吳曉雯 龐婕 孫增先

中圖分類號 R944 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）12-1673-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.12.20

摘 要 目的：考察鹽酸西那卡塞片的體外溶出行為和體內藥動學過程，并進行體內外相關性（IVIVC）評價。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），測定鹽酸西那卡塞片在8種溶出介質[pH 1.2鹽酸溶液、pH 2.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液、水、人工胃液（SGF）、飽腹人工腸液（FeSSIF）、空腹人工腸液（FaSSIF）]中的累積溶出度（Q），并繪制溶出曲線。采用HPLC-質譜聯(lián)用法測定鹽酸西那卡塞片的血藥濃度；選擇12名健康男性受試者，在空腹或飽腹（高脂食物）狀態(tài)下單劑量口服鹽酸西那卡塞片75 mg，測定給藥前（0 h）與給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h時的血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時間曲線。采用DAS 3.0軟件計算飽腹組受試者體內累積吸收百分數（F），并與該制劑相應時間點的體外Q值作線性回歸，進行IVIVC評價。結果：鹽酸西那卡塞片在8種溶出介質中的溶出曲線存在較大差異；空腹組和飽腹組受試者的AUC0→t、AUC0→∞和cmax組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明高脂食物對該制劑的體內藥動學過程有明顯影響；該制劑在飽腹組受試者體內的F值與其體外在FeSSIF中的Q值的相關系數最高（0.977 9），表明存在良好的IVIVC（A級）。結論：鹽酸西那卡塞片在FeSSIF中（槳法，50 r/min）的體外溶出行為與其體內藥動學過程存在良好的相關性，可用于預測該制劑在體內的釋放和吸收情況。

關鍵詞 鹽酸西那卡塞片；溶出度；藥動學；體內外相關性

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the in vitro dissolution behavior and in vivo pharmacokinetics of Cinacalcet hydrochloride tablets， and to evaluate its in vivo-in vitro correlation （IVIVC）. METHODS： HPLC method was adopted to determine the accumulative dissolution（Q） of Cinacalcet hydrochloride tablets in 8 kinds of medium [pH 1.2 hydrochloric acid solution， pH 2.0 hydrochloric acid solution， pH 4.5 acetate buffer solution， pH 6.8 phosphate buffer solution， water， artificial gastric fluid （SGF）， full belly artificial intestinal fluid （FeSSIF）， fasting artificial intestinal fluid （FaSSIF）]， and the dissolution curves were drawn. HPLC-MS method was used to determine the blood concentrations of Cinacalcet hydrochloride tablets. A total of 12 healthy male volunteers were selected and given single oral dose of Cinacalcet hydrochloride tablets 75 mg under the state of fasting or satiety （high-fat food）. The blood concentration of cinacalcet hydrochlorid was determined before medication （0 h） and 0.5， 1， 2， 3， 4， 6， 8， 12， 24 h after medication. Average blood concentration-time curves were drawn. The in vivo accumulative absorption percentage （F） of satiety group was calculated by using DAS 3.0 software. Linear regression of F with in vitro Q was carried out to analyze its IVIVC. RESULTS： There was great difference among dissolution curves of Cinacalcet hydrochloride tablets in 8 kinds of dissolution mediums. There were differences of AUC0→t， AUC0→∞ and cmax between fasting group and satiety group， with statistical significance （P<0.05）， showing high-fat food had significant effect on in vivo pharmacokinetics. Correlation coefficient of in vivo F in satiety group with in vitro Q of the tablets in FeSSIF was highest （0.977 9）， manifesting good IVIVC （class A）. CONCLUSIONS： The in vitro dissolution behavior of Cinacalcet hydrochloride tablets in FeSSIF （paddle method，50 r/min） is well associated with its in vivo pharmacokinetics， which can be used for predicting in vivo dissolution and absorption of the tablets.

KEYWORDS Cinacalcet hydrochloride tablets； Dissolution； Pharmacokinetics； in vivo-in vitro correlation

鹽酸西那卡塞（Cinacalcet hydrochloride）為第二代擬鈣劑，主要用于治療慢性腎病透析患者的繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進[1]。該藥于2004年首次由美國FDA批準上市，現已在日本、歐盟、加拿大、中國等30多個國家/組織批準上市，2016年其全球銷售額超過10億美元，市場空間巨大[2]。鹽酸西那卡塞的化合物專利已于2013年到期，現國內多家企業(yè)的仿制藥正處于臨床研究和申報臨床研究的階段[3]。目前有關該藥的文獻主要集中在合成工藝、含量及有關物質測定和制劑研究方面[4-6]，未見其體內外相關性（in vivo-in vitro correlation，IVIVC）報道。鹽酸西那卡塞屬于生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）2類藥物，具有良好的膜通透性，可能存在良好的IVIVC[7]。為降低鹽酸西那卡塞片的仿制藥開發(fā)風險、進一步提高其人體生物等效性，本研究以進口的鹽酸西那卡塞片為研究對象，進行體外溶出行為和體內藥動學研究，并開展該藥的IVIVC評價，為其仿制制劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司，包括二元泵、自動進樣器、二級管陣列檢測器、液相色譜工作站，用于體外溶出行為研究）；1200/6100型HPLC串聯(lián)質譜（MS）儀（美國Agilent公司，包括1200型HPLC系統(tǒng)、6100型MS檢測器，用于體內藥動學研究）；VK7000型溶出度測試儀（美國瓦里安公司）；SevenMulti型pH計、XS105DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TG16-WS型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；SK3310HP型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；SI-0266型渦旋混合儀（美國Scientific Industries公司）。

1.2 藥品、試劑及血漿

鹽酸西那卡塞片（日本協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社，批號：EK13，規(guī)格：75 mg）；鹽酸西那卡塞對照品[我院藥學部自制，純度（化學滴定法）：99.6%]；芬地林對照品（內標，上海陶術生物科技有限公司，批號：T0327-1，純度：99.5%）；人工胃液（SGF）、飽腹人工腸液（FeSSIF）、空腹人工腸液（FaSSIF）粉末（英國Biorelevant公司，批號分別為：01-1608-02、03-1606-06、02-1408-19，市售生化級）；乙腈、三氟乙酸均為色譜純（美國Tedia公司）；其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

血漿采集于參與本研究的健康受試者。

2 方法與結果

2.1 鹽酸西那卡塞片的體外溶出行為研究

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：36 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（用三乙胺調節(jié)pH至6.5）-乙腈（30 ∶ 70，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：283 nm；進樣量：10 μL。

2.1.2 專屬性試驗 取空白輔料溶液[按處方比例取空白輔料（由微晶纖維素、預膠化淀粉、交聯(lián)聚維酮、聚維酮K30等組成）14 mg，以水制成100 mL溶液，濾過，即得]、對照品溶液（精密稱取鹽酸西那卡塞對照品適量，以流動相制成80 μg/mL的溶液，即得）和供試品溶液（精密稱取鹽酸西那卡塞對照品適量，以空白輔料溶液制成80 μg/mL的溶液，即得）各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果表明，空白輔料對鹽酸西那卡塞的測定無干擾，本方法專屬性良好。

2.1.3 線性關系考察 精密稱取鹽酸西那卡塞對照品適量，用流動相制成900 μg/mL的對照品貯備液，再以流動相分別稀釋制成90、45、12.5、6.25、3.13、2.25 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以鹽酸西那卡塞質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程y=11 441x-129（r=0.999 6）。結果表明，鹽酸西那卡塞質量濃度在2.25～90 μg/mL范圍內與其峰面積線性關系良好，可滿足體外溶出度測定的要求。

2.1.4 準確度試驗 取“2.1.3”項下鹽酸西那卡塞對照品貯備液適量，以“2.1.2”項下空白輔料溶液為溶劑稀釋成低、中、高質量濃度（8、40、80 μg/mL，相當于溶出量的10%、50%、100%）的溶液，每個質量濃度平行制備3份，共9份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定并計算空白加樣回收率。結果，空白加樣回收率平均值為99.16%（RSD=1.21%，n=9），表明本方法準確度較好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.4”項下的高質量濃度（80 μg/mL）溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，并在同日內不同時間點和3 d內不同時間點分別進樣測定6次，記錄峰面積。結果，鹽酸西那卡塞峰面積的進樣精密度和日內、日間精密度RSD均小于2.0%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.7”項下溶出試驗1 h時的8種溶出介質中的溶出液各適量，濾過，于室溫下放置0、1、2、4、8、12、16、24 h時分別按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，鹽酸西那卡塞峰面積的RSD均未超過2.0%（n=8），表明在室溫下各介質溶出液放置24 h內的穩(wěn)定性良好。

2.1.7 溶出曲線繪制 參照文獻[8]，以2015年版《中國藥典》（四部）通則0931“槳法”，取鹽酸西那卡塞片6片進行溶出試驗。設置轉速為50 r/min，溶出介質溫度為（37.0±0.5）℃，分別采用pH 1.2鹽酸溶液、pH 2.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液、水、SGF、FeSSIF、FaSSIF等8種溶出介質各900 mL進行操作。分別于 5、10、15、30、45 min和1、1.5、2、3、4、5、6 h時取溶出液10 mL（同時立即補充等溫、等體積的溶出介質），經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1” 項下色譜條件測定鹽酸西那卡塞的含量并計算其累積溶出度（Q）的平均值（n=6），繪制溶出曲線，詳見圖2。

由圖2可見，在pH 2.0鹽酸溶液和pH 4.5醋酸鹽緩沖液中，鹽酸西那卡塞片在15 min內溶出完全；在pH 1.2鹽酸溶液和SGF中，其能在60 min內溶出完全；而在其他介質中，其在6 h內均未能溶出完全。結果表明，鹽酸西那卡塞片在不同溶出介質中的溶出行為差異明顯。

2.2 鹽酸西那卡塞片的體內藥動學研究

2.2.1 色譜及質譜條件 （1）色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（20 ∶ 80，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：283 nm；進樣量：20 μL。（2）質譜條件。電噴霧離子源，多反應監(jiān)測（MRM）模式；檢測質荷比（m/z）：358.1→155.1（鹽酸西那卡塞），316.0→212.1（內標）；干燥氣體（氮氣）流速：12.0 L/min，溫度：350 ℃；霧化器壓力：35 psi（1 psi=6.89 kPa）；毛細管電壓：3 000 V。

2.2.2 溶液制備 精密稱取鹽酸西那卡塞對照品20 mg置于20 mL量瓶中，加適量乙腈超聲（功率：180 W，頻率：59 kHz，下同）溶解后定容，搖勻；精密量取1 mL置于100 mL量瓶中，加乙腈定容后搖勻，即得10 μg/mL的對照品貯備液。精密稱取內標對照品20 mg置于200 mL量瓶中，加適量乙腈超聲溶解后定容，搖勻；精密量取1 mL置于1 000 mL量瓶中，加乙腈定容后搖勻，即得100 ng/mL的內標溶液。

2.2.3 血漿樣品預處理 精密量取0.5 mL血漿至5 mL離心管中，加入“2.2.2”項下內標溶液50 μL、0.3 mol/L氨溶液100 μL，渦旋30 s；加入1.0 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，12 000 r/min離心5 min（離心半徑：14 cm）；取上清液，于40 ℃下氮氣吹干，加乙腈50 μL溶解殘渣，取上清液，待測。

2.2.4 專屬性試驗 取受試者空白血漿和服藥4 h后的血漿各適量，按“2.2.3”項下方法預處理（空白血漿不加內標），并按“2.2.1”項下色譜及質譜條件進樣測定。結果顯示，鹽酸西那卡塞和內標的保留時間分別約為6.27、7.21 min，血漿中內源性雜質對兩者均無干擾，詳見圖3。

2.2.5 線性關系考察 取空白血漿適量，共6份，分別加入適量的“2.2.2”項下對照品貯備液，制成血藥濃度分別為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、25.0 ng/mL的系列血樣，渦旋混勻，按“2.2.3”項下方法預處理并按“2.2.1”項下色譜及質譜條件進樣測定。以鹽酸西那卡塞與內標峰面積之比（Y）對鹽酸西那卡塞質量濃度（X，μg/mL）進行線性回歸，得回歸方程Y=1.274 6X+0.030 7（r=0.994 2）。結果表明，鹽酸西那卡塞血藥濃度在0.1～25 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.2.6 提取回收率試驗 按“2.2.5”項下方法配制低、中、高質量濃度（0.1、2.0、25.0 ng/mL）的血漿樣品，平行5份操作，按“2.2.3”項下方法預處理后進樣測定；取“2.2.2”項下對照品貯備液和內標溶液各適量，以乙腈稀釋制成相應質量濃度的溶液，直接進樣測定。以經血樣預處理后測得的鹽酸西那卡塞、內標的平均峰面積分別與其相應乙腈溶液測得的兩者平均峰面積之比計算提取回收率。結果，鹽酸西那卡塞低、中、高質量濃度血漿樣品的提取回收率分別為56.8%、65.9%、72.3%，RSD分別為9.71%、9.54%、9.13%（n=5）；內標的提取回收率為66.4%，RSD為6.43%（n=15）。

2.2.7 精密度和準確度試驗 按“2.2.5”項下方法配制低、中、高質量濃度（0.1、2.0、25.0 ng/mL）的血漿樣品，平行5份操作，按“2.2.3”項下方法預處理后進樣測定。各樣品在單日內測定5次，并連續(xù)測定5 d，以考察日內和日間精密度；以實測質量濃度與理論質量濃度計算空白加樣回收率。結果，鹽酸西那卡塞低、中、高質量濃度血漿樣品的日內RSD分別為8.21%、7.21%、4.18%（n=5），日間RSD分別為9.72%、8.43%、5.33%（n=5）；空白加樣回收率分別為92.4%、97.8%、104.8%，RSD分別為4.21%、3.48%、3.21%（n=5），表明本方法的精密度、準確度均良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.5”項下方法配制血漿樣品（2.0 ng/mL），分別在-40 ℃冷凍7 d、反復凍融3次后按“2.2.3”項下方法預處理，室溫放置12 h后進樣測定，考察其穩(wěn)定性。結果，上述條件下鹽酸西那卡塞血藥濃度的RSD分別為2.41%、3.19%、3.72%（n=6），表明血漿樣品在上述條件下均較穩(wěn)定。

2.2.9 人體藥動學試驗 將12名健康成年男性受試者以抽簽方式隨機分為飽腹組和空腹組，每組6人，兩組受試者年齡、體質量等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本試驗方案經連云港市第一人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

受試者在試驗前均禁食過夜?？崭菇M受試者單劑量口服鹽酸西那卡塞片75 mg，4 h后進食；飽腹組受試者食用高脂食物200 g后，立即單劑量口服鹽酸西那卡塞片75 mg。分別于給藥前（0 h）與給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h時抽取靜脈血5 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，4 000 r/min離心5 min（離心半徑：14 cm），取上層血漿，于-40 ℃保存待用。檢測前，先將血漿樣品在室溫下解凍，再按“2.2.3”項下方法預處理后進樣測定。根據隨行標準曲線方程計算血藥濃度平均值（n=6），并繪制平均血藥濃度-時間曲線，詳見圖4。采用DAS 3.0軟件對血藥濃度數據進行參數計算和模型擬合。結果，鹽酸西塞卡那片在人體內的藥動學特征符合二室模型，主要藥動學參數見表1。

由圖4和表1可知，飽腹組受試者的AUC0→t、AUC0→∞和cmax顯著高于空腹組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明高脂食物對鹽酸西那卡塞片在人體內的藥動學過程有明顯影響。

2.3 鹽酸西那卡塞片的IVIVC評價

由于空腹組受試者口服鹽酸西那卡塞片后的AUC0→t、AUC0→∞遠低于飽腹組，且考慮到該制劑說明書建議的用法為與食物同服或餐后短時間內服用，故本研究僅對飽腹組受試者的藥動學數據進行IVIVC研究。采用DAS 3.0軟件，以Wagner-Nelson法計算飽腹組受試者口服鹽酸西那卡塞片后不同時間點的體內累積吸收百分數（F），并與相應時間點的體外Q值作線性回歸，結果見表2（注：由于該制劑在pH 1.2鹽酸溶液、pH 2.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液和SGF中60 min內即已溶出完全，無法與體內藥動學數據作相關性分析，因此僅采用其在pH 6.8磷酸鹽緩沖液、水、FeSSIF和FaSSIF中的體外溶出數據作IVIVC評價）。

由表2可見，該制劑在飽腹組受試者體內的F值與其在FeSSIF介質中（槳法，50 r/min）的Q值經回歸分析后所得r值最高（0.977 9）。經查詢相關系數臨界值表可知，r值超過臨界值0.974 1（n=6，P<0.001），則說明存在良好的A級IVIVC（即體外釋藥的程度及速率與體內血藥濃度變化呈點對點對應關系）[8-9]。因此，可采用鹽酸西那卡塞片在FeSSIF介質中（槳法，50 r/min）的體外溶出曲線反映其在體內的釋放和吸收情況。

3 討論

在鹽酸西那卡塞片體外溶出行為研究中，溶出介質一般采用0.01 mol/L鹽酸（即pH 2.0鹽酸溶液）[10]。筆者采用2015年版《中國藥典》（四部）通則0931“槳法”（轉速50 r/min）測定該制劑在pH 2.0鹽酸溶液中的溶出度，發(fā)現在10 min時藥物溶出量已超過90%，與體內藥動學數據時間點無法對應。因此筆者認為，文獻[10]的溶出條件僅能用于該制劑的批間均一性評價，而不適宜用于考察和預測其體內釋放和吸收情況。筆者參考文獻[8-9]考察了鹽酸西那卡塞片在不同介質（pH 1.2、pH 4.5、pH 6.8和水）中的體外溶出行為，發(fā)現IVIVC均較差。為更真實地反映藥物在胃腸液中的釋放情況，筆者選擇人工胃腸液（SGF、FeSSIF、FaSSIF）進行該制劑的體外溶出行為研究，結果發(fā)現在FeSSIF中，該制劑體外溶出行為與其體內藥動學過程存在良好的相關性。由于FeSSIF為模擬飽腹情況下的腸液，因此筆者判斷該制劑的主要吸收部位在腸道。

在體內藥動學研究中，血漿樣品中鹽酸西那卡塞提取回收率在70%左右，經多次試驗嘗試均未能明顯提高。為解決此問題，筆者選擇芬地林作為內標，其理化性質與鹽酸西那卡塞相近[11]，且提取回收率也相當。經考察，體內血藥濃度測定方法的空白加樣回收率為92.4%～104.8%，符合體內試驗的要求，故此提取方法雖然提取回收率偏低，但采用內標法仍可獲得較好的準確度，能夠用于該制劑的體內藥動學研究。

為考察食物對該制劑生物利用度的影響，為后續(xù)人體生物等效性研究提供依據，筆者對不同進食情況的受試者進行了研究。結果顯示，空腹組受試者的AUC0→t、AUC0→∞和cmax均顯著低于飽腹組，說明該制劑與食物同時服用能增加藥物吸收。IVIVC評價結果表明，采用FeSSIF作為溶出介質（槳法，50 r/min）得到的體外溶出曲線可用于反映鹽酸西那卡塞片的體內藥動學過程。

綜上所述，鹽酸西那卡塞片的體內藥動學過程與其體外溶出行為（以FeSSIF為介質，漿法，50 r/min）存在良好的IVIVC，故可采用體外溶出試驗預測該制劑的體內藥物釋放和吸收情況。本研究為鹽酸西那卡塞相關制劑的進一步研發(fā)提供了方法基礎，有利于大幅提高其臨床生物等效性試驗的成功率。

參考文獻

[ 1 ] 李述捷，阮詩瑋，丘余良，等. 西那卡塞治療血液透析患者繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥有效性和安全性的系統(tǒng)評價[J].中國藥房，2016，27（21）：2937-2941.

[ 2 ] 刁宗禮，郭維康，劉莎，等. 繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進的藥物治療進展[J].中國全科醫(yī)學，2015，18（26）：3245- 3247.

[ 3 ] NEVILLE D，JENKINS S，MANSER D. Nanoparticulate cinacalcet compositions：US 9012511[P].2015-04-21.

[ 4 ] 胡鐘芳，宋敏，杭太俊. 色譜-質譜聯(lián)用技術研究鹽酸西那卡塞的有關物質[J].中國藥科大學學報，2016，47（6）：719-726.

[ 5 ] 王閃閃，樊偉明，陳娟，等. 制備方法對無定形鹽酸西那卡塞的影響[J].中國藥科大學學報，2016，47（3）：317- 323.

[ 6 ] 李林羚，胡雪峰，楊玉雷，等. 鹽酸西那卡塞的工藝研究[J].中國新藥雜志，2013，22（7）：834-836.

[ 7 ] SILVERBERG SJ，CLARKE BL，PEACOCK M，et al.Current issues in the presentation of asymptomatic primary hyperparathyroidism：proceedings of the fourth international workshop[J]. J Clin Endocrinol Metab，2014，99（10）：3580-3594.

[ 8 ] 楊文濤，楊磊，姜偉化，等. 鹽酸西那卡塞固體分散體片的制備及溶出度評價[J].中國藥劑學雜志：網絡版，2014（2）：53-61.

[ 9 ] 劉為中，李樂樂，李志云. 鹽酸西那卡塞片的體外溶出一致性[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2016，47（8）：1047-1051.

[10] WANI TA，KHALIL YN，DARWISH I，et al. Highly sensitive and simple validated ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the determination of cinacalcet in human plasma[J]. Curr Pharm Anal，2014，10（1）：51-57.

[11] ROTHE H，LIANGOS O，PETERMANN A，et al. Calcimimetic drugs and biomarkers[J]. Recent Pat Biomarkers，2014，4（1）： 53-59.

（收稿日期：2017-10-17 修回日期：2018-05-07）

（編輯：段思怡）