（衡水學(xué)院 生命科學(xué)系，河北衡水053000）

核桃分心木簡稱分心木又名核桃隔膜，為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans L.）植物核桃的帶骨質(zhì)內(nèi)果皮的種隔[1-2]。半圓形片狀，表面呈棕色或淺棕色，略帶光澤，具有補(bǔ)腎澀精、治療多汗、尿頻、遺尿、口腔潰瘍、牙齦出血等多重功效[2]。相關(guān)研究表明[3-7]，核桃分心木中含有多糖、黃酮、生物堿、有機(jī)酸、甾類等多種化學(xué)成分，其中黃酮類物質(zhì)含量較高。黃酮類物質(zhì)有很多藥理作用，如：抗氧化、抗腫瘤活性、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗心腦血管病等功效[8-11]，在食品、保健品、醫(yī)藥等方面應(yīng)用十分普遍。

分心木數(shù)量廣泛，且安全無毒。以前經(jīng)常被人們當(dāng)做垃圾丟棄，或當(dāng)作燃料使用，這既浪費(fèi)了資源，也污染了環(huán)境。為開發(fā)分心木資源，本試驗(yàn)采用超聲-微波協(xié)同提取法對(duì)核桃分心木中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取。超聲波能通過機(jī)械效應(yīng)引起組織細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，并有利于物質(zhì)穿透細(xì)胞膜釋放出來；同時(shí)超聲波的熱效應(yīng)也能夠減少提取時(shí)間。微波輻射可以使物質(zhì)的極性分子急速振動(dòng)，進(jìn)而由內(nèi)而外充分產(chǎn)生熱量[12-13]。超聲微波協(xié)同提取操作簡單、速度快、提取物結(jié)構(gòu)未被破壞、提取率高，有著突出的優(yōu)勢(shì)。本研究通過對(duì)分心木中的黃酮成分進(jìn)行提取并研究其體外抗氧化活性[14-15]，從而為探索分心木黃酮藥物及功能性食品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，并為分心木的綜合利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

核桃分心木：河北養(yǎng)元智匯飲品股份有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：國家生物制品檢定所；乙醇、Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、VC、石油醚、乙酸乙酯、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH、Tris-HCL、鄰苯三酚、HCl、鄰二氮菲、PBS、FeSO4、H2O2均為分析純?cè)噭汉馑鹭S化玻儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-300A型微波超聲波組合合成/萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JA5003N電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；F123602微量可調(diào)單道移液器：上海艾研生物科技有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KDC-12離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分心木黃酮提取工藝流程

分心木→清洗→烘干→粉碎→過篩→超聲-微波協(xié)同提取→過濾→濾液濃縮→純化（石油醚洗滌，乙酸乙酯萃?。鷥龈伞中哪军S酮

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用30%的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶，搖勻后作為標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于7個(gè)10 mL容量瓶中，按1.3.3的方法在510 nm測(cè)定黃酮的吸光度。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 黃酮含量的測(cè)定方法

采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法，樣品溶液加入質(zhì)量濃度5%NaNO20.3 mL，混勻靜置6 min，加入質(zhì)量濃度10%Al（NO3）30.3 mL，靜置6 min，加入質(zhì)量濃度4%NaOH溶液4 mL，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容，靜置15 min后，在510 nm測(cè)定黃酮的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮含量。

1.3.4 分心木黃酮提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

1）乙醇濃度對(duì)分心木黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00g分心木樣品，分別加體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%、70%的乙醇25 mL，設(shè)置超聲功率250 W、微波功率250 W、溫度60℃進(jìn)行提取10 min。

2）料液比對(duì)分心木黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00g分心木樣品，依次按照料液比1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）的順序加入 50%乙醇后，設(shè)置超聲功率250 W、微波功率250 W、溫度60℃進(jìn)行提取10 min。

3）超聲功率對(duì)分心木黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，依次設(shè)置超聲功率為150、200、250、300、350 W，微波功率250 W、溫度60℃進(jìn)行提取10 min。

4）微波功率對(duì)分心木黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超聲功率250W，依次設(shè)置微波功率為 50、100、150、200、250 W，60 ℃下進(jìn)行提取10 min。

5）提取溫度對(duì)分心木黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超聲功率250 W，微波功率為150 W，分別在 40、45、50、55、60 ℃提取 10 min。

6）提取時(shí)間對(duì)分心木黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00 g分心木樣品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超聲功率250 W，微波功率為150 W，溫度 50 ℃條件下分別提取 6、8、10、12、14 min。

1.3.4.2 黃酮得率的計(jì)算方法

式中：C為提取液中分心木黃酮的含量，g/mL；V為提取液體積，mL；M為分心木質(zhì)量，g。

1.3.4.3 響應(yīng)面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，從單因素試驗(yàn)中選取對(duì)提取結(jié)果影響比較大的4個(gè)因素：料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，黃酮得率為響應(yīng)值，共計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行組合試驗(yàn)[16-20]。因素與水平見表1。

表1 因素與水平表Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.5 分心木黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.5.1 分心木黃酮對(duì)·OH的清除作用

試管中加入1 mL0.75 mol/L鄰二氮菲，2 mL pH=7.45 PBS溶液、1 mL 蒸餾水、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 0.01%H2O2，充分混勻后于37℃下恒溫水浴1 h。536 nm處測(cè)定其吸光度Ap；用1 mL水代替H2O2，測(cè)定其吸光度Ab；用1 mL樣液代替1 mL水，測(cè)定其吸光度As[21]。以VC作對(duì)照。

1.3.5.2 分心木黃酮對(duì)DPPH·的清除作用

不同濃度的黃酮樣液與DPPH溶液等體積混合，30 min后用無水乙醇作參比，在517 nm處測(cè)定其吸光度A1，測(cè)定不同濃度的樣液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A2；DPPH溶液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A0，取3次平行試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)下列公式計(jì)算對(duì)DPPH·的清除率[21－22]。以 VC作對(duì)照。

1.3.5.3 分心木黃酮對(duì)O2－·的清除作用

取 5 mL 0.05 mol/L，pH=8.2的 Tris－HCL 緩沖液25℃水浴預(yù)熱20 min，分別加入1 mL樣液，0.5 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，混勻后25℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即加入2滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)。299 nm處測(cè)定吸光度A1，空白對(duì)照組的吸光度A0。將鄰苯三酚溶液用0.5 mL蒸餾水代替，得到吸光度A2。取3次平行試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。以VC作對(duì)照[23]。

1.3.5.4 總還原力的測(cè)定

1.0 mL樣液加入2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL的0.22 mol/L磷酸鹽緩沖液，混合均勻后于50℃水浴中反應(yīng)30 min，迅速冷卻加入10%三氯乙酸2.5 mL，在4 000 r/min下離心10 min。最后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min測(cè)定700 nm處的吸光度值[24]。以VC作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立

按檢測(cè)方法，測(cè)出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各濃度下的吸光度值，作出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，得到其回歸方程：A=10.682C－0.0011，R2=0.999 9，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.005 mg/mL～0.05 mg/mL的范圍中，呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度的確定

乙醇濃度對(duì)分心木黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on yield of flavonoid

由圖2可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮的溶解度也隨之增加。在乙醇濃度50%的條件下，所提取的分心木中黃酮得率達(dá)到4.94%。乙醇濃度超過50%之后，黃酮得率下降。黃酮一般難溶或不溶于水，易溶于乙醇等有機(jī)溶劑。所以一開始隨乙醇濃度增大得率增高。但乙醇濃度過高時(shí)，樣品溶液沸點(diǎn)降低，且醇溶性雜質(zhì)開始溶出，導(dǎo)致黃酮得率下降。由此可知，50%乙醇對(duì)黃酮的溶解性相對(duì)最好。

2.2.2 料液比的確定

料液比對(duì)分心木黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，隨料液比的增多，黃酮的溶解度也隨之增加，即黃酮物質(zhì)的得率增加。在料液比1∶25（g/mL）處，所提取的分心木中黃酮得率達(dá)4.98%。繼續(xù)增大料液比后，黃酮物質(zhì)得率增加不明顯。且繼續(xù)增大溶劑量既浪費(fèi)溶劑又不易回收，所以料液比1∶25（g/mL）為宜。

圖3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different rate of solid to solution on yield of flavonoid

2.2.3 超聲功率的確定

超聲功率對(duì)分心木黃酮得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power to solution on yield of flavonoid

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，黃酮物質(zhì)的得率也相應(yīng)增加。在超聲波功率達(dá)到250 W時(shí)，所提取的分心木中黃酮得率為5.01%。繼續(xù)增大超聲功率，黃酮物質(zhì)提取率有輕微的降低。可能由于超聲波功率的增大導(dǎo)致了黃酮的結(jié)構(gòu)被破壞，所以超聲功率以250 W為宜。

2.2.4 微波功率的確定

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，微波在本試驗(yàn)中只起到快速升溫的作用，達(dá)到指定提取溫度后，微波功率會(huì)迅速下降至可維持預(yù)定溫度的功率，且數(shù)值非常小。提高微波功率有助于快速達(dá)到預(yù)定提取溫度，節(jié)省了時(shí)間；但是微波功率過高又會(huì)引起溫度升高過快導(dǎo)致超過預(yù)定溫度導(dǎo)致試驗(yàn)出現(xiàn)誤差。最終確定最佳微波功率為150 W，在該功率下即能夠保證快速升至提取溫度又能夠維持預(yù)定溫度。

2.2.5 提取溫度的確定

溫度對(duì)分心木黃酮得率的影響見圖5。

分心木中黃酮物質(zhì)的得率隨著溫度升高而增加，在50℃時(shí)，所提取的分心木中黃酮得率達(dá)5.09%。繼續(xù)升高提取溫度，黃酮物質(zhì)提取率逐漸減小?？赡苁且?yàn)闇囟冗^高會(huì)使黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)被破壞，也可能是由于溫度過高會(huì)溶出其它雜質(zhì)，使得黃酮物質(zhì)提取率降低。所以提取溫度以50℃為宜。

圖5 溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of different temperature on yield of flavonoid

2.2.6 提取時(shí)間的確定提取時(shí)間對(duì)分心木黃酮得率的影響見圖6。

圖6 時(shí)間對(duì)黃酮提取得率的影響Fig.6 Effect of different time on yield of flavonoid

由圖6可知，在6 min～8 min內(nèi)分心木中黃酮物質(zhì)的得率隨著時(shí)間的增加而增大，在8 min黃酮提取率達(dá)到最高值5.16%。時(shí)間繼續(xù)增加黃酮得率變化不大并有減少可能是因?yàn)闀r(shí)間太長，會(huì)使黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，也可能是由于長時(shí)間提取會(huì)使分心木粉末溶出其它雜質(zhì)，使得黃酮物質(zhì)提取率降低。所以為了保證黃酮物質(zhì)的提取率以及減小提取周期，以8 min為宜。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1設(shè)定的水平和因素，共設(shè)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)。得到各個(gè)試驗(yàn)條件的黃酮得率，試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and result

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Response surface experimental design and result

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The analysis of varianceof regression model

由軟件分析得到回歸方程為：Y=5.13+0.032A+0.069B+0.17C+0.11D-0.015AB+0.060AC-0.038AD-0.040BC+0.027BD-0.040CD-0.17A2-0.13B2-0.25C2-0.19D2，其中Y為核桃分心木黃酮含量的預(yù)測(cè)值。該模型的預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.917 1，矯正系數(shù)Adj R2=0.969 2，說明試驗(yàn)的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值擬合度比較好。

由表3可以看出，P<0.000 1，說明該模型極其顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。失擬項(xiàng)P=0.094 0>0.05，說明不顯著，即選擇的模型對(duì)該試驗(yàn)的擬合度良好。A、B、C、D 4個(gè)因素所模擬的一次項(xiàng)都小于0.05，說明因變量和所選自變量之間的線性關(guān)系顯著，該回歸方程能代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析試驗(yàn)結(jié)果。模擬的二次項(xiàng)P都小于0.01，表明A、B、C、D 4個(gè)因素對(duì)分心木黃酮的提取率都達(dá)到極其顯著的水平，交互項(xiàng)AC、BC、CD的P值小于0.05，達(dá)到顯著水平，由此可知，料液比與提取溫度、超聲功率與提取溫度、提取溫度與提取時(shí)間這些因素之間都存在一定的交互作用，并且它們之間的交互作用會(huì)對(duì)分心木中的黃酮的提取率產(chǎn)生顯著的影響。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件，將AC、BC、CD交互進(jìn)行分析比較，做出響應(yīng)面曲線圖，見圖7。

圖7 各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 The response surface of interaction between every two factors

由響應(yīng)面三維圖7可知，當(dāng)各因素在一定范圍內(nèi)增大時(shí)，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值也增大；但當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，各因素的值繼續(xù)增大時(shí)，其響應(yīng)值卻不斷減小。等高線圖的中心點(diǎn)在3D圖上的投影即最高點(diǎn)，表明該點(diǎn)的提取率最高。圖7中每個(gè)響應(yīng)曲面都開口向下，呈現(xiàn)凸面形狀。

2.3.3 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)以上響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒Y(jié)果分析，得出最佳提取條件下的分心木中黃酮的提取率為5.19%，料液比 1∶25.6（g/mL），超聲功率 261.8 W，提取溫度 51.6℃，提取時(shí)間8.5 min。在此最佳條件下，將平行驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，可得分心木黃酮的提取率的平均值5.17%。實(shí)際所測(cè)得的提取率的平均值和預(yù)測(cè)值減少0.016%，表明該模型的可靠性較高，并且提取工藝的重復(fù)性良好。

2.4 分心木中黃酮體外抗氧化活性

分心木中黃酮體外抗氧化活性見圖8。

圖8 分心木黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH·清除率Fig.8 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of Diaphragma juglandis fructus flavonoids

根據(jù)圖8能夠看出，分心木黃酮對(duì)·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，并且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對(duì)自由基的清除能力呈現(xiàn)量效關(guān)系。當(dāng)分心木黃酮濃度為2mg/mL時(shí)，對(duì)·OH和O2-·的最大清除率分別為66.2%、36.9%，而對(duì)DPPH·的清除率在濃度為0.07 mg/mL時(shí)即達(dá)到70.2%。在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，分心木黃酮和VC的還原力均隨著濃度的增大而增大，線性關(guān)系較好，其中2 mg/mL的分心木黃酮的還原能力與0.65 mg/mL的VC幾乎一致?？梢姺中哪军S酮體外抗氧化活性較好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化分心木黃酮的提取工藝條件，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究。最優(yōu)提取條件條件為：乙醇濃度50%，料液比1∶25.6（g/mL），超聲功率261.8 W，微波功率150 W，提取溫度51.6℃，提取時(shí)間8.5 min。分心木總黃酮得率為5.17%。分心木黃酮對(duì)·OH、O2-·、DPPH·均能夠起到清除作用，當(dāng)分心木黃酮濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH和O2-·的最大清除率分別為66.2%、36.9%，而對(duì)DPPH·的清除率在濃度為0.07 mg/mL時(shí)即達(dá)到70.2%，并且其還原能力強(qiáng)，能夠說明其體外抗氧化活性較強(qiáng)。

采用超聲微波協(xié)同提取法提取分心木中的黃酮類物質(zhì)產(chǎn)率高，方法簡單易行，提取率較好，產(chǎn)物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。