肖旭倩，胡正龍，沈文濤，言 普，王冬梅，周 鵬*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101； 2.萬(wàn)博科技職業(yè)學(xué)院生物與環(huán)境系，安徽合肥 230001；3.合肥市國(guó)正資產(chǎn)經(jīng)營(yíng)有限公司，安徽 合肥 230001；4.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007 )

【研究意義】口蹄疫(Foot and Mouth Disease FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus FMDV)感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病，被國(guó)際獸醫(yī)局列為頭號(hào)A類傳染病[1]，由于口蹄疫爆發(fā)快、傳播廣，對(duì)當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)影響較大，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，我國(guó)在《 國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中將其列為一類優(yōu)先防治動(dòng)物疫病。目前防治口蹄疫的主要方法是接種疫苗，但其弊端也非常明顯，如接種操作繁瑣費(fèi)用較高、疫苗易散毒、病毒毒力返強(qiáng)，因此尋找安全方便、成本低廉、抗多種病毒的基因工程疫苗成為研究熱點(diǎn)。而轉(zhuǎn)基因可飼性植物疫苗因免疫方式簡(jiǎn)單、成本低廉、儲(chǔ)存方便等特點(diǎn)最具優(yōu)勢(shì)[2-5]。 【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)FMDV表位基因疫苗研究較多，而針對(duì)同型與異型口蹄疫病毒的不同多表位基因組合以及何種組合免疫效果最佳的研究報(bào)道較少[6-14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以A/O型FMDV多個(gè)B/T細(xì)胞抗原表位融合基因串聯(lián)構(gòu)建的中間載體為基礎(chǔ)[15]，構(gòu)建不同組合的植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌工程菌株，侵染豆科牧草熱研二號(hào)柱花草(Stylosanthesguianensiscv.ReyanⅡ)，獲得不同組合的轉(zhuǎn)基因植株，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為研究同型與異型FMDV之間多表位基因的不同融合方式的免疫原性及免疫效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株、質(zhì)粒與植物材料：常規(guī)克隆宿主菌DH5a、農(nóng)桿菌EHA105及質(zhì)粒pBI121為實(shí)驗(yàn)室保存；中間載體(pMD-xsB/pMD-xsT/pMD-xsBT/pMD-xsBTT )為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。熱研2號(hào)柱花草種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶品種資源研究所惠贈(zèng)。

主要試劑及培養(yǎng)基[16]：Klenow酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa產(chǎn)品；High Fidelity PCR Enzyme Mix、限制性內(nèi)切酶為Fermentas產(chǎn)品；E.Z.N.A. Gel Extraction Kit, Plasmid Mini Kit為OMEGA產(chǎn)品。M1：MS固體培養(yǎng)基，種子發(fā)芽及繼代培養(yǎng)基；M2：MS液體培養(yǎng)基，侵染液配制培養(yǎng)基；M3：M1+6-BA4.0 mg/L+ NAA1.0 mg/L，誘導(dǎo)子葉出愈傷組織和分化培養(yǎng)基；M4：M1+ NAA1.0 mg/L生根培養(yǎng)基。

引物：W1：5’-acTCTAGAATGTCCGGAACCGATGGCCCAAG-3’；W2：5’-cgGAGCTCTCATTATCCATTTGGAAGGGTTCTTG-3’；W3：5’-acTCTAGAATGTCCGGAGCAGCAATTGAGT-3’；W4：5’-cgGAGCTCTCATTATCCATTGCTGGTGGTATCG-3’；p1211：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(距離目的基因5’端約80bp)；p1212：5’-GTAAAACGACGGCCAGTG-3’(距離目的基因3’端約280bp)。為便于后期載體構(gòu)建引入XbaⅠ(下劃線所示)和SacⅠ(波浪線所示)酶切位點(diǎn)，所有基因合成及測(cè)序由寶生物(大連)公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI酶切去除植物表達(dá)載體pBI121和中間載體pMD-xsB/ pMD-xsT/pMD-xsBT/pMD-xsBTT，分別回收相應(yīng)片段連接轉(zhuǎn)化DH5a后，在Kanamycin(卡那霉素，Kan )50 μg/mL的LB平板上培養(yǎng)篩選，提取質(zhì)粒做雙酶切鑒定，4種陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。采用直接轉(zhuǎn)化法[17]分別將4種重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，在含Rifampicin(利福平，Rif)25 μg/mL，Streptomycin(鏈霉素，Str )25 μg/mL，Kan 50 μg/mL的平板上篩選，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定(引物對(duì)p1211-p1212 )及XbaI、SacI酶切鑒定。

1.2.2 熱研2號(hào)柱花草的遺傳轉(zhuǎn)化 ①柱花草外植體的獲得及預(yù)處理。按照文獻(xiàn)[16]的方法處理培養(yǎng)柱花草種子，待無(wú)菌苗抽出2片真葉，剪下子葉切成0.5 cm2見(jiàn)方的小塊作為外植體材料。將切好的外植體材料放在M3平板上黑暗預(yù)培養(yǎng)2 d。②柱花草抗性敏感試驗(yàn)。將柱花草外植體和柱花草無(wú)根單株分別接種在含Kan的M3和M4培養(yǎng)基平板中，Kan的濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg/L。根據(jù)出芽、生根和死亡情況來(lái)確定最佳選擇壓力。③農(nóng)桿菌侵染液的制備及轉(zhuǎn)化。挑取重組農(nóng)桿菌單菌落，接種于10 mL附加有Kan 50 mg/L、Rif 25 mg/L、Str 25 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同下)至OD600=1.0時(shí)，吸取200 μl菌液加到10 mL 液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6左右時(shí)，吸取1 mL菌液注入1.5 mL離心管中，5000 r/min離心2 min，棄去上清，用等體積M2重懸菌體細(xì)胞后，再將重懸后的菌液稀釋至OD600約0.1，即為轉(zhuǎn)化用的侵染液。將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的外植體投入裝有20 mL侵染液的三角瓶中，輕搖浸泡3 min，倒掉菌液，侵染后的葉盤放到鋪有濾紙的M3培養(yǎng)基平板上，28 ℃黑暗共培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移到含有Kan和Carbenicillin(羧芐青霉素，Carb)400 mg/L的M3培養(yǎng)基平板上。轉(zhuǎn)接2～3次，逐漸去除培養(yǎng)基中的Carb，選擇生長(zhǎng)健壯的芽進(jìn)行繼代及Kan的抗性篩選。將經(jīng)3次繼代抗性篩選仍然生長(zhǎng)正常的株系接種在含有Kan的M4培養(yǎng)基平板中，誘導(dǎo)根的形成及進(jìn)一步的抗性篩選。④柱花草轉(zhuǎn)化植株的篩選檢測(cè)。A.特異引物PCR檢測(cè)。提取抗性植株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物對(duì)W1-W2擴(kuò)增轉(zhuǎn)pBI-xsB的抗性植株基因組DNA，W3-W4擴(kuò)增轉(zhuǎn)pBI-xsT的抗性植株基因組DNA，W1-W4擴(kuò)增轉(zhuǎn)pBI-xsBT和pBI-xsBTT的抗性植株基因組DNA。B.轉(zhuǎn)基因檢測(cè)引物PCR擴(kuò)增。分析測(cè)試中心提供的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)引物35SF1在啟動(dòng)子35S 3’端，引物NOSR1在終止子NOS的5’端，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的4種重組植物表達(dá)載體中目的片段位于CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子之間，用該引物對(duì)上述檢測(cè)為陽(yáng)性的植株DNA再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最大限度降低初步篩選的假陽(yáng)性。C.RT-PCR檢測(cè)。采用Promega公司產(chǎn)品核酸自動(dòng)提取純化儀MaxwellTM16和配套試劑盒MaxwellTM16 Total RNA Purification Kit，提取上述實(shí)驗(yàn)中PCR都為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化株材料RNA，再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa RNA Kit(AMV) Ver.3.0進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2 %凝膠電泳分析。

Lane M: DL2000 DNA marker; Lane M1: DL15 000 DNA marker; Lane 1: The plasmid pMD-xsB digested by Xba I and Sac I; Lane 2: The plasmid pMD-xsT digested by Xba I and Sac I; Lane 3: The plasmid pMD-xsBT digested by Xba I and SacI; Lane 4: The plasmid pMD-xsBTT digested by Xba I and Sac I; Lane 5: The plasmid pBI121 digested by Xba I and Sac I圖1 中間載體質(zhì)粒pMD-xsB、pMD-xsT、pMD-xsBT、pMD-xsBTT和pBI121雙酶切Fig.1 pMD-xsB / pMD-xsT/ pMD-xsBT / pMD-xsBTT and pBI121 double digested by Xba I and Sac I

2 結(jié)果與分析

2.1 重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI酶切切除植物表達(dá)載體pBI121上約2.1 kb的GUS基因(圖1泳道5)，電泳后回收pBI121載體大片段，同時(shí)酶切質(zhì)粒pMD-xsB/pMD-xsT/ pMD-xsBT/pMD-xsBTT，酶切產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)約186、357、528、870 bp目的片段。將各目的片段與載體大片段連接轉(zhuǎn)化后用載體引物p1211-p1212 PCR鑒定重組植物表達(dá)載體，凝膠電泳后出現(xiàn)約550、720、890和1230 bp目的帶(圖2)，送測(cè)結(jié)果表明此重組植物表達(dá)載體構(gòu)建正確，成功獲得pBI-xsB/pBI-xsT/pBI-xsBT/pBI-xsBTT 4個(gè)不同組合重組植物表達(dá)載體。

Lane M: DL2000 DNA marker; Lane 1: pBI-xsB;Lane 2: pBI-xsT; Lane 3: pBI-xsBT; Lane 4: pBI-xsBTT; Lane 5: The negative control圖2 PCR鑒定植物表達(dá)載體Fig.2 Identification of the plant expression vectors by PCR in E.coli DH5α

Lane M1:DL15000 DNA marker; Lane 1: pBI-xsB digested by Xba I and Sac I; Lane 2: pBI -xsT digested by Xba I and Sac I; Lane 3: pBI-xsBT digested by Xba I and Sac I; Lane 4: pBI-xsBTT digested by Xba I and Sac I圖3 酶切鑒定植物表達(dá)載體Fig.3 Identification of the plant expression vectors by enzymes digestion

2.2 農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

采用直接轉(zhuǎn)化法將重組植物表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株EHA105，提取轉(zhuǎn)化重組的農(nóng)桿菌質(zhì)粒進(jìn)行XbaI和SacI雙酶切鑒定，能切下相應(yīng)片段(圖3)。從結(jié)果分析，成功獲得了4種含重組植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株。

2.3 柱花草Kan抗性敏感試驗(yàn)

培養(yǎng)15 d后，不同Kan濃度對(duì)柱花草子葉葉盤出愈、分化和無(wú)根單株生根有不同的抑制作用。在對(duì)照組培養(yǎng)基上葉盤被誘導(dǎo)出大量愈傷組織并分化出芽，隨Kan濃度的增加，出愈率和分化率逐漸下降，Kan為60 mg/L的培養(yǎng)基上葉盤萎縮變黃，最終褐化，死亡，所以選擇50 mg/L的Kan濃度作為轉(zhuǎn)化葉盤出愈和分化選擇壓力(圖4)；培養(yǎng)15 d后，對(duì)照組中無(wú)根苗根系發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)良好，在Kan為30mg/L時(shí)植株中有少數(shù)側(cè)根，但生長(zhǎng)緩慢；當(dāng)Kan增至50 mg/L時(shí)植株不生根，且葉片黃化；繼續(xù)增加Kan濃度至60 mg/L，葉片及整株植株黃化死亡(圖5)。因此選擇50 mg/L的Kan濃度作為轉(zhuǎn)基因植株生根選擇壓力。

1-6: Different concentration Kan, 10, 20, 30, 40, 50，60 mg/L, respectively圖4 熱研2號(hào)柱花草子葉出愈傷和分化的Kan梯度試驗(yàn)Fig.4 Different concentration Kan effect on forming callus and sprout

1-6:The different concentration Kan, 10, 20, 30, 40, 50, 60 mg/L, respectively圖5 熱研2號(hào)柱花草生根的Kan梯度試驗(yàn)Fig.5 Different concentration Kan effect on rooting

圖6 抗性愈傷篩選Fig.6 Anti-Kan concentration choice of callus

2.4 柱花草轉(zhuǎn)化植株的篩選和移栽

經(jīng)過(guò)Kan對(duì)轉(zhuǎn)化葉盤愈傷組織誘導(dǎo)與芽的分化和再生苗的生根篩選，最終共得到60株再生苗，39株能在抗性生根培養(yǎng)基上正常生根(圖6～8)。將抗性植株移入溫室大棚，以備檢測(cè)。

圖7 誘導(dǎo)愈傷組織分化芽Fig.7 Inducing callus different sprout

圖8 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化株生根Fig.8 Inducing transformations rooting

2.5 柱花草抗性轉(zhuǎn)化植株分子檢測(cè)

2.5.1 特異引物PCR檢測(cè) 對(duì)抗性所篩選得到能夠正常生根的36株抗性植株進(jìn)行特異引物PCR分析，其中20株抗性植株(轉(zhuǎn)pBI-xsB抗性植株7株，轉(zhuǎn)pBI-xsT抗性植株6，轉(zhuǎn)pBI-xsBT抗性植株4株，轉(zhuǎn)pBI-xsBTT抗性植株3株)能擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照相同大小的條帶(圖9)。

Lane M: DL 2000 DNA markers; Lane 1: The positive control(the pBI-xsB plasmid); Lane 2,14,28 and 38: The negative control(non-transgenic Stylosanthes spp.); Lane 3-12: Independent transgenic plants; Lane 13: The positive control(the pBI-xsT plasmid); Lane 15-26: Independent transgenic plants; Lane 27:The positive control(the pBI-xsBT plasmid); Lane 29 and37: Independent transgenic plants; Lane 39: The positive control(the pBI-xsBT plasmid); Lane 40-44: Independent transgenic plants圖9 特異引物PCR分別鑒定轉(zhuǎn)pBI-xsB、pBI-xsT、pBI-xsBT和pBI-xsBTT的柱花草轉(zhuǎn)化株Fig.9 PCR assay of Stylosanthes spp. Transformants

Lane M:DL 2000 DNA markers; Lane 1: The positive control(the pBI-xsB plasmid); Lane 2, 11,19 and 25: The negative control(non-transgenic Stylosanthes spp.); Lane 3-9:Independent transgenic plants Lane 10: The positive control(the pBI-xsT plasmid); Lane 12-17: Independent transgenic plants; Lane 18: The positive control(the pBI-xsBT plasmid); Lane 20-23:Independent transgenic plants; Lane 24:The positive control(the pBI-xsBTT plasmid); Lane 26-28:Independent transgenic plants圖10 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)引物PCR分別鑒定轉(zhuǎn)pBI-xsB、轉(zhuǎn)pBI-xsT、pBI-xsBT、pBI-xsBTT的柱花草轉(zhuǎn)化株Fig.10 PCR assay of Stylosanthes spp. Transformants

2.5.2 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)引物PCR擴(kuò)增 利用轉(zhuǎn)基因檢測(cè)引物，對(duì)2.5.1試驗(yàn)中檢測(cè)為陽(yáng)性20抗性株的DNA進(jìn)行PCR分析，結(jié)果有16株(轉(zhuǎn)pBI-xsB抗性植株6株，轉(zhuǎn)pBI-xsT抗性植株5株，轉(zhuǎn)pBI-xsBT抗性植株3株，轉(zhuǎn)pBI-xsBTT抗性植株2株)能擴(kuò)增出目的帶(圖10)。

2.5.3 RT-PCR檢測(cè) 對(duì)檢測(cè)均為陽(yáng)性的16株植株提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析，經(jīng)1%凝膠電泳后，16株中的11株(轉(zhuǎn)pBI-xsB抗性植株4株，轉(zhuǎn)pBI-xsT抗性植株3株，轉(zhuǎn)pBI-xsBT抗性植株3株，轉(zhuǎn)pBI-xsBTT抗性植株1株)擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶如圖11。RT-PCR分析表明在35S啟動(dòng)子控制下的11株轉(zhuǎn)化株中，目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。

3 討 論

在誘導(dǎo)柱花草子葉外植體出愈傷和分化芽的抗性培養(yǎng)基M3(Kan 50 mg/L、Carb 400 mg/L)中經(jīng)過(guò)30～45 d可誘導(dǎo)愈傷分化及芽的形成，切下單芽在生根培養(yǎng)基M4(50 mg/L Kan)上經(jīng)25～35 d可以誘導(dǎo)生根。生根配方與文獻(xiàn)[16，18]報(bào)道生根培養(yǎng)基有差異，但不影響植株正常生根。實(shí)驗(yàn)中獲得36株經(jīng)卡那霉素篩選抗性植株，再通過(guò)特異引物和轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)引物2次PCR檢測(cè)，有效降低了轉(zhuǎn)化株的假陽(yáng)性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供更真實(shí)的植物材料。RT-PCR分析結(jié)果表明，11株轉(zhuǎn)化株的目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上獲得了表達(dá)，5株出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默，可能是啟動(dòng)子DNA序列發(fā)生甲基化，或?qū)氲幕虬l(fā)生異染色質(zhì)化以及位置效應(yīng)引起。

Lane M: DL 2000 DNA markers; Lane 1: The positive control(the pBI-xsB plasmid); Lane 2, 10,17and 22: The negative control(non-transgenic Stylosanthes spp.); Lane 3-8: Independent transgenic plants; Lane 9: The positive control(the pBI-xsT plasmid); Lane 11-15: Independent transgenic plants; Lane 16:The positive control(the pBI-xBT plasmid); Lane 18-20: Independent transgenic plants; Lane 21: The positive control(the pBI-xBTT plasmid); Lane 23-24:Independent transgenic plants圖11 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)pBI-xsB、pBI-xsT、pBI-xsBT和pBI-xsBTT的柱花草轉(zhuǎn)化株Fig.11 RT-PCR assay of Stylosanthes spp. Transformants

4 小 結(jié)

本研究初步獲得了4種轉(zhuǎn)FMDV多抗原表位融合基因的柱花草，為進(jìn)一步揭示同型與異型FMDV之間多表位基因及其不同融合方式的免疫效果和研制口蹄疫可飼植物疫苗奠定了研究的基礎(chǔ)。