劉慶菊，何裕建，吳 麗，李向軍

(中國科學院大學化學科學學院， 北京 101408) (2017年3月20日收稿； 2017年5月16日收修改稿)

由于具有真核細胞生命活動的基本特征，又具有微生物實驗過程中的優(yōu)勢，如樣品易得、生長周期短、易于操作等；因此，釀酒酵母(S.cerevisiae)是一種理想生物研究模型[1, 3]。實驗研究表明營養(yǎng)和環(huán)境因素的刺激能夠誘導發(fā)酵中的酵母產(chǎn)生ROS。與此同時，酵母細胞具有一系列應對ROS的酶和非酶系統(tǒng)[4-5]。

食品中大多數(shù)氨基酸是以L-氨基酸的形式存在。作為肽鏈和蛋白質(zhì)的合成原料，L-氨基酸是生物體內(nèi)的關(guān)鍵代謝中間體[6]。然而，研究表明食品中存在著大量的D-氨基酸。食品中的D-氨基酸來自食品加工過程及微生物代謝[7-9]。由于其結(jié)構(gòu)的相似性，D-氨基酸能夠模擬L-氨基酸的細胞功能，抑制細胞生長[10]。事實上，大量研究對D-氨基酸對細胞生長的抑制作用進行了報道[11-13]。生物體內(nèi)，D-氨基酸的代謝是由消旋酶/異構(gòu)酶和D-氨基酸氧化酶/D-天冬氨酸氧化酶來完成的[14]。作為D-氨基酸的主要代謝途徑，D-氨基酸氧化酶/D-天冬氨酸氧化酶能夠?qū)-氨基酸的氨基氧化生成相應的α-酮酸、NH3和H2O2[15]。而H2O2是一種常見的ROS。

綜上所述，盡管研究者們對D-氨基酸進行了大量研究，但是D-氨基酸細胞毒性的分子機制的研究仍然缺乏。D-氨基酸誘導的酵母細胞中活性氧的累積和清除，及其對細胞組分的損傷并未見報道。因此，本文研究D-氨基酸的生物化學毒性。我們檢測活性氧的含量、脂質(zhì)過氧化程度、抗氧化酶的活性及抗氧化物的含量以評估D-氨基酸氧化酶的細胞毒性。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

實驗所用的試劑是分析純。所有溶液用超純水配制。葡萄糖購自北京化工廠，YNB(無氨基酸酵母氮源)購自BD Difco，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，酵母抽提物和胰蛋白胨購自OXID。所有的氨基酸購自J&K Chemical。還原型谷胱甘肽、NADPH和谷胱甘肽還原酶(GR)購自北京索萊寶公司。其他試劑從Macklin公司購買。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

ATCC4126酵母菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基(10 g/L酵母抽提物; 20 g/L胰蛋白胨; 20 g/L葡萄糖)中培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)到指數(shù)生長期。將指數(shù)生長期的菌液接種到含有不同濃度L-氨基酸和D-氨基酸的合成培養(yǎng)基(6.7 g/L YNB和20 g/L glucose)上培養(yǎng)。所有的培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌20 min。葡萄糖115 ℃下單獨滅菌20 min后加入。L-氨基酸和D-氨基酸用0.25 μm濾膜(Sartorius Stedim Biotech S.A., Aubagne, France)過濾后加入到培養(yǎng)基中。細胞置于搖床(30 ℃，200 rpm，SPH-110A)中培養(yǎng)24 h后收集酵母細胞，測定600 nm處的吸光度。

菌液離心(4 ℃，12 000 g)10 min后收集細胞，用滅菌水沖洗細胞兩次，低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 H2O2含量測定

H2O2的檢測方法參照文獻[16]。將細胞懸浮在2.5 mL相對體積質(zhì)量為3%的三氯乙酸溶液中，破碎，離心(4 ℃，12 000 g)10 min后，將1 mL上清液加入到1 mL磷酸緩沖溶液中，加入2 mL 1 mol/L碘化鉀。測定390 nm處的吸光度，根據(jù)之前測得標準曲線計算H2O2的含量。

H2O2含量(nmol·mg-1·min-1)=

1.5 脂質(zhì)過氧化分析

脂質(zhì)過氧化水平是通過檢測MDA的生成量完成的[1]。將細胞懸浮在相對體積質(zhì)量為10%的三氯乙酸中，超聲破碎，保護溫度為4 ℃。離心(4 ℃，12 000 g)10 min后，向上清中加入同等體積相對體積質(zhì)量為0.5%的硫代巴比妥酸。樣品沸水浴15 min后，迅速置于冰上終止反應。冷卻后，分別記錄450、532和600 nm處的吸光度。 MDA的濃度表示為nmol·g-1FW。

式中：A450為450 nm處的吸光度；A532為532 nm處的吸光度；A600為600 nm處的吸光度；Vt(mL)為總體積；Vs(mL)為樣品體積；FW為細胞鮮重。

1.6 抗氧化酶活性測定

細胞重懸于含1 mmol/L EDTA和1% PVP的磷酸緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.8)中，超聲破碎。離心(4 ℃，12 000 g)10 min后，上清即為粗酶液。蛋白質(zhì)含量的測定是采用Bradford法，用牛血清白蛋白作為標準。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用的是鄰苯三酚自氧化法[17]。向5.0 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L, pH 8.1)加入100 μL酶提取液后，25 ℃孵育20 min。向反應體系加入100 μL鄰苯三酚(8.14 mmol/L，用鹽酸溶解)，迅速混勻后，記錄3 min內(nèi)間隔30 s的325 nm處的吸光度。一個SOD活力單位(U)定義為SOD自氧化抑制率為50%時，所對應的SOD量，表示為U·mg-1·FW-1。

SOD活性(U·mg-1·FW-1)=

過氧化氫酶(CAT)活性檢測采用的是鉬酸銨比色法[18]。含1 mL 60 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)，1 mmol/L H2O2和0.2 mL粗酶液的反應體系25 ℃孵育1 min后，加入1.0 mL 32.4 mmol/L鉬酸銨，定容到10 mL后測定405 nm處的吸光度。

CAT活性(U·mg-1·min-1)=

過氧化物酶(POD)活性的檢測采用的是愈創(chuàng)木酚法[19]。向含有0.02 mL愈創(chuàng)木酚和0.01 mL過氧化氫和磷酸緩沖溶液(pH 7.0)的3 mL反應體系中加入0.02 mL的酶提取液，記錄5 min之內(nèi)470 nm處的吸光度。

POD活性(U·mg-1·min-1)=

1.7 抗氧化劑含量測定

細胞重懸于含5% 三氯乙酸溶液，離心(4 ℃，12 000 g)10 min后進行抗壞血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量的測定。

ASA含量的測定采用之前報道的方法[20]。反應體系(3 mL)含200 mmol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH 4.75)，200 μL上清液，0.75 mL 100 mg/L FeCl3，1 mL相對體積質(zhì)量為1%的2, 2-聯(lián)吡啶和0.5 mL相對體積質(zhì)量為1%的NaF。37 ℃反應1 h后測定525 nm處的吸光度，根據(jù)之前建立好的標準曲線計算樣品中ASA的含量。

還原型谷胱甘肽含量采用Teare報道的方法[21]。1 mL的反應體系中包含磷酸緩沖溶液(100 mmol/L，pH 7.4)100 μL上清液，50 μL 0.1 mmol/L DTNB，100 μL NADPH(10 mg/mL)，50 μL 1 U/μL谷胱甘肽還原酶。30 ℃反應10 min后測定412 nm處的吸光度，根據(jù)之前建立好的標準曲線計算樣品中GSH的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-氨基酸的細胞毒性

為了評估D-氨基酸對酵母細胞生長的影響，酵母細胞在含有不同濃度純L-氨基酸和D-氨基酸的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。如圖1所示，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的L-氨基酸和D-氨基酸，酵母細胞的生長出現(xiàn)了很大的差異。對L-精氨酸和D-精氨酸而言，隨著濃度的改變，酵母細胞的生長沒有出現(xiàn)明顯的改變。L-谷氨酸對酵母細胞的生長有輕微的促進作用，而D-谷氨酸濃度的增加會對細胞的生長產(chǎn)生較強的抑制作用。與對照相比，隨著L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺濃度的增加，二者都能夠明顯地抑制酵母細胞生長的生長，并且D-谷氨酰胺的抑制作用要遠遠強于L-谷氨酰胺?？偠灾瑢嶒灲Y(jié)果表明與L-氨基酸相比，D-氨基酸能夠明顯抑制細胞的生長。

圖1 L-氨基酸和D-氨基酸對酵母細胞生長的影響Fig.1 Effects of L-and D-amino acids on cell growth of Saccharomyces cerevisiae

圖2顯示培養(yǎng)基中含10 mmo/L L-氨基酸和D-氨基酸中酵母細胞的生長情況。與對照相比，丙氨酸、絲氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的L-構(gòu)型和D-構(gòu)型對細胞生長的影響差異微小。天冬氨酸、天冬酰胺和亮氨酸的L-異構(gòu)體和D-異構(gòu)體略有差別(小于20%)：L-異構(gòu)體略微改善細胞生長而D-異構(gòu)體明顯抑制細胞生長。L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-色氨酸、L-組氨酸和L-纈氨酸能夠顯著促進細胞生長(與對照組相比提高10%)，而在含有其對映異構(gòu)體的培養(yǎng)基中，酵母細胞的數(shù)量則急劇減少(與對照組相比降低30%)。值得一提的是，L-賴氨酸和D-賴氨酸中，OD600分別下降到0.04和0.03。出乎意料的是，L-半胱氨酸和D-半胱氨酸培養(yǎng)后細胞的OD600分別為0.112和1.868，這表明L-半胱氨酸對酵母細胞的生長具有極強的抑制作用。通過以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對于大多數(shù)氨基酸而言，L-氨基酸對細胞的生長有益，而D-氨基酸對細胞生長有害。

圖2 L-氨基酸和D-氨基酸(10 mmol/L)對 酵母細胞生長的影響Fig.2 Effects of L-amino acid and D-amino acid (10 mmol/L) on the growth of Saccharomyces cerevisiae

2.2 D-氨基酸對細胞內(nèi)累積和H2O2含量的影響

圖3 L-氨基酸和D-氨基酸(10 mmol/L)對酵母細胞內(nèi)和H2O2(b)含量的影響Fig.3 Effects of L-amino acid and D-amino acid (10 mmol/L) on the contents of (a) and H2O2 (b) in Saccharomyces cerevisiae

2.3 D-氨基酸對脂質(zhì)過氧化的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物，能夠反映ROS導致脂質(zhì)氧化損傷的程度[4]。10 mmol/L L-氨基酸和D-氨基酸培養(yǎng)后細胞內(nèi)的丙二醛含量見圖4。L-氨基酸處理組的丙二醛含量與對照組無顯著差異。然而，隨著D-氨基酸濃度的增加，酵母細胞內(nèi)的丙二醛含量逐漸增加。以天冬氨酸為例，L-天冬氨酸組的丙二醛含量(mmol·g-1·FW)為6.30，而D-天冬氨酸組的丙二醛含量則飆升到28.73。這表明D-氨基酸導致細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度增加。生理條件下，抗氧化系統(tǒng)能夠通過清除ROS減少氧化損傷帶來的危害，但是過量的未被及時清除的H2O2能夠損傷細胞膜上的脂質(zhì)[25]。由于含有大量不飽和脂肪酸，并且疏水膜對氧原子的高溶解性，因此，膜磷脂最易受到自由基攻擊[26]。

圖4 L-氨基酸和D-氨基酸(10 mmol/L)對酵母細胞內(nèi) 脂質(zhì)過氧化水平的影響Fig.4 Effects of L-amino acid and D-amino acid (10 mmol/L) on the level of lipid peroxidation in Saccharomyces Cerevisiae

2.4 抗氧化酶活性

細胞內(nèi)存在酶系統(tǒng)來減緩活性氧的損害，維持細胞正常的氧化還原狀態(tài)。已知在活性氧消除中具有重要作用的酶包括SOD、POD和CAT[27]。為了進一步評估細胞內(nèi)ROS的積累，我們對酵母細胞內(nèi)這些酶的活性進行檢測。

盡管L-構(gòu)型與D-構(gòu)型之間存在差異，大多數(shù)氨基酸培養(yǎng)后細胞內(nèi)SOD活性與對照組差別不大。然而，L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-絲氨酸、L-組氨酸、D-精氨酸和D-蛋氨酸的加入改善了SOD的活性(圖5(a))。

與此相反，L-氨基酸和D-氨基酸處理后，酵母細胞內(nèi)CAT的活性差異很大。與SOD不同，D-氨基酸培養(yǎng)后酵母細胞內(nèi)CAT活性比L-氨基酸培養(yǎng)強得多(圖5(b))。D-氨基酸處理后CAT的活性大大增強。

圖5 L-氨基酸和D-氨基酸(10 mmol/L)對酵母細胞內(nèi)SOD(a), CAT(b)和POD(c)活性的影響Fig.5 Effects of L-amino acid and D-amino acid (10 mmol/L) on activities of SOD (a), CAT (b), and POD (c) in Saccharomyces Cerevisiae

更為有趣的是，D-氨基酸處理后細胞內(nèi)POD的活性變化與CAT活性變化趨勢相似。L-氨基酸處理組POD的活性沒有增強(圖5(c))。D-氨基酸處理組POD的活性顯著高于L-氨基酸組，這表明D-氨基酸激活POD的活性。

CAT和POD活性增加，SOD活性未增加，這暗示D-氨基酸誘導釀酒酵母細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS的主要類型是H2O2。CAT和POD活性的增加可能是由于含量猛增的H2O2將其激活。

2.5 抗氧化劑含量

ASA是一種水溶性的可食用抗氧化劑，在抵御活性氧中起到至關(guān)重要的作用[28-29]。GSH也能夠抵御ROS引起的氧化損傷[30]。此外，ASA和GSH能夠通過ASA-GSH循環(huán)的協(xié)同作用來消除活性氧[16]。為此，我們比較氨基酸處理后細胞內(nèi)這兩種抗氧化劑的含量(見圖6)。 除蘇氨酸、賴氨酸和半胱氨酸外，L-氨基酸和D-氨基酸處理后細胞內(nèi)ASA的含量都與對照組差別不大。經(jīng)10 mol/L賴氨酸處理后，ASA的含量隨著L-賴氨酸濃度的增加而升高。L-半胱氨酸處理后，ASA含量明顯增加。同樣地，GSH含量變化與ASA趨勢相似。即便將氨基酸濃度增加到10 mmol/L，GSH含量也未顯著增加。賴氨酸處理后細胞內(nèi)的ASA和GSH含量增加可能是因為培養(yǎng)基中賴氨酸含量的增加激活了賴氨酸羥化酶，而ASA是它的輔酶[31]，因而ASA含量隨之增加；ASA是一種強還原劑，可以使氧化型的GSH轉(zhuǎn)變成為還原型GSH，因而導致GSH含量增加。L-半胱氨酸是ASA的穩(wěn)定劑，二者之間存在協(xié)同效應[32]，因此培養(yǎng)基中L-半胱氨酸含量的增加導致ASA含量的增加。有文獻報道，向培養(yǎng)基中添加L-半胱氨酸能夠增加酵母細胞中GSH的含量[33]，因此L-半胱氨酸處理后的細胞中GSH含量增加。

基于以上實驗結(jié)果，為進一步闡明各個生物標記物之間的關(guān)聯(lián)，圖7給出實驗所選用生物標記物之間的關(guān)系。

圖6 L-氨基酸和D-氨基酸(10 mmol/L)對酵母細胞內(nèi)ASA(a)和GSH(b)含量的影響Fig.6 Effects of L-amino acid and D-amino acid (10 mmol/L) on the contents of ASA (a) and GSH (b) in Saccharomyces Cerevisiae

圖7 實驗所用生物標記物之間的關(guān)系Fig.7 Relationships among these biomarkers used in this study

3 總結(jié)

ROS是細胞代謝的副產(chǎn)物。環(huán)境的改變能夠引起細胞內(nèi)ROS含量的改變。本研究中，采用釀酒酵母為模型生物研究D-氨基酸的細胞毒性及其誘導的ROS累積。發(fā)現(xiàn)D-氨基酸能夠抑制細胞的生長。低濃度時，抑制現(xiàn)象不明顯，當濃度增加時，抑制作用增強。此外，高濃度D-氨基酸培養(yǎng)的細胞內(nèi)H2O2的含量增加，伴隨抗氧化酶活性的激活，特別是CAT和POD。生物體內(nèi)的活性氧可以被抗氧化酶和抗氧化劑清除，使活性氧的水平維持正常。然而，當活性氧水平達到閾值，能夠引起氧化損傷。因此我們認為氧化損傷是D-氨基酸毒性的主要機制。