李海龍，段立華，方淑梅，李建英，孟文凱，梁喜龍*

(1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163316)

【研究意義】雜豆作為一類(lèi)重要的糧食作物，在我國(guó)東北地區(qū)種植廣泛，紅小豆和蕓豆是其中重要的兩種，具有極高的食用及藥用價(jià)值[1]。但是由于植物不具有自主逃避不利環(huán)境的能力，因此在其生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭受各種非生物逆境，如干旱、低溫和鹽堿脅迫等[2]，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及產(chǎn)量品質(zhì)的提高。因此，開(kāi)展有關(guān)雜豆抗逆機(jī)制的研究現(xiàn)已成為眾多科研工作者的研究課題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】脫落酸(abscisic acid，ABA)是植物體內(nèi)一種重要的應(yīng)激性激素，可參與多種生理調(diào)節(jié)過(guò)程，如種子休眠、氣孔關(guān)閉及各種非生物脅迫的適應(yīng)性應(yīng)答[3-5]。ABA發(fā)揮生物功能主要通過(guò)改變ABA調(diào)節(jié)基因(ABA-regulated genes)的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[6-8]。有研究表明多數(shù)ABA調(diào)節(jié)基因都含有一個(gè)保守的順式作用元件ABRE(ABA-responsive element，序列為PyACGTGGC)，其可參與ABA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[9,10]。AREB1(ABA responsive element binding protein 1)是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，其具有堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)，可以與ABRE元件結(jié)合，從而激活A(yù)BA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。ABA活化AREB1轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)傳導(dǎo)途徑可簡(jiǎn)略表達(dá)為PYR1→PP2C→SnRK2→AREB1[11-12]。在此過(guò)程中，ABA與PYRl結(jié)合，破壞了PP2C與蛋白激酶SnRK2之間的相互作用，使SnRK2的活性受到激發(fā)，從而活化AREBl轉(zhuǎn)錄因子[13-14]?；罨腁REB1轉(zhuǎn)錄因子一方面與ABRE應(yīng)答元件結(jié)合，從而引起下游依賴(lài)基因的表達(dá)[15]；另一方面AREB1轉(zhuǎn)錄因子與其它脅迫轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行信息交流，共同調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而提高植物體對(duì)逆境的反應(yīng)[16]。【本研究切入點(diǎn)】雖然迄今AREB1基因的研究已在較多作物中開(kāi)展，但在雜豆類(lèi)作物中仍鮮見(jiàn)報(bào)道。特別是它如何控制紅小豆和蕓豆抵抗非生物逆境脅迫還不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以雜豆中的紅小豆與蕓豆為試驗(yàn)材料，應(yīng)用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)等手段對(duì)AREB1基因的性質(zhì)及功能進(jìn)行了初步分析，以期為進(jìn)一步揭示該基因功能及其在雜豆抗逆中的作用，進(jìn)而為最終建立雜豆高效穩(wěn)定的抗逆體系奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蛋白質(zhì)序列的獲取與確定

通過(guò)擬南芥據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)獲取AREB1基因序列及相關(guān)信息[17]。再利用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中所獲取的AREB1基因的蛋白質(zhì)序列(序列也可以用flast格式)與NCBI網(wǎng)站中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，生物類(lèi)型分別選用蕓豆、紅小豆等，輸入其拉丁文學(xué)名，從而進(jìn)行下一步的相似度鑒定，這時(shí)會(huì)得出多組基因的各類(lèi)信息，再根據(jù)所獲信息確定同源蛋白數(shù)目。

1.2 進(jìn)化關(guān)系分析

將所獲取的AREB1蛋白質(zhì)序列分別與其它植物、藻類(lèi)和菌類(lèi)等物種進(jìn)行比對(duì)，從而獲得相應(yīng)的同源蛋白。再通過(guò)MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，同時(shí)對(duì)它進(jìn)行校正。校正過(guò)程需要Neighbor-Joining在線軟件[18]，最后完成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與分析。

1.3 理化性質(zhì)分析

利用在線預(yù)測(cè)軟件(http://www.expasy.org/tools/)等對(duì)AREB1蛋白質(zhì)序列的等電點(diǎn)、分子量、穩(wěn)定性、親水性、脂肪族氨基酸指數(shù)以及消光系數(shù)等理化特性進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。

1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

通過(guò)在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AREB1基因的確定與獲取

首先利用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)，找出已經(jīng)確定的AREB1基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)序列，再通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定最終的蛋白質(zhì)序列。本研究共獲取以下8個(gè)相應(yīng)蛋白質(zhì)信息，紅小豆為3個(gè)同源蛋白，蕓豆為5個(gè)同源蛋白(表1)。8個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目均在401～415個(gè)，各蛋白質(zhì)之間的E值、序列覆蓋率、同源性均相差不大。

2.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

利用AREB1的氨基酸序列在NCBI和Phytozome中找到21個(gè)同源序列(表2)，通過(guò)MEGA 5.0軟件構(gòu)建包括紅小豆與蕓豆在內(nèi)的多種生物AREB1氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。紅小豆和蕓豆的8種同源蛋白聚類(lèi)在同一大分支內(nèi)，分布于三處。其中，紅小豆同源蛋白XP_017436679.1與綠豆XP_014501605.1聚在同一分支上，蕓豆同源蛋白AGV54705.1與AAK39132.1聚在同一分支，這兩分支聚在一起后又與大豆XP 003523938共在一個(gè)分支上，表明這幾種蛋白之間親緣關(guān)系較近；紅小豆同源蛋白XP_017434239.1與KOM52069.1聚在同一分支，蕓豆同源蛋白XP_007156509.1與XP_007156508.1聚在同一分支，這兩分支又聚在同一大分支上，表明他們之間具有較近的親緣關(guān)系。這些結(jié)果也證明這幾種蛋白可能經(jīng)歷了相同或相似的進(jìn)化途徑。而蕓豆中XP_007136688.1與其他7種蛋白均不在同一分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與金魚(yú)藻的親緣關(guān)系較近。推測(cè)XP_007136688.1蛋白可能是在適應(yīng)外界環(huán)境條件時(shí)經(jīng)歷了不同的適應(yīng)性進(jìn)化[19]。

表1 紅小豆和蕓豆AREB1基因的相應(yīng)信息

表2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建所需物種的信息

圖1 AREB1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of AREB1

2.3 理化性質(zhì)分析

通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件(http://www.expasy.org/tools/)對(duì)蛋白質(zhì)各類(lèi)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)(表3)。8種蛋白質(zhì)序列均為不穩(wěn)定的親水性蛋白。其中，蕓豆蛋白XP_007136688.1各種性質(zhì)明顯不同于其它幾種。分子量最小，等電點(diǎn)最低，僅為6.12，且其消光系數(shù)明顯高于其它幾種，表明該蛋白可能在空間結(jié)果及功能上存在特異性。除XP_007136688.1以外，其他7種蛋白質(zhì)均為堿性蛋白，分子量、等電點(diǎn)、消光系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)等理化性質(zhì)差異均較小。

表3 紅小豆與蕓豆AREB1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

表4 AREB1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)所占百分比

2.4 紅小豆與蕓豆AREB1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)其功能和活性均有重要影響，因此蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究對(duì)其功能的探討有著重要的指導(dǎo)性作用。使用在線軟件對(duì)8種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(表4)，結(jié)果表明：8種蛋白質(zhì)均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)、而β-折疊結(jié)構(gòu)僅約為α-螺旋的三分之一，其含有大量的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)可能與它連接較多的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件有關(guān)。

3 討 論

植物體內(nèi)的AREB1基因?qū)τ谡{(diào)控基因表達(dá)，抵抗非生物逆境脅迫具有非常重要的意義[20]。前人通過(guò)對(duì)擬南芥體內(nèi)AREB/ABF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子亞家族的研究找尋到突破口，在其他作物上展開(kāi)研究。就目前而言，花生[21]、小麥[22]、大麥[23]、番茄[24]、大豆[25]、水稻[26]等多種植物中的AREB1基因均得到了鑒定與研究。然而對(duì)于雜豆類(lèi)AREB1基因的研究卻所知甚少。本研究利用構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和同源比對(duì)分析的方法初步確定了紅小豆AREB1三個(gè)同源蛋白分別是XP_017436679.1、XP_017434239.1、KOM52069.1以及蕓豆AREB1的五個(gè)同源蛋白各為AGV54705.1、XP_007136688.1、AAK39132.1、XP_007156509.1、XP_007156508.1，對(duì)于蕓豆AREB1基因蛋白序列的研究方面發(fā)現(xiàn)，其5種同源蛋白當(dāng)中XP_007136688.1的理化性質(zhì)與其他7種蛋白序列上均存在較大差異，且其同源性較低，這也說(shuō)明XP_007136688.1在功能或者其他方面與其他7種蛋白序列具有不同特性。

前人研究表明，在擬南芥中AREB/ABF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子亞家族含有ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2四類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子[11]。ABF1主要參與低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)，ABF2/AREB1、ABF4/AREB2主要在干旱、ABA、氧化、高鹽及熱脅迫下發(fā)揮作用，ABF3主要受氧化、高鹽、ABA、低溫及熱脅迫誘導(dǎo)。通過(guò)前人在AREB1基因表達(dá)領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AhAREB1擬南芥幼苗的根尖和成苗的葉片邊緣生長(zhǎng)素含量顯著提高，生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍谆騆AX3和生長(zhǎng)素響應(yīng)基因IAA29的表達(dá)均顯著下降，而生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白基因ARF9和ARF2顯著上調(diào)，有效的提高了擬南芥生長(zhǎng)素含量，增強(qiáng)其抗旱能力[27,28]；在干旱、鹽堿、茉莉酸甲酯、SA和ABA等脅迫下，毛果楊中AREB1基因的啟動(dòng)子序列可以驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖和葉中表達(dá)，這也說(shuō)明毛果楊A(yù)REB1基因可能與鹽堿、干旱等脅迫應(yīng)答緊密相關(guān)[29,30]；對(duì)于煙草AREB1基因的表達(dá)量而言，根系的表達(dá)量最大，莖、葉、花次之，同時(shí)煙草AREB1基因表達(dá)更易受到各種非生物脅迫因素的影響，PEG、干旱、鹽堿、低溫、ABA誘導(dǎo)煙草AREB1上調(diào)表達(dá)，而茉莉酸甲酯誘導(dǎo)煙草AREB1下調(diào)表達(dá)[31,32]；在花生方面，不同品種花生在干旱條件下AREB1表達(dá)量都有所增加，同時(shí)抗旱品種的表達(dá)量顯著高于一般品種，表明花生AREB1基因在干旱脅迫下發(fā)揮重要作用[20,32]。雖然AREB1基因在多種作物上均已深入研究，若要確切的確定AREB1基因在紅小豆與蕓豆上參與的非生物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)類(lèi)型，還需通過(guò)正反遺傳學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行更深層次的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究表明：AREB1基因蛋白序列在紅小豆及蕓豆上的8個(gè)同源蛋白均為不穩(wěn)定的親水性蛋白，除蕓豆蛋白XP_007136688.1外其他7種均為堿性蛋白，在分子量、等電點(diǎn)、消光系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)等理化性質(zhì)方面差異較小，同時(shí)8種同源蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)則卷曲四種結(jié)構(gòu)所構(gòu)成，各類(lèi)型在8種同源蛋白中所占比例均相近，這種相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能決定了他們?cè)诘鞍踪|(zhì)功能與調(diào)控途徑方面的相似性。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)菜豆屬四種植物的蛋白序列均在一個(gè)大分支上，同源性較高，而雜豆類(lèi)作物大多屬于菜豆屬，這也證明AREB1基因于菜豆屬上均存在。