葉 萱 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

1 發(fā)現(xiàn)和引入

在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)RNA沉默機(jī)制后，此技術(shù)就廣為人知，但首次報(bào)道植物中的此現(xiàn)象是在1928年。在此報(bào)道中，Wingard介紹了煙草感染煙草環(huán)斑病毒后的癥狀情況，只有較低位置的葉片壞死了，上面的葉片對(duì)病毒有免疫作用而無癥狀。在當(dāng)時(shí)還不知RNA沉默機(jī)制，但此例說明植物具有防御病毒作用，這可能是原始真核生物的最初功能之一。后來，在另一重要文章中，Napoli和其同事報(bào)道矮牽牛植物中查爾酮合酶的過度表達(dá)使植物開的花為雜色，而不是預(yù)期的深紫色。那時(shí)此現(xiàn)象被稱為“翻譯后基因沉默(post-translational gene silencing)”，現(xiàn)在被認(rèn)為是RNA干擾(RNAi)研究的早期成功事例之一。在其他包括真菌的數(shù)個(gè)真核生物中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，被稱為“抑制(quelling)”。Fire和Mello對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究發(fā)現(xiàn)了以上所有的現(xiàn)象，稱為“RNA干擾”。此被認(rèn)為是近 20年中最重要的科學(xué)突破之一，由于 Fire和Mello發(fā)現(xiàn)了真核生物的RNAi機(jī)制，在2006年他們共同被授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。此發(fā)現(xiàn)最后導(dǎo)致生物學(xué)研究中新學(xué)科的誕生，即研究非編碼RNA(ncRNA)，也就是沒有被轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的RNA分子。此機(jī)制的闡明對(duì)了解基因調(diào)控、基因功能和抗病毒防御作用有極大的作用。

從害物防治的觀點(diǎn)看，ncRNA引發(fā)了RNAi機(jī)制，導(dǎo)致基因沉默，通過破壞相應(yīng)的信使 RNA(mRNA)阻礙重要靶標(biāo)基因的表達(dá)。與傳統(tǒng)神經(jīng)毒性殺蟲劑等害物防治策略相比，RNAi技術(shù)具有高度的特異性，可用于基因研究和農(nóng)業(yè)，如保護(hù)有益昆蟲免受病毒和寄生物危害，抗性管理和防治許多作物免受害蟲、植物病原菌、螨、蜱蟲危害等(圖1)。

RNAi技術(shù)產(chǎn)品能提供新的補(bǔ)充的害物防治解決方法，其效果和選擇性遠(yuǎn)高于化學(xué)農(nóng)藥等傳統(tǒng)方法。預(yù)期基于RNAi的生物農(nóng)藥以轉(zhuǎn)化產(chǎn)品(整合于植物的保護(hù)劑，PIPs)和非轉(zhuǎn)化產(chǎn)品/非 PIP產(chǎn)品(噴霧、莖稈注射、灌根、種子處理或粉劑/顆粒產(chǎn)品)上市。市場(chǎng)對(duì)雙鏈RNAs (dsRNAs)不斷增長的興趣已促使開發(fā)出更好的生產(chǎn)系統(tǒng)，更有效的制劑，成本也從2008年的每克12 500美元下降到現(xiàn)在約2美元(2017年9月)。雖然仍缺乏田間試驗(yàn)，但預(yù)測(cè)dsRNA的使用量約為2～10 g/hm2。此用量可能因靶標(biāo)害物對(duì)RNAi的敏感性，對(duì)RNAi的內(nèi)吸性和制劑的傳遞性不同而變化。此產(chǎn)品對(duì)作物的保護(hù)和對(duì)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)處于平衡，考慮到 RNAi具有獨(dú)特作用機(jī)制，可能也沉默未預(yù)期的基因，故使用一定方法全面評(píng)估基于RNAi的農(nóng)藥和工程化作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

應(yīng)用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)已開發(fā)了一些 RNAi產(chǎn)品。本文旨在為新穎保護(hù)作物RNAi產(chǎn)品開發(fā)機(jī)會(huì)，討論了它們防治植物病原菌、線蟲、螨、植物病害和影響有益昆蟲的病原菌的潛力。此外，討論了RNAi技術(shù)的環(huán)境影響和經(jīng)濟(jì)成本，也提出轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)RNAi研究為新穎實(shí)際應(yīng)用的方式。

2 何為RNAi以及如何起作用

RNAi是大多數(shù)真核細(xì)胞中通過mRNA降解、抑制翻譯和染色質(zhì)重塑來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的古老機(jī)制。其啟動(dòng)子為具有2個(gè)補(bǔ)充鏈的 RNA分子，即dsRNA，屬于ncRNAs類型(圖1)。約21-25 bp dsRNA分子具有約2-nt 3′突出端(overhang)，能夠被RNAi機(jī)器的酶識(shí)別，隨后靶標(biāo)mRNA進(jìn)行同源依賴性降解。在RNAi途徑中有2個(gè)重要類別RNA：microRNA(miRNA)和小干擾 RNA (siRNA)。除了這些典型miRNA和 siRNA，持續(xù)發(fā)現(xiàn)其他類別的 RNA，表明這些RNA參與的途徑和調(diào)控機(jī)制的多樣性。本文將集中介紹miRNAs和siRNA。

圖1 作為一系列保護(hù)作物，改善作物，改良蜜蜂健康和抗性抑制的工具的RNA干擾(RNAi)技術(shù)

miRNA主要為生物內(nèi)生，在細(xì)胞中由莖環(huán)前體和不完全雙鏈配對(duì)產(chǎn)生。相反，siRNA為外源物，從病毒、轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)基因衍生而來的長而完全互補(bǔ)的dsRNA生成。為了簡單闡述siRNA和miRNA的分子機(jī)制，它們最初都由 dsRNA經(jīng)核糖核酸Ⅲ酶Dicer加工為20-30-nt雙鏈而產(chǎn)生。之后，有催化作用的Argonaute家族蛋白(AGO)被納入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)中。RISC既介導(dǎo) mRNA的降解又抑制翻譯。在大多數(shù)真核生物中，除昆蟲和脊椎動(dòng)物外，主要dsRNA啟動(dòng)子通過RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的作用誘導(dǎo)次級(jí)siRNA的合成，此現(xiàn)象為過渡性 RNAi(transitive RNAi)。這些次級(jí)siRNAs以不是最初dsRNA分子的靶標(biāo)的mRNA區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)，潛在地沉默多個(gè)轉(zhuǎn)錄。在昆蟲和脊椎動(dòng)物，還沒有發(fā)現(xiàn)相似的基于 RdRP的擴(kuò)增系統(tǒng)，因此過渡性 RNAi的缺乏可能增加特異性，而以單個(gè)替代性剪接mRNA同源體為靶標(biāo)。這3類分子，即Dicer、Argonaute和RNA的20-30-nt雙鏈，被稱為基因RNA沉默的必要要素，已有文章進(jìn)行詳盡介紹。

重要的是，RNAi有2個(gè)相關(guān)方面因生物種類不同變化很大。第一為沉默效應(yīng)的持效期，第二為系統(tǒng)性RNAi性能。由dsRNA擴(kuò)增產(chǎn)生的次級(jí)siRNA能夠產(chǎn)生長時(shí)間強(qiáng)而持續(xù)的反應(yīng)。此外，RNAi的系統(tǒng)特性也就是RNAi信號(hào)/作用在細(xì)胞間和組織間的擴(kuò)展，能夠?qū)е?RNAi效應(yīng)的可遺傳性傳遞(親本RNAi，parental RNAi)。當(dāng)dsRNA到達(dá)生殖細(xì)胞，沉默信號(hào)傳遞到下一代的胚胎就會(huì)發(fā)生親本RNAi。

根據(jù)生物的需要可在任何時(shí)候啟動(dòng)miRNA和siRNA沉默。因此，內(nèi)源基因的表達(dá)方式的變化與生物所處的環(huán)境有關(guān)，受新miRNAs表達(dá)的調(diào)控。相似地，當(dāng)基因組面臨入侵者(例如病毒)核酸的威脅時(shí)，就以siRNA機(jī)制降解這些核酸，以免受威脅。

RNAi能特異性抑制任何基因的表達(dá)。因?yàn)?1-25-bp dsRNA可被設(shè)計(jì)為獨(dú)特的，只能沉默既定靶標(biāo)基因。因此，其在農(nóng)業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，可保護(hù)蜜蜂免受病毒和寄生物的危害，可作為新穎的高度特異性的害物防治策略。

3 RNAi用于害物管理

自從發(fā)現(xiàn)RNAi以及其調(diào)節(jié)潛力后，它為害物防治打開了一扇新的大門。科學(xué)家已利用RNAi關(guān)閉基因，開發(fā)出與已有所有商業(yè)化產(chǎn)品不同的具有獨(dú)特作用機(jī)制的產(chǎn)品。

此愿景方法的目的是開發(fā) RNAi機(jī)制來獲得一系列害物防治的工具，以及以重要基因?yàn)榘袠?biāo)，利用此機(jī)制抑制農(nóng)藥抗性的發(fā)展(圖 1)。例如，“BioDirect”產(chǎn)品利用 RNAi進(jìn)行害蟲和病毒的防治，對(duì)蜜蜂的安全性高，和化學(xué)除草劑合并對(duì)雜草的防效高。這些項(xiàng)目目前還處于于研究和開發(fā)的第一和第二階段。

田間應(yīng)用RNAi可能包括傳統(tǒng)的PIPs (即轉(zhuǎn)基因植物/基于RNAi植物形狀)，以dsRNA為活性成分，應(yīng)用可變的傳遞方式的殺蟲劑、殺菌劑、殺螨劑和抗病毒制劑產(chǎn)品(第4節(jié))。此外，這些dsRNA能被用于抑制昆蟲和雜草的抗性產(chǎn)生。對(duì)于此第二類別的非PIPs，含dsRNA的終端產(chǎn)品(dsRNA-EPs)可能以4種類別上市：⑴ 防治劑；⑵ 抗性因子抑制劑；⑶ 發(fā)育干擾劑；⑷ 生長促進(jìn)劑。本文中僅討論與作物保護(hù)有關(guān)產(chǎn)品的發(fā)展。

筆者認(rèn)為開發(fā)高度量身定做的保護(hù)作物和促進(jìn)作物發(fā)育的 RNAi產(chǎn)品的潛力部分由靶標(biāo)生物高度變化的響應(yīng)性決定。因此，以下討論誘導(dǎo)昆蟲、真菌、其他植物病原菌、線蟲和螨中RNAi和使用RNAi產(chǎn)品為抗性因子抑制劑進(jìn)行昆蟲和雜草的管理的例子，這可被進(jìn)一步開發(fā)用于農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。

3.1 節(jié)肢動(dòng)物

RNAi對(duì)一些昆蟲特別有效，特別是鞘翅目昆蟲，作用快?？上У氖趋[翅目和半翅目害蟲對(duì)外部RNAi的對(duì)抗性很強(qiáng)，表明具有生物屏障限制RNAi用于管理這些昆蟲。闡明這些瓶頸可能使具有獨(dú)特性和新穎作用機(jī)制的此技術(shù)用于綜合害物管理(IPM)策略。

Baum等人撰寫的里程碑性文章表明在轉(zhuǎn)基因玉米中的dsRNA能導(dǎo)致玉米根蟲(WCR, Diabrotica virgifera)幼蟲死亡。此研究使研究人員意識(shí)到daRNA具有通過轉(zhuǎn)基因作物作為新的害物防治劑的潛力。在2016年9月，加拿大食品檢驗(yàn)局批準(zhǔn)新玉米品種MON87411的商業(yè)化，其商品名為SmartStax PRO，表達(dá)了3個(gè)Crystal (Cry)基因和含有玉米根蟲蔗糖非發(fā)酵7(DvSnf7)基因的240-bp片段的dsRNA。在2017年6月，美國環(huán)保局也批準(zhǔn)此玉米商業(yè)化種植。DvSnf7基因編碼液泡分選中的重要蛋白，到目前為止還沒有開發(fā)出干擾這個(gè)過程的殺蟲劑。然而，由于RNAi機(jī)制，Snf7 dsRNA單獨(dú)需要很長時(shí)間來有效殺死玉米根蟲。因此，MON87411合并了來自Bt (Bacillus thuringiensis)以主要鱗翅目害蟲和WCR為靶標(biāo)的作用更快的 Cry 基因以及葉甲(Diabrotica spp.)復(fù)合體。這些機(jī)制(即 Bt和 RNAi)聯(lián)合的主要目標(biāo)是降低昆蟲對(duì)Bt技術(shù)抗性的產(chǎn)生。已研究表明轉(zhuǎn)基因玉米中 Snf7 dsRNA的表達(dá)能夠保護(hù)玉米根免受WCR幼蟲的危害。

完全不同的應(yīng)用路線是使用可噴霧dsRNA，考慮到dsRNA在環(huán)境中預(yù)期的半衰期短，與化學(xué)農(nóng)藥相比是環(huán)境友好替代法。葉用的dsRNA分子在溫室條件下至少穩(wěn)定 28 d可防治馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)，一旦在葉子上干燥了，dsRNA就不可浸出。已開發(fā)在柑橘葉上噴霧使用dsRNA防治柑橘象鼻蟲(Diaprepes abbreviates)的RNAi策略，此方法具有防治這些叮咬/咀嚼害蟲的前景。噴霧 dsRNA的效果令人鼓舞，但有幾個(gè)方面還需要改進(jìn)，預(yù)期含有dsRNA的終端產(chǎn)品在2019年上市。

噴霧 dsRNA可能防治取食植物的咀嚼害蟲非常有效，但對(duì)半翅目等刺吸式害蟲不是理想的方法。對(duì)于此類害蟲，開發(fā)了植物系統(tǒng)(in plant system，iPS)方法，即用植物新芽(vegetative new growth flushes)傳遞dsRNA來防治柑橘木虱(Diaphorina citri)。使用此方法，當(dāng)給柑橘木虱飼喂以精胺酸激酶為靶標(biāo)的 dsRNA(即以對(duì)無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞能量和代謝有重要作用的基因?yàn)榘袠?biāo))發(fā)生轉(zhuǎn)錄敲除和木虱死亡。

二斑葉螨(Tetranychus urticae)等螨是花卉植物和經(jīng)濟(jì)作物的重要害蟲。由于大量使用農(nóng)藥，二斑葉螨迅速對(duì)幾乎所有類型的殺螨劑產(chǎn)生了抗性。二斑葉螨基因組的獲得有助于了解其轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，這為使用RNAi防治螨鋪平了道路。以上描述的系統(tǒng)/親本RNAi被用于抑制Distal-less基因的表達(dá)，此基因是參與附肢形成的同源異形基因一員，例如肢體形態(tài)的形成。給成雌蟲注射 dsRNA或siRNA，就會(huì)產(chǎn)生縮短的和少腿的后代。建立了葉碟飼喂傳遞dsRNA的方法。用此方法沉默運(yùn)輸生物合成膜的外被體蛋白亞基 β-2基因，導(dǎo)致二斑葉螨的死亡率最高(＞65%)。因此，此方法可被用于迅速篩選致死基因。柑橘全爪螨(Panonychus citri)是柑橘的重要害蟲，對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥有抗性，RNAi能有效防治此種害蟲。若蟲取食dsRNA處理的葉碟后Spook基因被沉默，56%若蟲死亡。這些結(jié)果表明以選擇基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA被取食后能夠誘導(dǎo)基因敲除和螨死亡。因此這些靶標(biāo)基因是開發(fā)為和Bt毒素和殺螨劑等其他防治策略聯(lián)用的螨防治策略的候選物。

當(dāng)然，新防治策略引入后其害蟲抗性是人們常關(guān)注的問題。已知昆蟲具有很大的表型和遺傳可塑性，一些玉米根蟲個(gè)體對(duì)玉米 MON87411中的DvSnf7 dsRNA性狀較敏感或敏感性差。選用田間收集的對(duì)作物輪作有和無抗性的種群進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)表明昆蟲對(duì)攝取的dsRNA有不同的反應(yīng)。這表明不同玉米根蟲種群對(duì) RNAi農(nóng)藥的表型反應(yīng)不同，證實(shí) RNAi具有抗性發(fā)展?jié)摿?。綜合害物管理原則可延緩抗性的產(chǎn)生。在美國環(huán)保局聯(lián)邦殺蟲劑、殺菌劑和殺鼠劑法案會(huì)議上討論的對(duì)轉(zhuǎn)基因 RNAi作物的可能抗性機(jī)制如下：⑴ dsRNA靶標(biāo)序列240 bp被認(rèn)為可發(fā)生變化，如DvSnf7 dsRNA，但較短的靶標(biāo)也可能發(fā)生變化，單核苷酸多態(tài)性的出現(xiàn)可能降低dsRNA和其靶標(biāo)的互補(bǔ)性。長的dsRNAs(＞200 nt)能夠?qū)е螺^大量的siRNAs與靶標(biāo)mRNA匹配，而可能具有優(yōu)勢(shì)，能增加RNAi反應(yīng)，阻止選擇基因變化的個(gè)體。⑵ 對(duì)吸收、運(yùn)輸?shù)戎匾奶烊黄琳弦鸬膁sRNA動(dòng)力學(xué)變化。⑶ siRNA分子的RIS復(fù)合體的識(shí)別的下降，RISC復(fù)合體降解靶標(biāo) mRNA的功能障礙，Dicer核糖核酸酶加工過程的減少或阻礙RNAi信號(hào)系統(tǒng)擴(kuò)展等RNAi機(jī)器酶或成分的變化。⑷ 昆蟲可能發(fā)展不同的機(jī)制來補(bǔ)償特異基因沉默，如增加轉(zhuǎn)錄率或上調(diào)與沉默基因有相同或相似功能的其他基因。⑸ 在昆蟲取食轉(zhuǎn)基因植物期間，由于嗅覺或味覺變化導(dǎo)致對(duì)dsRNA吸收的減少，對(duì)食物中dsRNA產(chǎn)生抗性。然而，就以上參數(shù)而論，SmartStax PRO玉米與非轉(zhuǎn)基因品系沒有差異。在美國環(huán)保局聯(lián)邦殺蟲劑、殺菌劑、和殺鼠劑法案會(huì)議期間，一個(gè)報(bào)告表明用SmartStax PRO處理的盆栽作物中出現(xiàn)了約134個(gè)玉米根蟲成蟲，但沒有證據(jù)表明這些個(gè)體對(duì)dsRNA DvSnf7產(chǎn)生抗性。以上提及的許多機(jī)制可能都是潛在的抗性機(jī)制，但到目前為止都沒有被證實(shí)。采用傳統(tǒng)的避難所，就是留有一定面積的沒有以上性狀的作物或不施用農(nóng)藥的作物，合用多個(gè)不同作用機(jī)制的殺蟲劑以及不同防治策略能延緩昆蟲對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展抗性。

3.2 真菌和其他植物病原菌

在大多數(shù)情況下，RNAi途徑和其主要成分，例如Dicer、Argonaute和RdRP，出現(xiàn)于大多數(shù)真菌品種中，這表明大多數(shù)真菌也是RNAi的靶標(biāo)。RNAi也可被開發(fā)來干擾許多種類病毒的復(fù)制，所以RNAi途徑可用于防治病毒和真菌植物病害。

影響谷物作物的數(shù)種病害，例如鐮刀菌屬死體營養(yǎng)真菌引起的赤霉病(FHB)和苗立枯病(FSB)可用RNAi成功壓制。例如Kock等人用含有dsRNA的培養(yǎng)基離體培養(yǎng)禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)，此 dsRNA與負(fù)責(zé)麥角甾醇生物合成的細(xì)胞色素P450基因CYP51A、CYP51B和CYP51C互補(bǔ)，結(jié)果為 dsRNA具有如唑類殺菌劑抑制病原菌生長和引起形態(tài)變化的作用。研究表明表達(dá)相同 dsRNA(CYP51)的轉(zhuǎn)基因植物擬南芥和大麥對(duì)禾谷鐮刀菌侵染有高的抗性。相似地，在dsRNA被應(yīng)用的地區(qū)，以負(fù)責(zé)真菌麥角甾醇生物合成的 CYP3為靶標(biāo)的dsRNA用于大麥葉面防治禾谷鐮刀菌的侵染。dsRNA首先到達(dá)木質(zhì)部等質(zhì)外體，然后以未知的機(jī)制轉(zhuǎn)移到共質(zhì)體。

以前的工作表明引起植物灰霉病的真菌病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的2個(gè)類Dicer(DCL1/2)核糖核酸內(nèi)切酶被敲除后，其致病力基本喪失，生長停止。DCL1和DCL2參與小RNAs的生物合成，被認(rèn)為是RNAi途徑的主要成分。在最近的工作中，用能使單獨(dú) DNA結(jié)合在一起的重疊聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中成功表達(dá)Bc-DCL1/2片段。相似地，用煙草脆裂病毒(TRV)與 Bc-DCL1/2序列的重組載體，通過病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)，在番茄植物中表達(dá)Bc-DCL1/2-sRNAs。在2種情況下，Bc-DCL片段只啟動(dòng)了灰葡萄孢菌中的RNAi機(jī)制，而不影響來自擬南芥或番茄植物的類 Dicer蛋白。這說明 RNAi由于具有序列特異性作用機(jī)制，對(duì)特定靶標(biāo)有高的選擇性。Bc-DCL基因的沉默減弱了灰葡萄孢菌的致病性，其生長減緩了，而表達(dá)以馬鈴薯晚疫病抗性基因?yàn)榘袠?biāo)的sRNA的對(duì)照植物發(fā)病嚴(yán)重。最后，應(yīng)用離體合成的作用于灰葡萄孢菌中相同基因的dsRNA或sRNA于水果、蔬菜和花表面也抑制灰霉病。這表明dsRNA可被用于防治獲后水果和蔬菜的病害。

菜豆金色花葉病毒(BGMV)被煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播，菜豆被感染后產(chǎn)生金色花葉。開發(fā)的RNAi轉(zhuǎn)基因菜豆表達(dá)以可引起病毒侵染的AC1病毒基因?yàn)榘袠?biāo)的內(nèi)含子發(fā)夾結(jié)構(gòu)。具有高抗的轉(zhuǎn)基因植物品系，大約95%植物在高壓接種(每個(gè)植物有300多個(gè)帶病毒的煙粉虱)后不被侵染。

相似地，以外殼蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)的 RNAi已被用于寄主誘導(dǎo)的基因沉默，使番木瓜樹和李樹分別對(duì)番木瓜環(huán)斑病毒和李痘病毒有抗性。這些是RNAi如何被用于防治植物病害和如何可能在栽培和獲后采用用于防治1個(gè)植物品種病害的RNAi防治其他作物的其他病害的例子。

3.3 線蟲

已有資料介紹 RNAi對(duì)模式線蟲秀麗隱桿線蟲有作用，dsRNA被注射或取食后也可傳遞給下一代(親本 RNAi)。

在農(nóng)業(yè)中，根結(jié)線蟲給全球數(shù)種植物造成大的損失，包括使植物生長不佳，根癭形成，低的氮固定率，有時(shí)整個(gè)作物死亡。RNAi可被工程化對(duì)線蟲有抗性。例如，以前發(fā)現(xiàn)攝入以16D 10 dsRNA為靶標(biāo)的dsRNA(以決定線蟲-寄主結(jié)合的基因?yàn)榘袠?biāo))導(dǎo)致線蟲感染性下降。隨后，能產(chǎn)生以相同基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)4種根結(jié)線蟲[南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogyne javanica)、花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)和正北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla )]有抗性。這些結(jié)果表明與對(duì)照相比，16D 10 dsRNA轉(zhuǎn)基因品系每克根中根結(jié)線蟲卵的數(shù)量可減少93%。因此，此方法可被用于作物保護(hù)，開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物為防治策略，使寄主對(duì)此重要病原菌有抗性。使用也以16D10基因?yàn)榘袠?biāo)的含有42 bp(pART27-42)或271 bp (pART27-271)的莖序列(stem sequence)的基于發(fā)卡的沉默結(jié)構(gòu)，可開發(fā)出對(duì)線蟲有抗性的轉(zhuǎn)基因葡萄，此轉(zhuǎn)基因葡萄可導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲侵染的減少。防治寄生性根結(jié)線蟲 RNAi也對(duì)其他根結(jié)線蟲屬靶標(biāo)有效，如Phe-met-arg-phe(FMRF)類酰胺肽基因[編碼FMRF類肽(flp)-14和-flp-18，分別調(diào)節(jié)神經(jīng)和肌肉活性]，但也對(duì)其他屬如短體線蟲屬和胞囊線蟲屬有效。所有這些例子說明工程化技術(shù)可使許多重要農(nóng)業(yè)植物對(duì)多種根結(jié)線蟲具有抗性。

3.4 RNAi防治有益昆蟲的病害和寄生蟲

除了具有壓制重要害蟲和植物病原菌的潛力外，RNAi方法可用于防治蜜蜂和其他有益昆蟲的病毒病。RNAi的天然功能為保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染，故此方法合乎邏輯。研究表明蜜蜂取食相對(duì)應(yīng)于IAPV基因組的2個(gè)不同序列的dsRNA可免受以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)感染。故為了保護(hù)蜜蜂不被IAPV感染，dsRNA產(chǎn)品“Remebee”被用于大規(guī)模田間試驗(yàn)。分別設(shè)置IAPV+Remebee、IAPV、Remebee和未處理對(duì)照，Remebee以飼喂進(jìn)行處理。在不同的氣候和季節(jié)，在美國2個(gè)州(佛羅里達(dá)和賓夕法尼亞州)160個(gè)蜂箱進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果為IAPV+Remebee處理蜜蜂的存活率增加了，蜜蜂的量和蜂蜜的量分別為 IAPA處理的2和3倍。相似地，給大黃蜂注射和飼喂病毒特異性dsRNAs，誘導(dǎo)IAPV特異性基因沉默和保護(hù)工蜂不被感染死亡。

RNAi也已被開發(fā)以狄氏瓦螨(Varroa destructor)等寄生蟲和東方蜜蜂微孢子蟲(Nosema Ceranae)等內(nèi)微孢子蟲寄生蟲為靶標(biāo)，防治蜜蜂成蟲廣泛發(fā)生的孢子蟲病，用于提高蜜蜂的健康水平。這些寄生蟲具有完全的RNAi作用機(jī)制，攝入dsRNAs后很容易被誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi。因此，把作用于東方蜜蜂微孢子蟲能量代謝基因(ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)者)的dsRNA飼喂于被感染的蜜蜂，寄生蟲的負(fù)載量會(huì)減少。相似地，RNAi被用于防治以蜜蜂成蟲和幼蟲的血淋巴為食的專性寄生蟲狄氏瓦螨。當(dāng)蜜蜂被飼喂作用于細(xì)胞骨架組裝、能量轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)錄(例如 α-微管蛋白和RNA聚合酶 III)的數(shù)個(gè)狄氏瓦螨基因的特異性dsRNA混合物，螨的侵染可減少50%。有趣的是，以上處理對(duì)蜜蜂無明顯影響。由于養(yǎng)蜂者用有機(jī)磷等化學(xué)農(nóng)藥防治狄氏瓦螨，螨已對(duì)許多化學(xué)產(chǎn)品產(chǎn)生抗性，RNAi方法雖然防效低于化學(xué)農(nóng)藥但是是替代性防治策略。

3.5 壓制昆蟲和雜草抗性發(fā)展基因

隨著抗農(nóng)藥的害蟲和雜草的數(shù)量在快速增加，開發(fā)壓制與除草劑和殺蟲劑抗性發(fā)展有關(guān)基因的dsRNA產(chǎn)品(抗性抑制劑，non-PIPs)的興趣也在不斷增加，此產(chǎn)品可被用于擴(kuò)展現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥的壽命。以下將討論以 RNAi為抗性抑制劑，通過沉默害蟲和雜草的與抗性發(fā)展有關(guān)的基因，延緩抗性種群抗性的發(fā)展。

昆蟲主要有3種機(jī)制來應(yīng)對(duì)毒物：行為、物理和生化機(jī)制。一旦毒物進(jìn)入生物體，在毒物到達(dá)靶點(diǎn)前，生物會(huì)增加代謝解毒功能，滯留或排泄毒物。而 RNAi壓制與抗性發(fā)展有關(guān)基因的表達(dá)，能使害物恢復(fù)對(duì)特定毒物的敏感性。在1個(gè)研究中，RNAi被開發(fā)用于沉默P450酶(CYP6AE14)，此酶降低了棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)對(duì)棉子酚的耐受性。棉子酚是植物產(chǎn)生保護(hù)自身免受害蟲危害的數(shù)個(gè)化合物之一。然而，CYP6AE14在棉鈴蟲幼蟲中腸中高度表達(dá)，棉鈴蟲就對(duì)有毒濃度的棉花代謝物棉子酚有耐受性。在棉鈴蟲中已確定 5個(gè)棉子酚誘導(dǎo)的CYP基因，這些基因使此害蟲對(duì)溴氰菊酯有耐受性。在東亞飛蝗(Locusta migratoria)體內(nèi)，RNAi沉默溴氰菊酯誘導(dǎo)的CYP基因CYP408B1和CYP409A1，此害蟲再暴露于溴氰菊酯后死亡率增加(約 21%)，這表明這些基因與擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性有關(guān)。相似地，RNAi敲除了抗馬拉硫磷飛蝗體內(nèi)2個(gè)高度表達(dá)的羧酸酯酶(LmCarE9和LmCarE25)后，此飛蝗暴露于馬拉硫磷的死亡率增加約34%。最近有文章綜述了如何應(yīng)用RNAi研究害蟲的抗性以及管理抗性。

品牌技術(shù)“BioDirect”是利用合成的 cDNA，此cDNA與直接抑制雜草中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)產(chǎn)生的RNA片段互補(bǔ)。對(duì)抗草甘膦雜草(例如通過EPSPS擴(kuò)增而賦予抗性)，噴霧使用此產(chǎn)品和草甘膦后，草甘膦的效力恢復(fù)。

從作物保護(hù)觀點(diǎn)來說，RNAi通過抑制酶的正常產(chǎn)生，可能有助于應(yīng)對(duì)代謝抗性，和化學(xué)殺蟲劑/除草劑合用，使殺蟲劑/除草劑的防效恢復(fù)。RNAi緩減代謝抗性的程度將取決于幾個(gè)因素：昆蟲/雜草品種和傳遞方法。例如，大多數(shù)鞘翅目害蟲對(duì) RNAi非常敏感，因此dsRNA制劑可作為抗性抑制劑，而半翅目和鱗翅目昆蟲對(duì)其敏感性較差，其效果較低。此方法的效果也取決于沉默代謝途徑的主要基因和是否RNAi能有效沉默這些基因。沉默這些靶標(biāo)基因并不總是可靠的，因?yàn)橛行┛剐圆⒉皇谴x所致且對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥來說其抗性機(jī)制未知。筆者認(rèn)為單基因抗性用RNAi機(jī)制易于解決，而用RNAi較難減緩多基因抗性。

4 daRNA傳遞

到目前為止在作物保護(hù)領(lǐng)域中受到最大關(guān)注的傳遞方法為產(chǎn)生害物特異性dsRNA的轉(zhuǎn)基因作物。研究已表明轉(zhuǎn)基因傳遞能成功保護(hù)數(shù)種作物免受特異害蟲的危害。美國環(huán)保局最近登記了4個(gè)產(chǎn)品，這些產(chǎn)品含有名為“SmarStax PRO”的RNAI PIP，可用于防治WCR。SmartStax PRO中的基于RNAI的性狀導(dǎo)致含有 WCR Snf7基因的 240-bp片段的dsRNA轉(zhuǎn)錄。昆蟲取食MON87411后，此種植物中產(chǎn)生的dsRNA被WCR和與WCR密切相關(guān)的其他害蟲的RNAi機(jī)器特異性識(shí)別，導(dǎo)致Snf7基因下調(diào)，WCR死亡。然而，在許多情況下，由于政治或立法原因或被考慮的作物在技術(shù)上難以轉(zhuǎn)化為期望的，使用轉(zhuǎn)基因作物并不現(xiàn)實(shí)。因此，代替性dsRNA傳遞路線已被提出，這不涉及植物的轉(zhuǎn)化。

RNA可通過植物的微管系統(tǒng)移動(dòng)。因此可葉用dsRNA或土壤應(yīng)用根吸收來壓制害物的侵染。植物體內(nèi) dsRNA傳遞作為非轉(zhuǎn)基因傳遞方法已被報(bào)道能成功傳遞dsRNA到取食植物的靶標(biāo)害蟲。葉面噴霧、根噴淋或莖桿注射dsRNA可使整個(gè)柑橘和葡萄樹受藥。2個(gè)半翅目昆蟲和1個(gè)取食木質(zhì)部的葉蟬能通過取食用dsRNA處理的植物而吸收dsRNA。這表明植物根能吸收 dsRNA分子，莖桿注射后dsRNA通過植物的微管(木質(zhì)部和韌皮部)傳遞。此發(fā)現(xiàn)為防治難防的取食根和刺吸式害蟲帶來了新的可能，特別對(duì)于植物轉(zhuǎn)化需數(shù)年以及費(fèi)用高的多年生作物(例如葡萄和柑橘樹)。

特異性病原菌 dsRNA葉面用于植物進(jìn)行害物抗性管理也可替代轉(zhuǎn)基因 RNAi。然而，僅 dsRNA噴霧于植物不穩(wěn)定，是其實(shí)際應(yīng)用的一大挑戰(zhàn)。最近研究表明把 dsRNA負(fù)載于專門設(shè)計(jì)的無毒可降解的層狀雙氫氧化物(LDH)納米黏土片(“生物黏土”)可保護(hù)dsRNA。一旦dsRNA負(fù)載于LDH上就不會(huì)被雨水沖掉，被持續(xù)釋放，即使在用后30 d在噴霧葉片上都能檢測(cè)到。此外，1次噴霧負(fù)載于LDH上的dsRNA，可保護(hù)被噴霧和新長出的未噴霧葉片不受病毒危害的時(shí)間至少為20 d。這證實(shí)dsRNA可以遷移到植物未處理的部分。然而，局部應(yīng)用dsRNA對(duì)靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄只有暫時(shí)的修飾作用，不會(huì)改變基因組。這意味著由于陽光、微生物和細(xì)胞中天然dsRNA加工機(jī)制的降解，需要多次重復(fù)使用dsRNA。然而，此創(chuàng)新傳遞方法把傳遞 RNAi進(jìn)行人類疾病治療的納米技術(shù)轉(zhuǎn)為用于作物保護(hù)的環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展的易于應(yīng)用的局部噴霧。

害物共生體能被工程化后傳遞 dsRNA到害物寄主。在共生體介導(dǎo) RNAi中，共生體和其寄主間的關(guān)系被開發(fā)為持續(xù)產(chǎn)生dsRNA和誘導(dǎo)寄主中的RNAi。VIGS可被用于短暫沉默害蟲或寄主植物的病原菌靶標(biāo)基因。在 VIGS中，害物特異性 RNAi誘導(dǎo)者序列被引入無致病性工程化病毒中，把工程化病毒暴露于害物細(xì)胞，對(duì)害物靶標(biāo)基因mRNA特異性的siRNA將被沉默。當(dāng)昆蟲或病原菌攝取被工程化病毒感染的植物時(shí)，它們的 VIGS可被誘導(dǎo)。煙草植物表達(dá)對(duì)咀嚼式昆蟲煙草天蛾(Manduca sexta)特異性dsRNA的反義片段的植物病毒TRV，昆蟲幼蟲取食這些植物后，能特異性沉默3個(gè)中腸表達(dá)的MsCYP RNAs。除了把植物病毒用作昆蟲特異性dsRNA傳遞介質(zhì)，另一潛在VIGS方法為使用重組病毒，此重組病毒在寄主昆蟲體內(nèi)能夠感染和復(fù)制。在感染后，工程化病毒穿過昆蟲細(xì)胞擴(kuò)展，啟動(dòng)RNAi，導(dǎo)致昆蟲基因特異性siRNA產(chǎn)生，隨后基因沉默。然而，此技術(shù)的應(yīng)用需要確定在靶標(biāo)害蟲體內(nèi)能夠自發(fā)感染和復(fù)制的病毒，因?yàn)椴《净蚪M的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄對(duì)啟動(dòng)RNAi重要 。傳統(tǒng)使用病毒防治昆蟲(例如防治毛蟲的桿狀病毒)依靠發(fā)現(xiàn)有毒的高致病力的病毒品系，主要為品種特異性的，然而，非致病病毒能被工程化表達(dá)特異性dsRNA/siRNAs和直接傳遞到昆蟲種群。

田間使用dsRNA進(jìn)行害物防治時(shí)，只有dsRNA為品種特異性和經(jīng)濟(jì)有效才可行。噴霧應(yīng)用dsRNA依賴于開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效方法大量生產(chǎn) dsRNA和其制劑化。幸運(yùn)的是生產(chǎn)dsRNA的費(fèi)用在迅速下降。例如NTP合成法生產(chǎn)1 g dsRNA的費(fèi)用從2008年的12 500美元到2016年的100美元到現(xiàn)在60美元。缺乏降解 dsRNA酶的大腸桿菌品系[HT115(DE3)]可被用于大量生產(chǎn)dsRNA。由于細(xì)菌能夠大量表達(dá)產(chǎn)生dsRNA，故細(xì)菌產(chǎn)生的dsRNA農(nóng)藥可在任何時(shí)候噴霧用于作物。這可被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)dsRNA的方法(1 g約4美元)，因?yàn)閷?duì)于大多數(shù)國家來說細(xì)菌生產(chǎn) dsRNA是可以負(fù)擔(dān)得起的生產(chǎn)體系。最近，1個(gè)生物技術(shù)公司開發(fā)了名為“Apse RNA Containers(ARCs)”的技術(shù)，用細(xì)菌可大量生產(chǎn)膠囊化dsRNA，成本約為 2美元/g。質(zhì)粒編碼天然產(chǎn)生的衣殼等蛋白可與另一質(zhì)粒編碼的 daRNA序列和裝配點(diǎn)一起轉(zhuǎn)化。當(dāng)細(xì)菌在培養(yǎng)中生長時(shí)，它們產(chǎn)生自己組裝在細(xì)胞中RNA周圍的蛋白質(zhì)亞基，包括裝配點(diǎn)序列。在純化細(xì)菌后，得到的RNA在環(huán)境中穩(wěn)定，能夠噴霧使用。由于缺乏田間試驗(yàn)，每公頃需要的dsRNA的量和施用頻率仍未知，但預(yù)測(cè)每公頃使用量約為2～10 g。根據(jù)害物品種對(duì)RNAi敏感性、系統(tǒng)性 RNAi和制劑傳遞效率的不同，此數(shù)值可能差異很大。市場(chǎng)對(duì)dsRNA興趣的不斷增加會(huì)促進(jìn)開發(fā)更好的生產(chǎn)體系，更有效的制劑和更低的成本。

5 RNAi對(duì)環(huán)境可能的影響

RNAi是正在出現(xiàn)的技術(shù)，為開發(fā)新穎害物防治策略和轉(zhuǎn)基因植物性狀帶來了新的機(jī)會(huì)。下一代RNAi產(chǎn)品將利用植物產(chǎn)生的dsRNA或噴霧于植物上的dsRNA使害物的基因表達(dá)被抑制。雖然如美國環(huán)保局和歐盟食品安全局(EU-EFSA)等大多數(shù)生物技術(shù)產(chǎn)品管理機(jī)構(gòu)對(duì)于新引入的PIPs的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有豐富的經(jīng)驗(yàn)(數(shù)年的 Bt作物評(píng)估)，但由于dsRNA獨(dú)特的作用機(jī)制，用相同評(píng)估方法可能不能評(píng)估dsRNA的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)或危險(xiǎn)性。

RNAi的活性譜是基于序列的。這意味著當(dāng)前缺乏許多現(xiàn)有生物的基因組數(shù)據(jù)，特別在 RNAi應(yīng)用區(qū)域，這可能會(huì)阻礙對(duì)作物區(qū)域/農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中應(yīng)用的RNAi技術(shù)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。雖然預(yù)期siRNA為獨(dú)特的，因此只沉默既定靶標(biāo)基因，但已報(bào)道siRNA沉默非靶標(biāo)品種的基因。通過PIPs或非PIPs傳遞的RNAi農(nóng)藥的潛在風(fēng)險(xiǎn)可被分為脫靶(off-target)基因沉默、對(duì)非靶標(biāo)生物基因沉默、RNAi機(jī)器的飽和和免疫刺激。

化學(xué)和微生物農(nóng)藥以及Bt作物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)一般用分層法評(píng)估。此方法常依賴于已知環(huán)境暴露濃度對(duì)不同非靶標(biāo)指示性生物(例如傳粉昆蟲、捕食者和寄生者)的最大風(fēng)險(xiǎn)劑量測(cè)定。這些害物防治技術(shù)的作用機(jī)制已被詳細(xì)地介紹過，然而，siRNA可能會(huì)和非靶標(biāo)生物的基因組進(jìn)行脫靶結(jié)合。這可以預(yù)測(cè)毒性影響和設(shè)計(jì)對(duì)潛在暴露的大量生物的最大風(fēng)險(xiǎn)生測(cè)。雖然脫靶結(jié)合不是對(duì)靶標(biāo)生物的關(guān)注，但如果非靶標(biāo)生物充分暴露于噴霧的dsRNA或RNAi工程化植物，在非靶標(biāo)生物體內(nèi)的脫靶結(jié)合可能是RNAi的風(fēng)險(xiǎn)。此外，不同生物(靶標(biāo)/非靶標(biāo))可能具有不同的RNAi機(jī)器，如使dsRNA穿過膜的受體、Dicer和 Argonaute。這些差異可在 RNAi機(jī)器的效率上看到。然而，這些酶如何作用和是否出現(xiàn)在非靶標(biāo)生物體中的差異表明，以 1個(gè)害物為靶標(biāo)的dsRNA如何在其他生物的RNAi途徑中起作用。因?yàn)?RNAi是基于序列的，由此可推斷出與靶標(biāo)害物種系關(guān)系密切的非靶標(biāo)生物受 RNAi方法影響的可能性較高。對(duì)以往所有RNAi技術(shù)性狀進(jìn)行全面評(píng)估是檢測(cè)其風(fēng)險(xiǎn)的適宜方法。

siRNA對(duì)已知mRNA的特異性與它們序列同系性的最低水平有關(guān)，二者之間較好的序列同系性可導(dǎo)致對(duì)靶標(biāo)mRNA的抑制。然而，抑制程度取決于選擇的 mRNA，2個(gè)分子間大量序列差異不能排除對(duì)mRNA基因的沉默。這在抗玉米根蟲的轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)，也報(bào)道此玉米對(duì)其他數(shù)種甲殼蟲有作用。黃瓜十一星葉甲 (Diabrotica undecimpunctata)和馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)與玉米根蟲的這些基因的序列同系性只有79%和83%，以玉米根蟲v-ATPase A和E為靶標(biāo)的dsRNA也對(duì)這2種害蟲的存活率降低約40%和45%。dsRNA的加工不是發(fā)生在固定的約 21個(gè)核苷酸間隔。外來的dsRNA序列被識(shí)別后可被 Dicer在任一核苷酸位置剪切，產(chǎn)生由系統(tǒng)RNAi機(jī)器產(chǎn)生的siRNA進(jìn)一步填充大小和序列的潛在重疊的許多siRNA。siRNA多樣，故與不同mRNA靶標(biāo)的siRNA/dsRNA有高度同源性的潛力，因此增加了脫靶標(biāo)和非靶標(biāo)效應(yīng)。產(chǎn)生多個(gè)不同功能siRNA的dsRNA能抑制非靶標(biāo)生物體中的基因，這已被證實(shí)。計(jì)算機(jī)方法表明當(dāng)較長dsRNA序列(100-400 nt)被用于產(chǎn)生siRNA池，脫靶效應(yīng)增加。這是因?yàn)閐sRNA所固有的序列多樣性隨著其長度的增加而增加，導(dǎo)致更多樣的siRNA序列池。相同研究進(jìn)一步表明所使用的品種[智人(Homo sapiens)、秀麗隱桿線蟲和粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)]隨意產(chǎn)生的siRNA序列的 5%-80%能結(jié)合到 1個(gè)生物體中的非既定mRNA。如果dsRNA的長度與脫靶結(jié)合成正相關(guān)性，那么使用 siRNA(21-23 nt)能降低脫靶效應(yīng)的可能性。一致大小的siRNA對(duì)靶標(biāo)mRNA的特異性提高，但不排除對(duì)非靶標(biāo)生物的脫靶效應(yīng)。也發(fā)現(xiàn) RNAi以一定的過剩進(jìn)行作用。因此，能夠產(chǎn)生以害物mRNA為靶標(biāo)的siRNA或miRNA，而不是被Dicer剪切的 dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物是降低對(duì)非靶標(biāo)潛在影響的策略。這也可降低沉默靶標(biāo)基因的可能性。到目前為止，有證據(jù)顯示大多數(shù)RNAi轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的所有dsRNA被剪切為siRNA，除非轉(zhuǎn)基因植物在葉綠體中產(chǎn)生dsRNA。

siRNA中，前12個(gè)堿基由靶標(biāo)識(shí)別序列組成。這表明在堿基2-12區(qū)域的錯(cuò)配就會(huì)使siRNA對(duì)靶標(biāo)mRNA的所有活性消失，此區(qū)域外的錯(cuò)配可以忍受。顯然，必須以此區(qū)域?yàn)橹攸c(diǎn)來選擇 siRNA，生物信息學(xué)在確定選擇序列的特異性方面有重要作用。雖然BLAST搜索容易、快速，但其不能夠特異搜索位置2-12，考慮到含有21-24 nt的 dsRNA的context，BLAST也不能評(píng)判短的非連續(xù)區(qū)域的同源性。而Smith-Waterman算法能被用于以迭代方式分析特異性位置，進(jìn)行最佳局部對(duì)比，這可被用于短的引導(dǎo)序列的同源性分析?？紤]到潛在暴露于dsRNA PIP和噴霧的dsRNA中已知農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中或周圍的生物多樣性，生物信息學(xué)工具可用于確定潛在的脫靶和非靶標(biāo)生物，但不應(yīng)被用作對(duì)非既定影響的絕對(duì)預(yù)測(cè)工具。除了生物信息學(xué)，其他策略可能被用于降低 RNAi的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。例如，以O(shè)-甲基核糖基代替siRNA的種子序列的第二位置，進(jìn)行化學(xué)修飾，降低但非消除脫標(biāo)結(jié)合。已知有效的 RNAi所需的 dsRNA長度因昆蟲品種不同而變化。因此，這些脫靶/非靶標(biāo)影響雖不能阻礙 RNAi作為農(nóng)藥，但為了保護(hù)暴露的非靶標(biāo)生物，必須對(duì)各個(gè)生物進(jìn)行脫靶/非靶標(biāo)影響研究。

6 結(jié)語和展望

近年，已看到昆蟲、蠕蟲、病原菌和雜草中RNAi沉默的多個(gè)功能作用，已開發(fā)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)實(shí)踐。然而，如果要實(shí)現(xiàn)田間廣泛應(yīng)用，需要解決多個(gè)問題。目前的挑戰(zhàn)為確定可能應(yīng)用的最大程度，以及如何從研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為田間應(yīng)用。例如一個(gè)方法為開發(fā)微膠囊dsRNA，直接噴霧用于葉面防治毛蟲和鞘翅目昆蟲。此策略能增加dsRNA在環(huán)境中和被害蟲吸收期間的穩(wěn)定性。大量生產(chǎn)dsRNA(例如細(xì)菌、ARC、植物和合成生產(chǎn))的經(jīng)濟(jì)有效的方法正在被開發(fā)，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)將有助于降低成本。

dsRNA可被量身定做為作用于調(diào)節(jié)單個(gè)靶標(biāo)品種或一組相關(guān)品種的基因表達(dá)的途徑，不影響有益和其他非靶標(biāo)品種。此高度特異性是 RNAi的獨(dú)特特征，遠(yuǎn)超過目前市場(chǎng)上作物保護(hù)策略的特異性，這是其主要優(yōu)勢(shì)之一。在以后幾年，作物保護(hù)者可能會(huì)首次擁有高特異性和環(huán)境安全的策略，可大規(guī)模和小面積應(yīng)用，適宜用于有機(jī)和非有機(jī)種植，成本低，可用于管理害蟲和植物病害。

確定靶標(biāo)是 RNAi用于作物保護(hù)的重要一步。搜索在暴露于 dsRNA后導(dǎo)致害物死亡的靶標(biāo)是困難的，特別是如果害物不是已建立的實(shí)驗(yàn)室生物/模式昆蟲和/或如果沒有得到有關(guān)害物的充足的基因組工具和資源。昆蟲基因組學(xué)一直提供數(shù)量不斷增長的序列數(shù)據(jù)，由此就可快速確定潛在的靶標(biāo)。目前，(2017年9月4日)對(duì)280個(gè)主要為昆蟲的脊椎動(dòng)物基因組和1 000個(gè)真菌基因組的測(cè)序或已完成或在進(jìn)行中，大部分基因組可在生物技術(shù)信息Entrez基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫的國家中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)免費(fèi)獲取。雖然數(shù)據(jù)序列有用，但只有數(shù)據(jù)序列還不充足，因此主要采用主動(dòng)數(shù)據(jù)挖掘、RNAi 篩選分析和功能喪失型基因的篩選。例如，F(xiàn)LIGHT (http://flight. icr.ac.uk/)和 DRSC(http://www.flyrnai.org/)是在線數(shù)據(jù)庫，含有活體果蠅高通量篩選和離體 RNAi篩選數(shù)據(jù)。相似地，iBeetle-Base (http://ibeetle-base.unigoettingen.de)數(shù)據(jù)庫可用于搜索對(duì)赤擬谷盜(Tribolium castaneum)進(jìn)行大規(guī)模RNAi篩選(約5 000個(gè)基因)所得到的 RNAi表現(xiàn)型。使用此數(shù)據(jù)庫可為作物保護(hù)科學(xué)家提供發(fā)現(xiàn)假定靶標(biāo)的起點(diǎn)，然后必須以對(duì)靶標(biāo)品種的研究以證實(shí)。對(duì)于還沒有獲得基因組的昆蟲，RNA測(cè)序等其他技術(shù)是費(fèi)用承擔(dān)得起的篩選最佳RNAi靶標(biāo)的方法。此外，把靶標(biāo)縮小為一個(gè)單獨(dú)品種或一組相關(guān)害物品種(例如毛蟲或刺吸式昆蟲)而對(duì)有益生物和傳粉昆蟲沒有影響的能力也很有趣。軟件LAST (http://last.cbrc.jp/)被設(shè)計(jì)比較大的序列數(shù)據(jù)庫(例如整個(gè)昆蟲基因組/轉(zhuǎn)錄物組)。因此，通過比較靶標(biāo)和非靶標(biāo)品種數(shù)據(jù)庫，可能排除非靶標(biāo)品種的直系同源的可能性。LAST發(fā)現(xiàn)基于多樣性而不是固定長度(例如BLAST使用11-mers)的最初匹配，是比較較多序列與基因組間同源性較好的方法。筆者相信這些工具能有助于確定特異性和敏感靶標(biāo)，設(shè)計(jì)作物保護(hù)RNAi技術(shù)。

如上面所指出，確定重要靶標(biāo)基因非常重要，因此表達(dá)水平的細(xì)微或短暫變化對(duì)靶標(biāo)品種有嚴(yán)重的影響。這對(duì)于避免主要是濃度依賴型脫靶效應(yīng)也重要，如上面對(duì)環(huán)境影響一節(jié)中所討論的。不考慮靶標(biāo)生物的情況下，作物保護(hù)的RNAi策略需要持續(xù)供應(yīng)RNA分子。轉(zhuǎn)基因植物能容易持續(xù)產(chǎn)生需要的dsRNA。研究表明轉(zhuǎn)基因植物發(fā)夾dsRNA能夠表達(dá)，但對(duì)每個(gè)靶標(biāo)品種并不實(shí)用，例如多年生植物(例如柑橘和咖啡)，可能需要數(shù)年來開發(fā)和商業(yè)化。目前，正在努力使用天然產(chǎn)生的昆蟲或植物病毒/細(xì)菌來開發(fā)共生體介導(dǎo)的RNAi方法。通過引入dsRNA結(jié)構(gòu)到致病力減弱或無致病力的病毒基因組中來獲得。對(duì)于昆蟲來說，共生體中腸細(xì)菌能有效引起寄主體內(nèi)的 RNAi。當(dāng)修飾的天然存在的病毒/細(xì)菌發(fā)生侵染，這將是RNAi啟動(dòng)分子的持續(xù)來源。