董永紅 彭雯 王耀華 張麗艷

摘 要 目的：研究端錨聚合酶抑制劑XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞增殖的抑制及其作用機制。方法：以人骨肉瘤SOSP-9607細胞為研究對象，采用CCK-8法測定0.5、1、5、10 μmol/L XAV939分別作用24、48、72 h后的細胞增殖情況，并計算細胞抑制率；采用流式細胞術檢測5 μmol/L XAV939作用72 h后的細胞凋亡情況及周期分布；以甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用蛋白質印跡法測定0.5、1、5、10 μmol/L XAV939作用72 h后細胞中β-聯(lián)蛋白（β-catenin）、G1/S期特異性周期蛋白D1（Cyclin D1）和基質金屬蛋白酶7（MMP-7）的相對表達量。結果：1 μmol/L XAV939作用72 h后，5、10 μmol/L XAV939作用24、48、72 h后，SOSP-9607細胞的抑制率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。5 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607細胞的凋亡率從3.71%上升至21.03%（P<0.05）；G1期細胞的比例由45.5%增至54.8%，S期細胞的比例由27.4%降至24.0%，G2/M期細胞的比例由22.2%降至16.2%（P<0.05）。5、10 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607細胞中β-catenin、Cyclin D1和MMP-7的相對表達量均顯著下降（P<0.05或P<0.01）。結論：端錨聚合酶抑制劑XAV939能夠抑制人骨肉瘤SOSP-9607細胞的增殖，其機制可能與其將細胞周期阻滯于G1期、阻斷細胞外因子（Wnt）/β-catenin信號通路有關。

關鍵詞 人骨肉瘤SOSP-9607細胞；端錨聚合酶抑制劑；XAV939；細胞外因子/β-聯(lián)蛋白信號通路；增殖；凋亡

中圖分類號 R966；R738 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1917-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.11

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effect of tankyrase inhibitor XAV939 on human osteosarcoma SOSP-9607 cells and its mechanism. METHODS： The human osteosarcoma SOSP-9607 cells were selected as research objects. The proliferation of osteosarcoma cells was determined by CCK-8 method after treated with 0.5， 1， 5， 10 μmol/L XAV939 for 24， 48， 72 h， and the inhibitory rate was calculated. After treated with 5 μmol/L XAV939 for 72 h， flow cytometry was applied to detect cell apoptosis and cell cycle distribution of osteosarcoma cells. Using glyceraldehyde-3-dehydrogenase （GAPDH） as internal reference， Western blot assay was used to detect the relative expression of β-catenin， Cyclin D1 and MMP-7 in osteosarcoma cells after treated with 0.5， 1， 5， 10 μmol/L XAV939 for 72 h. RESULTS： After treated with 1 μmol/L XAV939 for 72 h， 5， 10 μmol/L XAV939 for 24， 48， 72 h， the inhibitory rates of SOSP-9607 cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with 5 μmol/L XAV939 for 72 h， the apoptotic rate of SOSP-9607 cells was increased from 3.71% to 21.03% （P<0.05）； the proportion of G1-phase cells increased from 45.5% to 54.8%， that of S-phase cells decreased from 27.4% to 24.0%， that of G2/M-phase cells decreased from 22.2% to 16.2% （P<0.05）. After treated with 5， 10 μmol/L XAV939 for 72 h， the relative expression of β-catenin， Cyclin D1 and MMP-7 in SOSP-9607 cells decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Tankyrase inhibitor XAV939 can inhibit the proliferation of human osteosarcoma SOSP-9607 cells， the mechanism of which may be associated with arresting cells at G1 phase and blocking signaling pathway of Wnt/β-catenin.

KEYWORDS Human osteosarcoma SOSP-9607 cells； Tankyrase inhibitor； XAV939； Wnt/β-catenin signaling pathway； Proliferation； Apoptosis

骨肉瘤是起源于骨間葉細胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，且多發(fā)病于脛骨近端、股骨遠端和長骨干骺端[1]。骨肉瘤的血行轉移發(fā)生早且發(fā)生率很高，患者病情進展迅速，病死率較高[2]。雖然接受手術聯(lián)合化療的骨肉瘤患者5年生存率可達50%～70%[3]，但近30年來，由于患者對傳統(tǒng)鉑類化療藥物的耐受，其5年生存率并無明顯提升，且發(fā)生轉移的患者5年生存率僅為20%～30%[4]。因此，尋找具有新靶點的骨肉瘤靶向治療藥物是目前國內外研究的主要方向和熱點。

端錨聚合酶是一種多功能蛋白質翻譯修飾酶，是多腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]家族的一員，其主要結構域為錨蛋白重復序列。該酶不僅可與端粒重復序列因子結合，還能與軸抑制蛋白羧基端的高度保守結構域結合，實現(xiàn)了對端粒酶的抑制作用，以進一步調節(jié)細胞外因子（Wnt）/β-聯(lián)蛋白（β-catenin）信號通路[5]。XAV939是2009年《自然》（Nature）雜志報道的一種端錨聚合酶抑制劑，其分子式為C14H11F3N2OS，分子量為312.31，是基于端錨聚合酶1/2的晶體結構直接合成的，其可通過穩(wěn)定軸抑制蛋白的表達選擇性阻滯Wnt/β-catenin信號通路的活化，從而限制腫瘤細胞的增殖與生長[6]。有研究者證實，XAV939能夠抑制Hela、MCF-7等乳腺癌細胞系的Wnt/β-catenin信號通路，顯著抑制其增殖[7]；此外，XAV939對結直腸癌[8]、肝癌[9]的抑制作用已經相關臨床前研究證實。但其對骨肉瘤的治療作用尚鮮見相關文獻報道。為此，本研究擬探究XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞增殖的抑制作用，并初步探討其分子機制，以期為骨肉瘤的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

371型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron公司）；CytoFLEX型流式細胞儀（美國Beckman公司）；Model 680型酶標儀、Gel Doc EZ型全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；DFC-259型倒置顯微鏡（德國Leica公司）；FA2004A型電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；SK-30型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；KH-300GDV型超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

端錨聚合酶抑制劑XAV939（批號：044M4713V，純度：>99%）、十二烷基磺酸鈉（批號：09/2016）、考馬斯亮藍G-250（批號：07/2016）、蛋白裂解液（批號：01/2017）、硝酸纖維素膜（批號：11/2016）均購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（批號：20160924）、胎牛血清（批號：201702124）、L-谷氨酰胺（批號：20161109）、青霉素及鏈霉素（批號：20170117）、磷酸鹽緩沖液[PBS，pH=7.4（下同），批號：20170105]、胰蛋白酶（批號：20170209）均購自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所，批號：P0018）；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（含Annexin Ⅴ-FITC染料、PI染料、PBS，北京雷根生物技術有限公司，批號：DG0043）；Hoechst 33342/PI細胞凋亡檢測試劑盒（含Hoechst 33342染料、PI染料、PBS，北京曠博生物技術有限公司，批號：RR013A）；蛋白質印跡法（Western blot）封閉緩沖液（pH=7.4，批號：HE209354）、羊抗兔二抗（批號：QE218426）均購自美國Thermo公司；甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）一抗（批號：SC-5364）、G1/S期特異性周期蛋白D1（Cyclin D1，批號：SC-5289）一抗、基質金屬蛋白酶-7（MMP-7，批號：SC-785）一抗及β-catenin（批號：SC-6586）一抗均購自美國Santa Cruz公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞

人骨肉瘤SOSP-9607細胞由中國科學院上海細胞生物學研究所提供。

2 方法

2.1 溶液制備

用二甲基亞砜（DMSO）溶解XAV939，制成XAV939濃度為10 mmol/L的貯備液，超聲（功率：200 W，頻率：25 kHz）10 min后，經0.22 μm微孔濾膜濾過，濾液于4 ℃避光保存，備用。臨用前用培養(yǎng)基稀釋至相應濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)

將人骨肉瘤SOSP-9607細胞株置于含10%熱滅活胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、25 μg/mL鏈霉素和50 U/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長至培養(yǎng)容器底面積的70%以上時，用PBS清洗，以胰蛋白酶消化傳代。每隔2～3 d換液1次。每天均使用倒置顯微鏡觀察，記錄細胞數(shù)量和狀態(tài)等指標。

2.3 細胞增殖檢測

取對數(shù)生長期細胞，調整細胞懸液濃度，按每孔5.0×103個細胞接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。分別設立空白對照組和給藥組，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基，給藥組分別加入不同濃度（0.5、1、5、10 μmol/L）的XAV939（濃度選擇參考文獻[7-8]），每組設置3個復孔（下同）。更換培養(yǎng)基后，于37 ℃、5%CO2條件下再分別培養(yǎng)24、48、72 h。終止培養(yǎng)后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，于37 ℃條件下避光反應4 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，計算細胞抑制率[細胞抑制率（%）=（1-給藥組平均OD值）/空白對照組平均OD值×100%]，空白對照組的細胞抑制率為0[10]。

2.4 細胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期細胞，按每孔5.0×105個細胞接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。分別設立空白對照組和給藥組，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基，給藥組加入5 μmol/L的XAV939（綜合考慮試驗成本及前期毒性試驗結果），更換培養(yǎng)基后，于37 ℃、5%CO2條件下再培養(yǎng)72 h。使用Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況：收集并調整細胞懸液至約1×106 mL-1，以轉速800 r/min離心3 min，沉淀用PBS清洗2次后，重懸于PBS 200 μL中；加入Annexin Ⅴ-FITC染料10 μL，輕輕混勻，于室溫下避光反應15 min，再加入PI染料10 μL，于4 ℃下避光反應5 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果采用Cell Quest 3.0軟件分析。

2.5 細胞周期分析

取對數(shù)生長期細胞，按每孔5.0×105個細胞接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。分別設立空白對照組和給藥組，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基，給藥組加入5 μmol/L的XAV939（綜合考慮試驗成本及前期毒性試驗結果），更換培養(yǎng)基后，于37 ℃、5%CO2條件下再培養(yǎng)72 h。使用Hoechst 33342/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞周期：收集細胞并調整細胞懸液至約1×106 mL-1，以轉速800 r/min離心3 min，沉淀用PBS清洗2次后，重懸于PBS 200 μL中；加入Hoechst 33342染料10 μL，輕輕混勻，于室溫下避光反應15 min，再加入PI染料10 μL，于4 ℃下避光反應5 min。使用流式細胞儀檢測細胞周期，結果采用Cell Quest 3.0軟件分析。

2.6 蛋白表達檢測

采用Western blot法檢測。取對數(shù)生長期細胞，按每孔5.0×105個細胞接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。分別設立空白對照組和給藥組，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基，給藥組分別加入不同濃度（0.5、1、5、10 μmol/L）的XAV939，更換培養(yǎng)基后，于37 ℃、5%CO2條件下再培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束后收集細胞，加入預冷的蛋白裂解液100 ?L重懸細胞，冰上孵育60 min，裂解細胞，裂解液以轉速12 000 r/min離心10 min后，收集上清液。上清液于100 ℃金屬浴中靜置5 min以變性蛋白。取蛋白20 μg進行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分離，并轉移至硝酸纖維素膜上，于室溫下在封閉緩沖液中孵育30 min，加入GAPDH一抗（1 ∶ 500）、Cyclin D1一抗（1 ∶ 300）、MMP-7一抗（1 ∶ 500）、β-catenin一抗（1 ∶ 300），室溫下孵育60 min。洗膜后，加入羊抗兔二抗（1 ∶ 300），室溫下孵育60 min，采用化學發(fā)光法以考馬斯亮藍G-250標記，于凝膠成像系統(tǒng)上分析。以GAPDH為內參，用目標蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值來表示目標蛋白的相對表達量，空白對照組各蛋白的相對表達量均為1[11]。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞增殖的影響

與空白對照組比較，1 μmol/L XAV939作用72 h后，5、10 μmol/L XAV939作用24、48、72 h后，SOSP-9607細胞的抑制率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞凋亡的影響

經5 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607細胞的凋亡率從3.71%上升至21.03%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），詳見圖1。

3.3 XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞周期分布的影響

經5 μmol/L XAV939作用72 h后，G1期細胞的比例由45.5%增至54.8%，S期細胞的比例由27.4%降至24.0%，G2/M期細胞的比例由22.2%降至16.2%，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），詳見圖2。

3.4 XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞中β-catenin、Cyclin D1、MMP-7表達的影響

與空白對照組比較，5、10 μmol/L XAV939作用72 h后，SOSP-9607細胞中β-catenin、Cyclin D1、MMP-7的相對表達量均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖3、表2。

4 討論

骨肉瘤在骨腫瘤中的占比高達20%，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤[12]。臨床上骨肉瘤絕大部分為高度惡性，且常發(fā)生于青少年的長骨干骺端等部位，且90%以上的骨肉瘤患者會發(fā)生肺部轉移[13]。Wnt/β-catenin信號通路是一個多環(huán)節(jié)、多作用位點的生長發(fā)育調控信號通路，在動物胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生的過程中具有重要作用[14]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路是激活骨肉瘤細胞發(fā)生轉移的重要誘導因子，在高轉移性骨肉瘤細胞系中，β-catenin蛋白的表達明顯上調[14]。Wnt與β-catenin受體競爭性結合，抑制細胞質中β-catenin的降解，導致胞漿中高濃度的β-catenin通過轉位移至細胞核內，調控相關靶基因表達和細胞周期分布，從而發(fā)揮抗凋亡等一系列作用[15]。因此，Wnt/β-catenin信號通路可能成為骨肉瘤治療藥物研發(fā)的重要靶點。

端錨聚合酶抑制劑XAV939是一個由生物遺傳學方法合成的端錨聚合酶小分子抑制劑，是Wnt/β-catenin信號通路的正向調控因子[16]。XAV939可與端錨聚合酶的PARP結構域結合，穩(wěn)定β-catenin降解復合物中的軸抑制蛋白，選擇性抑制β-catenin介導的轉錄作用，從而減少下游靶基因的激活；另一方面，XAV939還可直接抑制端粒酶活性，限制染色體末端的延伸，從而起到阻止細胞增殖的作用[17]?，F(xiàn)有文獻已報道了XAV939通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制DLD-1[8]、SKOV3[18]、MCF-7[19]等多種腫瘤細胞系的增殖，但鮮見XAV939對骨肉瘤細胞系抑制作用的相關報道。為此，本研究將XAV939作用于人骨肉瘤SOSP-9607細胞，通過CCK-8法測定不同濃度XAV939分別作用24、48、72 h后的細胞增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)1 μmol/L XAV939作用72 h后，5、10 μmol/L XAV939作用24、48、72 h后均可不同程度地抑制SOSP-9607細胞增殖，且較高濃度的XAV939具有更顯著的增殖抑制作用。凋亡抵抗是保證腫瘤細胞存活的關鍵分子機制。Shin JH等[20]研究發(fā)現(xiàn)，XAV939能夠使細胞周期阻滯在G1期，阻滯細胞進入S期。本研究通過流式細胞術檢測5 μmol/L XAV939作用72 h后的細胞凋亡情況和周期分布，發(fā)現(xiàn)XAV939顯著提高了SOSP-9607細胞的凋亡率，并將細胞周期阻滯在G1期，導致S期和G2/M期細胞的比例下降。這提示XAV939能夠誘導骨肉瘤細胞凋亡，并可干擾細胞的周期分布。

Wisman GB等[21]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt/β-catenin信號通路后，骨肉瘤細胞核中的β-catenin水平下調，進而抑制MMP-7、Cyclin D1等下游靶基因的表達，其一方面下調了c-myc和Survivin等基因的表達以及Cyclin D1蛋白的水平，并通過調節(jié)細胞周期來抑制細胞增殖、促進細胞凋亡或壞死；另一方面通過下調MMP-7蛋白的表達，抑制了細胞外基質的降解，從而抑制骨肉瘤細胞的轉移。動物實驗研究也證實，在骨肉瘤小鼠模型中，通過注射Wnt拮抗藥抑制Wnt/β-catenin信號通路，可明顯抑制小鼠體內骨肉瘤移植瘤細胞的生長和轉移[22]。本研究采用Western blot法檢測不同濃度XAV939對人骨肉瘤SOSP-9607細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響，結果發(fā)現(xiàn)5、10 μmol/L XAV939能顯著抑制SOSP-9607細胞β-catenin、Cyclin D1、MMP-7蛋白的表達。這提示XAV939可能通過阻滯Wnt/β-catenin信號通路來抑制SOSP-9607細胞的增殖，并促進其凋亡，與文獻報道的XAV939對結直腸癌細胞[8]和肝癌細胞[9]的抑制作用及其機制基本相同。

綜上所述，XAV939能夠抑制人骨肉瘤SOSP-9607細胞的增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能與其將細胞周期阻滯于G1期、阻斷Wnt/β-catenin信號通路有關。盡管XAV939在體外顯示出對骨肉瘤細胞較強的抑制作用，但其具體機制及在人體內的作用仍有待后續(xù)研究深入探討。

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（收稿日期：2018-01-04 修回日期：2018-05-09）

（編輯：張元媛）