于可響，路 曉，劉存霞，高月花，亓麗紅，宋玲玲，李玉峰，宋敏訓(xùn)

（山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023）

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）主要引起雛鴨肝脾出血和壞死，臨床上稱之為“鴨新肝病”、“鴨白點(diǎn)病”、“鴨出血性壞死性肝炎”、“鴨脾壞死病”等。之所以稱之為“新型呼腸孤病毒病”，因?yàn)樵撔滦网喓裟c孤病毒在血清學(xué)上完全不同于之前的“番鴨呼腸孤病毒”[1-3]。2005年前后該病先在我國南方一些省份，如福建省、廣東省、浙江省等鴨群中開始出現(xiàn)，后蔓延至全國主要養(yǎng)鴨區(qū)。該病一年四季均能發(fā)生，不同品種的鴨均可發(fā)病，如櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨、半番鴨等；發(fā)病日齡一般為3～25日齡，其中以5～10日齡居多，病程5～7 d，發(fā)病率5%～35%，死亡率2%～20%，一般發(fā)病鴨日齡愈小，發(fā)病率和死亡率愈高[4-7]。

2011年新型鴨呼腸孤病在山東地區(qū)開始發(fā)生，之后幾年呈現(xiàn)區(qū)域性流行，發(fā)病率較低，但從2017年開始該病的發(fā)病率迅速上升，發(fā)病區(qū)域也不斷擴(kuò)大，給山東省的肉鴨養(yǎng)殖造成了很大的困擾。本研究將2011年～2018年從山東地區(qū)分離到的8株新型鴨呼腸孤病毒的毒力、致病性及主要抗原基因的變異進(jìn)行了分析，以期了解該病毒的變異情況，為該病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 8株新型鴨呼腸孤病毒分離自山東地區(qū)2011年～2018年間的發(fā)病鴨群中，具體背景信息見表1。

表1 8株新型鴨呼腸孤病毒分離株的背景信息Table 1 Information of 8 NDRV isolates

1.1.2 鴨胚與雛鴨 SPF鴨胚由山東省昊泰動物繁育公司提供；1日齡健康櫻桃谷鴨購自山東省德州市某種鴨場。

1.1.3 試劑 一步法RT-PCR試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、LA Taq酶、pMD18-T載體試劑盒購自TaKaRa（大連）公司；RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自AXYGEN公司；DMEM、犢牛血清購自GIBCO公司；谷胺酰胺購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 對鴨胚的致病性 將不同毒株的第3代鴨胚毒分別用生理鹽水做10倍系列稀釋，取10-3～10-75個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，0.1 mL/枚，每個稀釋度接種5枚，觀察鴨胚死亡情況及死亡鴨胚的病變情況，觀察至接種后的d 6。按Reed-Muench法計(jì)算病毒的鴨胚半數(shù)致死量（embryo lethal dose，ELD50）。

1.2.2 對鴨胚成纖維細(xì)胞（duck embryo fibroblast，DEF）的致病性 將不同毒株的第3代DEF培養(yǎng)上清分別用含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，取10-3～10-86個稀釋度接種鋪滿DEF的96孔細(xì)胞板，200 μL/孔，每個稀釋度接種8孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。放37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞病變情況，直至接種后96 h，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的細(xì)胞半數(shù)感染量（tissue culture infective dose，TCID50）。

1.2.3 對雛鴨的致病性 將不同毒株的第3代鴨胚毒分別用生理鹽水稀釋至104ELD50/0.1mL，皮下接種1日齡健康櫻桃谷鴨，0.1 mL/只，每個毒株接種10只，觀察雛鴨死亡情況，攻毒后d 6剖殺試驗(yàn)鴨，觀察脾臟病變情況。

1.2.4 抗原基因（σC）克隆測序 參照GenBank中發(fā)表的新型鴨呼腸孤病毒S1基因序列（GenBank登錄號：KJ879930）設(shè)計(jì)1對引物。上游引物P1：5'-CGAGTATCTTTGTACGCTACG-3'；下游引物P2：5'-CTCATCGCGCGCCACAG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1021 bp，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。按照RNA提取試劑盒說明提取病毒RNA，利用上述引物，按照一步法RT-PCR試劑盒的說明進(jìn)行擴(kuò)增。按照DNA凝膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α。挑菌提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，鑒定為陽性的菌落送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，并進(jìn)行序列比對分析。

1.2.5 σC蛋白基因進(jìn)化分析 利用DNAStar軟件，對這8株病毒的σC蛋白核苷酸和氨基酸序列分別進(jìn)行比對；利用MEGA軟件，將從GenBank中選取的有代表性的新型鴨呼腸孤病毒毒株同這8株病毒一起繪制σC蛋白基因的遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 8株新型鴨呼腸孤病毒對鴨胚的致病性 將8株新型鴨呼腸孤病毒接種鴨胚，均導(dǎo)致鴨胚死亡，死亡鴨胚通身出血，死亡時間為72～96 h，并將這8株病毒接種10日齡鴨胚，測定他們病毒效價，結(jié)果見表2。

2.2 8株新型鴨呼腸孤病毒對DEF細(xì)胞的致病性 將8株新型鴨呼腸孤病毒接種DEF細(xì)胞，細(xì)胞病變情況一致，初期形成合胞體，然后細(xì)胞拉網(wǎng)并逐漸脫落。在DEF細(xì)胞上測定第3代CEF上清中的病毒滴度，結(jié)果見表3。

2.3 8株新型鴨呼腸孤病毒對雛鴨的致病性 將這8株病毒分別回歸1日齡健康櫻桃谷鴨，結(jié)果都能復(fù)制出相同的癥狀與病變，表現(xiàn)為精神不佳、食欲不振，剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟均出現(xiàn)腫大、壞死、變硬現(xiàn)象（圖1），死亡率為0%～20%（表4）。

2.4 σC蛋白基因克隆測序 分別提取8株病毒的RNA，進(jìn)行一步法RT-PCR，結(jié)果均擴(kuò)增到大小1 kb左右的條帶，與預(yù)期相符（圖2）。將獲得的基因序列提交到GenBank中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)均為新型鴨呼腸孤病毒σC基因序列。

圖1 新型鴨呼腸孤病毒接種雛鴨脾臟病變Fig.1 Splenic lesions of ducks attaced by novel duck reovirus

圖2 新型鴨呼腸孤病毒σC蛋白基因擴(kuò)增Fig.2 Amplification of σC genes of Novel duck reovirus

表2 8株新型鴨呼腸孤病毒的ELD50Table 2 ELD50 of 8 NDRV isolates

表3 8株新型鴨呼腸孤病毒的TCID50Table 3 TCID50 of 8 NDRV isolates

表4 攻毒實(shí)驗(yàn)鴨死亡情況Table 4 Mortality statistics of experimental ducks attacked

2.5 σC蛋白基因進(jìn)化分析 利用DNAStar軟件，對這8株病毒的σC蛋白核苷酸和氨基酸序列分別進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸同源性為94.5%～99.6%，氨基酸同源性為95.0%～99.4%，早期分離株與新近分離株同源性相對較低（表5）。利用MEGA軟件，將這8株病毒和Genbank中有代表性的毒株進(jìn)行σC蛋白基因遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山東地方分離株處于一個單獨(dú)的分支。這8株山東地方分離株σC蛋白基因的遺傳進(jìn)化與其分離時間有著密切的相關(guān)性（圖3）。

表5 8株新型鴨呼腸孤病毒σC蛋白核苷酸和氨基酸同源性比對（%）Table 5 Comparison between the nucleotide and amino acid sequences of the σC proteins of 8 NDRV isolates（%）

圖3 新型鴨呼腸孤病毒σC蛋白基因的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of σC genes of NDRV isolates

3 討論

近幾年，新型鴨呼腸孤病毒病的流行區(qū)域已從南方擴(kuò)散到北方，發(fā)病率也在不斷上升，已成為影響我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。該病主要導(dǎo)致雛鴨肝脾出血和壞死，死亡率不高，但嚴(yán)重影響肉鴨的生長發(fā)育和免疫力，容易激發(fā)細(xì)菌感染，給肉鴨養(yǎng)殖造成了很大的困擾[8-10]。

2011年該病在山東地區(qū)開始流行，并呈現(xiàn)日益嚴(yán)重的趨勢。為了搞清楚該病毒近幾年在山東地區(qū)的變異情況，我們將從2011～2018年山東地區(qū)分離到的8株新型鴨呼腸孤病毒進(jìn)行了毒力、致病性及主要抗原σC蛋白的變異分析。致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些毒株均能致死鴨胚，死亡鴨胚通身出血；DEF細(xì)胞初期形成合胞體，然后細(xì)胞拉網(wǎng)并逐漸脫落；攻毒1日齡健康雛鴨均出現(xiàn)脾壞死病變，且死亡率較低。這些結(jié)果說明，新型呼腸孤病毒從山東地區(qū)開始出現(xiàn)至今，其致病性未發(fā)生改變。這8株病毒在鴨胚病毒效價為10-5.00～10-6.00/0.1 mL，在鴨胚成纖維細(xì)胞的病毒效價為10-5.33～10-6.30/0.1 mL，這說明不同毒株的病毒效價存在一定的差異。我們對這些毒株的主要抗原σC蛋白基因進(jìn)行了克隆、測序，發(fā)現(xiàn)他們的核苷酸長度均為966 bp，通過對σC蛋白基因的遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，山東地方分離株與國內(nèi)其他地區(qū)分離株（主要是南方地區(qū)）存在較為明顯的差異，處于一個獨(dú)立的分支，并且不同山東分離株之間也存在較為明顯的時間差異。

通過對山東地區(qū)新型鴨呼腸孤病毒的毒力、致病性及主要抗原σC蛋白的變異分析，我們發(fā)現(xiàn)該病毒致病性未發(fā)生明顯的變化，但抗原基因與國內(nèi)其他地區(qū)分離株相比有較大的差異，并且山東地區(qū)分離株也在不斷發(fā)生著變異，因此需要引起疫苗研發(fā)和疾病防控工作者的足夠重視。