任曉梅，王小蘭，韓文龍，張雪梅,2，陳宗超，李 濤，丁 鏟，于圣青

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036）

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎為主要臨床特征的急性、敗血性、接觸性傳染病，部分慢性感染會伴隨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和生長障礙。RA可感染鵝、鴨、火雞、天鵝等[1,2]，在自然狀態(tài)下家鴨最易感。自1904年Riemer首次報道了此病，隨后世界各國相繼出現(xiàn)了本病的報道，我國自郭玉璞等[3]在北京郊區(qū)鴨場首次分離到血清1型RA，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)重大細菌性傳染病之一。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，我國RA感染呈現(xiàn)發(fā)病率和死亡率均上升的趨勢[4,5]。目前，鴨疫里默氏桿菌病的防治大多依靠藥物，而抗生素的濫用導致大量耐藥菌株的出現(xiàn)和動物體內(nèi)的藥物殘留，因此，疫苗免疫是控制本病發(fā)生與傳播最有效的手段。本研究旨在通過對廣東省、山東省和江蘇省地區(qū)疑似患鴨疫里默氏桿菌病的動物病料進行分離鑒定，測定其血清型和耐藥情況，為鴨疫里默氏桿菌病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實驗動物 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自BD公司，胎牛血清購自Gibco公司，2×Taq PCR Master Mix 購自北京康潤科技有限公司；DNA Marker （DL2000）購自TaKaRa公司；細菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司；1日齡健康非免疫櫻桃谷鴨和麻鴨，購自無錫某種鴨場，自由采食，籠養(yǎng)至18日齡用于細菌毒力測定。

1.2 細菌分離與培養(yǎng) 無菌條件下，取經(jīng)臨床觀察和病理剖檢可疑感染RA病鴨的心臟、肝臟和腦組織，分別接種于含2%胎牛血清胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌的生長情況和菌落特征。選取可疑單菌落經(jīng)TSA培養(yǎng)基進一步純化后，用TSB進行增菌培養(yǎng)。

1.3 生化鑒定 取TSA培養(yǎng)基上純化的單個菌落分別接種于微量生化發(fā)酵管，具體操作步驟參考生化反應管說明書進行，觀察和記錄結(jié)果。

1.4 PCR鑒定 按照本實驗室建立的RA三重PCR方法，對臨床分離株進行保守基因16S rRNA、ompA和groEL的擴增。根據(jù)生化試驗和三重PCR鑒定結(jié)果，將RA陽性分離株轉(zhuǎn)接于TSA平板培養(yǎng)至對數(shù)生長期后冷凍保存。

1.5 血清學鑒定 將各RA分離株菌液用滅菌PBS稀釋至5×109CFU/mL，取5 μL抗原分別與等體積的血清1型、2型、10型和15型RA單特異性血清進行玻片凝集試驗，觀察記錄結(jié)果。

1.6 藥物敏感性試驗 采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）對RA分離株進行藥物敏感性檢測，參照美國臨床實驗室標準化委員會NCCLS標準判斷結(jié)果。

1.7 動物回歸致病性試驗 選取鑒定后凍存的12株RA分離株分別接種于TSA平板并傳代培養(yǎng)，取第3代新鮮菌體經(jīng)無菌PBS洗滌2次后，稀釋菌液至含菌量為2.0×108CFU/mL，腿部肌肉注射18日齡的櫻桃谷鴨或麻鴨，0.5 mL/羽，每組3只，于攻毒后觀察動物發(fā)病、死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及血清型檢測 從臨床病料中共分離出46株RA，分離株在普通瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長，在TSA培養(yǎng)基上可生長圓形、微突起、表面光滑的奶油狀小菌落。革蘭氏染色鏡檢可見革蘭陰性短桿菌，多數(shù)呈單個狀態(tài)，少數(shù)成對或短鏈排列。生化試驗結(jié)果顯示：46株RA分離株均不發(fā)酵乳糖和半乳糖，部分菌株可發(fā)酵葡萄糖（26株）和蔗糖（9株）；甲基紅試驗、VP試驗、硫化氫產(chǎn)生、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽試驗均為陰性；31株分離株可液化明膠，32株分離株可分解尿素；46株RA分離株氧化酶、觸酶試驗均為陽性。采用三重PCR方法對46株RA分離株進一步鑒定，所有待檢菌株均可擴增出RA 16S rRNA、ompA和groEL基因片段，與預期大小一致。采用玻片凝集法對46株RA分離株進行血清學鑒定，其中，血清1型菌株9株，血清2型菌株25株，血清10型和15型菌株各1株，與標準血清1型、2型、10型和15型抗體均不發(fā)生凝集反應的分離株10株，暫定為未定血清型菌株，表明血清2型為RA新臨床分離株的優(yōu)勢血清型（表1）。

表1 RA臨床分離株的分離與鑒定Table 1 Isolation and identification of the RA isolates

2.2 分離株的藥敏試驗 結(jié)果顯示，RA臨床分離株呈現(xiàn)廣譜的耐藥性，普遍對林可霉素、多粘菌素、諾氟沙星耐藥，多數(shù)對新霉素（89.1%）、紅霉素（89.1%）、鏈霉素（89.1%）和氨芐西林（80.4%）耐藥，僅對氟苯尼考和頭孢唑肟有較強的敏感性，適合臨床使用。并且，RA分離株的耐藥情況呈現(xiàn)一定的區(qū)域性差異：青霉素類，河南省、廣東省、山東省地區(qū)的RA分離株普遍耐藥，而江蘇省地區(qū)的分離株則敏感；大觀霉素和多西環(huán)素，廣東省和江蘇省地區(qū)的RA分離株普遍敏感。

2.3 動物回歸試驗 RA分離株以1×108CFU/羽感染18日齡櫻桃谷鴨或麻鴨，感染的櫻桃谷鴨于24 h開始出現(xiàn)精神委頓，食欲廢絕，行動不便等癥狀；48 h后部分毒株感染鴨出現(xiàn)死亡；第96 h達到死亡高峰期。剖檢可見胸腔積液，心包增大變厚，出現(xiàn)明顯的纖維素樣滲出，與胸腔內(nèi)膜粘連；肝臟表面包裹著一層淡黃色的纖維素樣薄膜，邊緣鈍圓；脾臟出現(xiàn)大理石樣花紋（圖1A）。RA分離株感染麻鴨后，48 h開始出現(xiàn)臨床癥狀，72 h出現(xiàn)死亡。剖檢可見典型的纖維素性心包炎和脾腫大呈大理石樣（圖1B）。對照組櫻桃谷鴨和麻鴨食欲、精神狀態(tài)均正常。各組試驗鴨感染RA分離株均不同程度地發(fā)病，結(jié)果見表3。

表2 RA分離株對抗菌藥物的耐藥情況Table 2 Susceptibility of isolates to antibiotics

圖1 RA分離株感染櫻桃谷鴨（A）和麻鴨（B）病理剖解圖Fig.1 Clinical pathological features of cherry valley ducks(A) and sheldrake (B) infected with RA isolates

3 討論

本研究對廣東省、山東省、江蘇省地區(qū)的病死鴨分離到的可疑RA菌株進行了鑒定、血清型分型以及藥敏試驗、動物回歸試驗。研究結(jié)果表明，共鑒定到46株RA菌株，血清型分布主要集中在1型和2型，同時也包含其他血清型。本研究分離到的RA菌株能感染櫻桃谷鴨和麻鴨出現(xiàn)典型的臨床癥狀及病理變化，且櫻桃谷鴨感染后病理變化較麻鴨強，與送檢鴨臨床病理特征一致。

表3 RA分離株的動物回歸試驗結(jié)果Table 3 Determination of the bacterial virulence to ducklings

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，國際上已報道了21種血清型[6-8]。而我國關(guān)于鴨疫里默氏桿菌血清型的報道：1997年前僅發(fā)現(xiàn)血清1型RA；1997年后，蘇敬良等[9]、張大丙等[10]從北京不同鴨場分離到2、6、10、11、13、14型和其他未知血清型RA菌株。2002年程安春對分離到的1842株RA進行分型，發(fā)現(xiàn)1型、2型為優(yōu)勢血清型，同時還發(fā)現(xiàn)了3、4、5、8血清型分布；2007年張小峰等[11]對珠三角地區(qū)分離到的RA進行血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，血清1型為優(yōu)勢血清型。本研究結(jié)果顯示血清2型是山東省、廣東省、江蘇省地區(qū)鴨疫里默氏桿菌的優(yōu)勢血清型。由于RA各血清型間不存在交叉保護，臨床上選用對應血清型的疫苗是本病防控的關(guān)鍵。

目前，鴨疫里默氏桿菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴重，部分地區(qū)的鴨疫里默氏桿菌多重耐藥現(xiàn)象也越來越普遍。本研究對46株RA分離株的藥物敏感性進行分析發(fā)現(xiàn)，分離株對常見的抗菌素均有不同程度的耐藥。可能的原因是RA中存在天然耐藥基因，2007年蔡秀磊等[12]檢測了來自浙江的22株RA發(fā)現(xiàn)全部含有介導細菌耐藥的Ⅰ型整合子系統(tǒng)，可介導對氨基糖苷類、氯霉素耐藥基因，隨后Zheng等[13]也報道了在47株鴨疫里默氏桿菌中46株存在Ⅰ型整合子系統(tǒng)；更為重要的原因是抗生素的濫用，飼料中任意添加，出現(xiàn)疫病隨意加大劑量，使RA對原本敏感的抗生素逐漸變得耐藥，早期報道90%以上的鴨疫里默氏桿菌對紅霉素、青霉素、新霉素等高度敏感[14]，而本研究結(jié)果顯示RA對以前敏感的抗生素均出現(xiàn)了不同程度的耐藥，抗菌譜逐漸擴大?？茖W用藥，合理用藥才能避免耐藥的產(chǎn)生，為疫病防控打好基礎。