17]。轉(zhuǎn)酮醇酶是一種磷酸硫胺素依賴性酶，在異養(yǎng)生物中作為糖酵解和戊糖磷酸途徑的紐帶，為核苷酸、氨基酸和維生素的生物合成提供底物[18]，在高等植物中參與卡爾文循環(huán)[19]。木葡聚糖是植物細(xì)胞壁中的一種重要多糖組分，在細(xì)胞壁框架結(jié)構(gòu)的形成、細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中形態(tài)變化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[20]。木葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶是木葡聚糖合成中的重要組分，在木葡聚糖的合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。UV-B誘導(dǎo)蛋白在擬南芥中的同源基因At3g17800編碼一個(gè)受UV-B誘導(dǎo)強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)的基因[22]。重金屬相關(guān)的異戊二烯蛋白在維管植物的生長(zhǎng)發(fā)育和植物應(yīng)對(duì)環(huán)境的改變中發(fā)揮重要作用[23]。

目前，篩選獲得的這9個(gè)蛋白在其它物種中的同源基因在植物成花方面的功能研究尚未見報(bào)道。下一步將對(duì)這9個(gè)蛋白進(jìn)行功能鑒定，以期完善VlTFL1A基因的功能解析及調(diào)控機(jī)理研究。

4 結(jié) 論

本研究通過酵母單雜交技術(shù)，篩選作用在葡萄花序形成關(guān)鍵基因TFL1A啟動(dòng)子上游的調(diào)控因子，共獲得信號(hào)識(shí)別受體亞基、鈣調(diào)蛋白相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)酮醇酶、木葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶、F-box蛋白、冠毒素不敏感基因1(COI1)、UV-B誘導(dǎo)蛋白、重金屬相關(guān)的異戊二烯蛋白39等8個(gè)蛋白和一個(gè)未知功能的蛋白。