（長春職業(yè)技術學院，吉林長春130033）

啤酒作為一種低酒精度的飲品，因其具有良好的風味、豐富營養(yǎng)及良好的口感而深受消費者喜愛。但是，啤酒存在著飲后出現(xiàn)頭痛、頭暈的現(xiàn)象，造成該現(xiàn)象的主要原因是由于啤酒中高級醇所導致[1－2]。啤酒中高級醇主要包含正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等[3]，它由原料中糖代謝通過丙酮酸的合成以及發(fā)酵過程中氨基酸降解代謝而形成[4－5]。高級醇是啤酒重要風味成分之一，適量的高級醇能促進酒類具有豐滿的香味和口味，并增加酒的協(xié)調(diào)性。若啤酒中不含或少含高級醇，會使酒味淡薄，酒體不豐滿。然而高級醇過量存在不單是酒主要異雜味的來源之一[6－9]，而且也會對人體產(chǎn)生危害，常常會使人產(chǎn)生頭痛、惡心、嘔吐等，對人體的眼、鼻也有刺激作用，其毒性隨著分子量的增大而增加[10－13]。鑒于高級醇在啤酒中的重要性質(zhì)，測定啤酒中高級醇的組成和含量，對提高啤酒的質(zhì)量和風味有很重要的意義。

目前，國外對啤酒中高級醇含量的檢測技術已經(jīng)比較成熟[14－16]，隨著消費者要求的提高，我國一些啤酒生產(chǎn)企業(yè)和研究部門開始注意啤酒中各組分的變化，對高級醇在啤酒中的作用有了初步的認識，認為啤酒中高級醇的適宜范圍在 50 μg/mL～100 μg/mL[17－19]，過低影響口感與風味，過高易引起頭暈。目前測定高級醇含量的方法有頂空進樣－氣質(zhì)聯(lián)用[20－21]、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用[22－23]等，但由于設備昂貴，測樣成本高，實驗室儀器設備條件的限制，不能用來進行大批量檢測。分光光度法也可測定啤酒中各種醇的含量，但是測定時間長、準確度不夠、可能產(chǎn)生系統(tǒng)誤差和選擇性不高[24－25]。本試驗擬采用頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用 （headspacesolid phase microextraction－gas chromatography，HS－SPME/GC）分析技術，采用實驗室一般都有的氣相色譜儀，并通過頂空固相微萃取的條件優(yōu)化，嘗試建立一種快速、準確、重復性好的檢測啤酒中5種高級醇的方法，為其方法的可推廣性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正丙醇（99.9%）、正丁醇（99.9%）、異丁醇（99.9%）、正戊醇（99.9%）、異戊醇（99.9%）標準品：美國Sigma公司。

6820氣相色譜儀：美國Agilent公司，配有氫火焰離子化檢測器；Oasis固相萃取頭：美國Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜條件

進樣口溫度250℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，保持3 min，然后以10℃/min升至240℃，保持5 min，最后以15℃/min升至270℃，保持10 min；進樣方式：分流比10∶1；載氣：高純氮氣；空氣：400 mL/min；氫氣：30 mL/min；流速為0.8 mL/min。

1.2.2 萃取條件的優(yōu)化

將萃取頭插入氣相色譜（gas chromatography，GC）進樣口中，于250℃老化2h。稱取2mL樣品超聲5 min趕去啤酒中的氣泡后，置于10 mL頂空進樣瓶瓶中，插入萃取頭，于不同的萃取溫度下頂空萃取一段時間，于250℃解析5.0 min。分別比較不同的萃取頭、萃取溫度以及萃取時間對樣品中高級醇成分萃取效果的影響。

1.3 樣品分析

將啤酒樣品按氣相色譜條件進行測定。采用保留時間及標準添加法定性，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

本試驗比較了 HP－5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、TG－35MS（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）這3款不同的色譜柱。結果發(fā)現(xiàn)TG－WAXMS色譜柱進行5種高級醇的分析色譜圖效果較好，能夠很好的分離各高級醇，并且具有良好的靈敏度，能夠滿足檢測的需要。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別設置不同的柱初始溫度（40、50、60、70℃）、分流比（5∶1、10∶1、20∶1、40∶1）以及載氣流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min），考察其對被測5種組分分離度的影響，結果見圖1。

圖1 5種高級醇標準品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5 kinds of higher alcohol standard products

結果表明：當柱初始溫度為60℃，分流比為10∶1，載氣流速為0.8 mL/min時，5種高級醇的分離效果較好，具有較高的準確度。

2.3 固相微萃取頭的選擇

由于不同材質(zhì)的固相微萃取頭對啤酒中高級醇的萃取效果不同，因此不同類型的固相微萃取頭的選擇會影響到目標物的萃取效果。本試驗選擇并比較了4種較常見的固相微萃取頭的萃取效果：85 μm聚丙烯酸酯 （polyacrylate，PA）、100 μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsil－oxane，PDMS）、65 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）/二乙烯苯（divinylbenzene，DVB）以及 50/30 μm 二乙烯苯（DVB）/聚乙二醇（Carbowax）/聚二甲基硅氧烷（PDMS），萃取效果的比較見圖2。

圖2 4種萃取頭的萃取效果比較Fig.2 Extraction efficiencies of four solid phase microextraction fibers

由圖2可知，不同類型的固相微萃取頭對啤酒樣品中5種高級醇萃取效果有很大影響。萃取頭的萃取效果主要受萃取頭涂層極性與表面積的影響。非極性涂層可有效萃取非極性化合物，極性涂層可有效萃取極性化合物。PA、PDMS對非極性化合物萃取效果較好，而Carbowax和DVB更適用于偏極性化合物的萃取。所以本實驗選擇的4種萃取頭中，100 μm PDMS偏非極性的固相微萃取頭對5種高級醇的萃取效果更 好，其次是 85 μm PA、50/30 μm DVB/Carbowax/PDMS 和 65 μm PDMS/DVB。因此選取 100 μm PDMS萃取頭作為此次啤酒中高級醇萃取試驗的萃取頭。

2.4 萃取溫度的選擇

溫度對固相微萃取頭的萃取效果有雙重影響，溫度升高時，有利于高級醇的擴散，縮短了萃取的時間，但是溫度的升高也會使目標物在萃取頭的涂層中分配系數(shù)降低，導致吸附量減小，影響萃取頭的靈敏度。在萃取時間為60 min時，分別比較了100 μm PDMS萃取頭在40、50、60、70℃下對上述5種高級醇的萃取效果，結果見圖3。

圖3 萃取溫度對高級醇組分吸附的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the adsorption of higher alcohol components

結果如圖3所示，50℃條件下的萃取頭對高級醇的吸附量最大，說明在此溫度下的萃取效果最佳。萃取溫度在40℃時，較低溫度會導致目標物揮發(fā)的速度較慢或不完全揮發(fā)；而溫度至60℃以上時，萃取頭對高級醇的吸附量均有不同程度的減小，可能是由于目標物隨著溫度升高在萃取頭涂層中吸附量下降所致。綜合考慮，實驗選擇將50℃作為試驗固相微萃取頭的萃取溫度。

2.5 萃取時間的選擇

比較分析不同萃取的時間對5種高級醇萃取效果的影響，結果見圖4。

圖4 萃取時間對高級醇組分吸附的影響Fig.4 Effect of extraction time on the adsorption of higher alcohol components

結果如圖4，隨著萃取時間的增加，萃取頭對高級醇的吸附量明顯增加；當萃取時間超過40 min后，萃取頭對高級醇的吸附量均有不同程度下。因此，選擇40 min作為試驗固相微萃取頭的萃取時間。

2.6 啤酒中5種高級醇的定量分析

試驗配制了濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL 的系列5種高級醇的混合標準溶液上機進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)這5種高級醇的線性關系都符合標準，詳細結果見表1。

表1 5種高級醇的出峰時間、方程曲線、關聯(lián)系數(shù)、檢出限、定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 5 kinds of higher alcohol

試驗結果表明，5種高級醇在0.1 mg/mL～5.0 mg/mL內(nèi)均具有良好的線性關系（r2＞0.999），并得到5種目標組分的檢出限0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，相對標準偏差范圍為2.69%～4.22%。

2.7 加標回收與相對偏差試驗

分別添加0.2、1.0、2.0 mg/mL等3個梯度濃度的高級醇混合溶液到啤酒樣品中，測定結果見表2。

表2 回收率及方法的相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method

由表2可見，5種組分的3個水平的加標回收率為89.6%～95.9%，相對標準偏差（RSD）為2.4%～5.3%，表明本試驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要的靈敏度、精密度和準確度，可以用于啤酒樣品中高級醇的分析檢測。

2.8 樣品中目標物的測定

按照上面確定的測定方法，對5種市售啤酒進行氣相色譜分析外標法定量，結果見表3。

表3 啤酒樣品測定結果Table 3 Determination of beers

從表3可以看出，5種啤酒成品高級醇含量均未超過其風味閾值，各組分含量適中，賦予了啤酒芳香的口味和酒體的醇厚感，圖5為其中一款樣品分析高級醇的氣相色譜圖。

圖5 啤酒樣品中高級醇的色譜圖Fig.5 Chromatograms of higher alcohols in beer samples

3 結論

本文建立了HS－SPME/GC分析啤酒中5種高級醇的方法。針對樣品中5種組分的極性性質(zhì)，實驗選擇100 μm PDMS固相微萃取頭，50℃頂空萃取40 min。5種高級醇的分離采用TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱，在 0.1 mg/mL～5.0 mg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關系（r2＞0.999），5種目標組分的檢出限范圍為0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，加標回收率范圍為89.6%～95.9%，相對標準偏差（RSD）為2.0%～4.3%。通過GC對4種啤酒樣品中的高級醇含量檢測，發(fā)現(xiàn)均未超過其風味閾值，各組分含量適中，賦予了啤酒芳香的口味和酒體的醇厚感。本試驗建立的方法，可對啤酒中高級醇進行分析和測定，有助于提高檢測實驗室的分析此類樣品的效率，在實驗室的推廣可行性較高，旨在為啤酒行業(yè)的質(zhì)量改進提供試驗依據(jù)。