孟文 王聞哲 孟靖飛 馮興 江洪 王宇 王效舉

肺癌是嚴重影響人群生命健康的惡性腫瘤之一[1]，肺腺癌是肺癌主要的病理類型。盡管針對肺癌的治療已有長足的進步，但目前其5年生存率仍然較差[2]。發(fā)現(xiàn)有效的肺癌標志物，從而篩選出肺癌手術后的高危患者，及時采取有效的治療措施，對延長手術后患者生存期有重要意義。Ubiquilin 1蛋白是泛素樣蛋白，可以介導錯誤折疊蛋白的降解，參與一些病理生理過程[3]。本研究探討肺腺癌中Ubiquilin 1蛋白的表達與臨床病理特征的關系，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 由國家人類遺傳資源共享服務平臺提供并制作的肺腺癌組織芯片，為2004年7月至2009年6月90例肺腺癌手術切除的標本，男49例，女41例，年齡30～84（62.4±9.9）歲。其中根治性手術 79 例，非根治性手術8例，手術方式不詳3例。平臺編號：2005DKA21300；實驗編號：13939；陣列編號：HLug-Ade180Sur-01；分析點數(shù)：180，包括90例患者肺腺癌組織點和配對癌旁正

常組織點。組織芯片樣點包括肺腺癌癌區(qū)域及配對正常癌旁組織（距腫瘤＞3.0cm），均經(jīng)病理檢查證實。病理分期根據(jù)肺癌第七版TNM分期。生存時間從手術結束時間開始計算，隨訪時間5～10年。另選擇杭州市第一人民醫(yī)院2012年1月至2014年6月因肺結節(jié)住院手術的患者17例作為對照，手術后診斷均為肺良性病變，包括肺錯構瘤7例，肺肉芽腫性變4例，硬化性血管瘤2例，炎性假瘤4例。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院倫理學委員會同意，所有患者均知情同意并填寫知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色及分析 所用抗體Anti-Ubiquilin1購于杭州麥通生物技術有限公司（Abcam公司，目錄號：ab128011）。應用免疫組化Envision二步法完成免疫組化實驗，抗體的稀釋度：1∶1 500。兩位病理醫(yī)師獨自做出判斷,對于有異議或疑難病例，由上級醫(yī)師會診，做出最終診斷。定位判定：細胞質、細胞膜、細胞核。染色強度的判定：在低倍鏡下對整個視野進行觀察，將染色強度分為4級：0分：細胞無染色；1分：輕度染色，淡黃色；2分：中度染色，棕黃色；3分：強染色，棕褐色。選取3個不同的染色強度視野，在高倍鏡下分別估算其陽性率，取其平均值，將染色比例分為5級：0分：陽性細胞數(shù)＜5%；1分：5%～25%的陽性細胞；2分：26%～50%的陽性細胞；3分：51%～75%的陽性細胞；4分：≥76%的陽性細胞。表達水平=染色強度分數(shù)+染色比例分數(shù)。表達水平0～3為低表達，4～7為高表達。

1.2.2 觀察指標 （1）應用免疫組化的方法對組織芯片進行Ubiquilin1蛋白染色，判斷癌組織及癌旁組織之間的表達差異。（2）分析肺腺癌Ubiquilin1蛋白的高表達與性別、年齡、腫瘤大小、癌的分化分級、淋巴結轉移、TNM分期、癌旁Ubiquilin1蛋白高表達、5年生存率、表皮生長因子受體（EGFR）狀態(tài)的關系。（3）分析癌旁U-biquilin1蛋白的高表達、癌的高表達、性別、年齡、腫瘤大小、癌的分化分級、淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤的位置與生存的關系。（4）分析癌及癌旁Ubiquilin1蛋白表達與生存的關系。（5）對17例肺良性疾患的組織切片進行Ubiquilin1蛋白染色，分析其表達，并與肺腺癌及癌旁表達比較。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。肺腺癌及配對癌旁之間的Ubiquilin 1蛋白的表達差異應用paired Wilcoxon檢驗。Ubiquilin 1蛋白的表達與臨床病理的關系采用χ2檢驗。多因素Cox回歸模型分析對預后有意義的因素，采用Kaplan-Meier的方法繪制生存曲線，并采用Log-nank統(tǒng)計檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌和癌旁中Ubiquilin 1蛋白表達的比較 在芯片制作過程中發(fā)生脫片2例，故在隨后的研究中刪除此2例，共計88例。典型病例結果見圖1-3（插頁）。

由圖1-3可見，典型病例1患者肺腺癌及癌旁均可見Ubiquilin 1蛋白高表達。典型病例2患者肺腺癌高表達，癌旁低表達。典型病例3肺腺癌及癌旁均可見低表達。陽性染色位于細胞質，細胞膜及細胞核無染色。88例腺癌組織中,高表達60例（68.2%），而配對癌旁高表達僅為26例（29.5%）。兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-5.831，P＜0.01）。17例肺良性病變患者中，高表達3例（17.6%），其中肺錯構瘤2例，炎性肉芽腫陽性1例，高表達率與肺腺癌高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.160，P＜0.01），與癌旁高表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.502，P=0.479）。

2.2 肺腺癌Ubiquilin 1蛋白表達與臨床病理特征關系隨訪過程中，EGFR表達信息不全7例，淋巴結轉移信息不全3例，病理分期結果缺失4例，肺腺癌組織中U-biquilin 1蛋白表達與臨床病理特征關系見表1。

由表1可見，肺腺癌高表達與配對癌旁高表達及5年生存率相關（P＜0.01）。但與性別、年齡、腫瘤大小、癌的分化分級、淋巴結轉移、TNM分期、EGFR表達均無關（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌的生存分析 見表2、圖4。

由表2可見，肺癌中高表達、癌旁中高表達、TNM分期、性別、癌的分化分級是回歸模型篩選出來的預后因子，其中，肺癌中高表達、癌旁中高表達、TNM分期、性別是統(tǒng)計學有意義的預后指標（P＜0.05）。

由圖4可見，肺癌高表達及癌旁高表達均與不良預后有關（P＜0.000）。

3 討論

Ubiquilin1蛋白與肺腺癌的關系目前還未定論。目前對該蛋白結構的研究發(fā)現(xiàn)，其包含了泛素樣（UBL）區(qū)域、泛素相關（UBA）區(qū)域、多個熱休克伴侶（STI）區(qū)域，Ubiquilin 1蛋白通過UBA區(qū)域與泛素化蛋白相互作用，通過UBL區(qū)域與蛋白酶體相互作用[4-6]。因此，其可以在泛素化蛋白和蛋白酶體之間充當“橋梁”作用，促進泛素化蛋白的降解，通過這種機制參與多種病理或生理過程。Beverly等[3]研究顯示，Ubiquilin1蛋白能與抗凋亡基因BCL2編碼的BCLb相互作用，促進BCLb多個位點的泛素化，這對保持BCLb的穩(wěn)定性有重要意義，所以其在抗凋亡過程中起重要作用。Funakoshi等[7]報道，非洲爪蟾Ubiquilin 1同源基因XDRP1，與cyclinA（A1和A2）結合，有阻止爪蟾胚胎細胞進一步分化的作用。Ubiquilin 1還可與腫瘤抑制蛋白DAN和S蛋白相互作用，調整DNA合成，進而影響細胞分化。Ubiquilin 1與腫瘤作用機制研究愈來愈引起人們的興趣，但詳細的作用機制仍需進一步深入研究。

表1 肺腺癌Ubiquilin 1蛋白的高表達與臨床特征病理關系

少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌Ubiquilin 1 mRNA水平較正常對照顯著增高[3，8]。Chen 等[8]應用 Western blot的方法，對9例肺腺癌和配對癌旁組織的比較發(fā)現(xiàn)：Ubiquilin 1蛋白水平在肺腺癌中高于癌旁正常對照，血清Ubiquilin 1自身抗體對肺腺癌的診斷起重要作用[8-11]。所以，先前的研究提示Ubiquilin 1很可能參與了肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，Ubiquilin 1蛋白可能與肺腺癌的臨床病理存在著某種重要的聯(lián)系。

表2 肺腺癌預后變量分析

圖4 Kaplan-Meier曲線分析Ubiquilin1蛋白表達與預后的關系（a:肺腺癌組織中Ubiquilin1蛋白高表達與低表達的比較；b:肺腺癌癌旁組織Ubiquilin1蛋白高表達與低表達的比較）

本研究發(fā)現(xiàn)：肺腺癌組織中Ubiquilin 1蛋白的表達主要位于細胞質，并且高于配對的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義，Ubiquilin 1在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中充當重要的角色，而其具體的作用位置可能就在細胞質。關于Ubiquilin 1與預后的研究，Beverly在其基因水平，對少數(shù)肺腺癌患者進行了初步的研究，Beverly等[3]研究了19例低表達的肺癌患者以及19例高表達肺癌患者發(fā)現(xiàn)高表達患者的預后較差。該項研究通過組織芯片技術（TMA）對88例肺腺癌與長期預后的關系（5～10年）研究，發(fā)現(xiàn)Ubiquilin 1在蛋白水平亦與長期不良預后相關。Ubiquilin 1蛋白高表達與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移狀態(tài)、EGFR表達狀態(tài)無關。該研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌高表達Ubiquilin 1、腫瘤分期是肺腺癌生存模型中有統(tǒng)計學意義的因素。因此，Ubiquilin 1可以作為肺腺癌手術后潛在的重要預測因子，對于篩選手術后高?；颊呖赡苡兄匾难a充意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ubiquilin 1蛋白在癌旁中的高表達與肺腺癌不良預后有關，提示Ubiquilin 1在肺腺癌癌旁微環(huán)境中可能扮演重要角色。癌旁組織中的高U-biquilin 1對于肺腺癌的生長及進展起促進作用。另外一項研究提示Ubiquilin 1在腫瘤發(fā)生過程中起調節(jié)作用，具有抑制遷移及非小細胞肺癌細胞的上皮間質轉化的作用[12]。所以，Ubiquilin 1在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中所充當?shù)慕巧赡芟喈攺碗s，仍需進一步研究。

綜上所述，本研究較為系統(tǒng)地研究了Ubiquilin 1與肺腺癌臨床病理、預后的關系，隨訪時間較長，達到5～10年。研究證明肺腺癌及癌旁正常高表達U-biquilin 1蛋白與不良預后有關，其可以作為潛在的評價預后指標，指導肺腺癌的手術后治療。Ubiquilin 1與肺腺癌之間的具體作用機制，仍需進一步研究。

圖1 典型病例1的HE染色結果及免疫組化染色結果（a:腺癌組織，HE染色，×35；b：癌旁組織，HE染色，×35；c：腺癌組織，免疫組化染色，×35；d：癌旁組織，免疫組化染色，×35）

圖2 典型病例2的HE染色結果及免疫組化染色結果（a:腺癌組織，HE染色，×35；b：癌旁組織，HE染色，×35；c：腺癌組織，免疫組化染色，×35；d：癌旁組織，免疫組化染色，×35）

圖3 典型病例3的HE染色結果及免疫組化染色結果（a:腺癌組織，HE染色，×35；b：癌旁組織，HE染色，×35；c：腺癌組織，免疫組化染色，×35；d：癌旁組織，免疫組化染色，×35）