郝軒軒 王新陸 崔琳 王幼平 李彬 謝世陽 高原 朱明軍

摘 要 目的：觀察加參方浸膏對過氧化氫（H2O2）誘導的H9c2心肌細胞凋亡的干預作用，并探討其作用機制。方法：采用MTT法，考察400、200、100、50、25 μmol/L的H2O2與3.0、1.8、0.9、0.3、0.1 mg/mL加參方浸膏對H9c2心肌細胞活性的影響。將H9c2心肌細胞分為正常組、模型組、加參方組，除正常組細胞加入相應培養(yǎng)基外，模型組、加參方組細胞均采用50 μmol/L H2O2處理以誘導細胞發(fā)生氧化應激損傷，加參方組在模型組基礎上加入0.3 mg/mL加參方浸膏干預處理。采用DAPI染色法，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率；采用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應法測定細胞中胱天蛋白酶3（Caspase-3）、Bax、Bcl-2 mRNA表達水平，Western Blot法測定Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平。結果：50 μmol/L為H2O2最適造模濃度，0.3 mg/mL為加參方浸膏最適藥物干預濃度。與模型組比較，加參方組細胞的形態(tài)改善，細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。結論：加參方浸膏對H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡有顯著的抑制作用，其機制可能與下調細胞中Caspase-3、Bax表達，上調Bcl-2表達有關。

關鍵詞 加參方；浸膏；過氧化氫；H9c2心肌細胞；凋亡；胱天蛋白酶3；Bax；Bcl-2

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1898-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.07

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the intervention effects of Jiashen formula extractum on hydrogen peroxide（H2O2）-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes， and to investigate its mechanism. METHODS： MTT assay was used to investigate the effects of 400， 200， 100， 50， 25 μmol/L H2O2 and 3.0， 1.8， 0.9， 0.3， 0.1 mg/mL Jiashen formula extractum on the activity of H9c2 cardiomyocytes. H9c2 cardiomyocytes were divided into normal group， model group and Jiashen formula group. Model group and Jiashen formula group were given 50 μmol/L H2O2 to induce oxidative stress injury except that normal group was cultured with corresponding culture medium. Jiashen formula group was given 0.3 mg/mL Jiashen formula extractum for intervention on the basis of model group. Cell morphology was observed by fluorescence microscope through DAPI dye. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. Fluorescence quantitative RT-PCR was used to detect mRNA expression levels of Caspase-3， Bax and Bcl-2 in cells； Western Blot assay was used to determine the protein expression levels of Caspase-3， Bax and Bcl-2. RESULTS： 50 μmol/L was the most suitable modeling concentration of H2O2； 0.3 mg/mL was the most suitable intervention concentration of Jiashen formula extractum. Compared with model group， cells in Jiashen formula extractum group were significantly improved in morphology and reduced in apoptosis rate； mRNA and protein expression levels of Caspase-3 and Bax were significantly reduced， and those of Bcl-2 were significantly increased （P<0.05）. CONCLUSIONS： Jiashen formula extractum shows significant inhibitory effect on H2O2-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes， the mechanism of which may be associated with down-regulation of Caspase-3 and Bax expression and up-regulation of Bcl-2 expression in cardiomyocytes.

KEYWORDS Jiashen formula； Extractum； Hydrogen peroxide； H9c2 cardiomyocytes； Apoptosis； Caspase-3； Bax； Bcl-2

心力衰竭是各種病因的心臟病的終末階段，是心臟病患者死亡的重要原因，而心肌細胞凋亡在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中起到了非常重要的作用[1]。多種因素都可能引起細胞凋亡，其中活性氧（ROS）誘導在心肌細胞凋亡研究領域越來越受關注。正常情況下，心肌細胞在代謝過程中產生的少量ROS會被機體有效清除，但在氧化應激狀態(tài)下會發(fā)生ROS的過度積累，這可能引起細胞能量代謝紊亂，導致細胞凋亡和壞死，進而引起心功能的下降和失代償，最終發(fā)生心力衰竭[2-4]。因此，如何清除心肌細胞內產生的過量ROS，減少其對細胞的損害作用，成為心力衰竭治療領域的研究熱點。研究表明，中醫(yī)藥在抑制心肌細胞凋亡方面具有獨特功效，如補陽還五湯[5]、通塞脈湯[6]等。加參方是經張伯禮院士臨床實踐證實能有效治療慢性心力衰竭的經驗方。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，加參方浸膏可減少心肌梗死模型大鼠的梗死面積，改善心功能，保護心肌細胞[7]；可通過TGF-β1/Smad信號通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞增殖[8]。另有研究表明，加參方浸膏可調節(jié)慢性心力衰竭模型大鼠的內分泌系統(tǒng)并改善其微循環(huán)[9]?；诖耍緦嶒灢捎眠^氧化氫（H2O2）誘導H9c2大鼠心肌細胞氧化應激損傷建立細胞凋亡模型，考察加參方浸膏對H2O2致心肌細胞凋亡的干預作用及其作用機制，以期為加參方相關制劑的后續(xù)研發(fā)及臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ROC-3000TVBB型CO2培養(yǎng)箱（美國Revco公司）；LDZ5-2型低速自動平衡離心機（北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司）；Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）；XK96-3型微量振蕩器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；WD-9405B型水平搖床（北京市六一儀器廠）；SpectraMax M3型酶標儀（美國Molecular Devices公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）；DMI3006型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；小型蛋白垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

加參方浸膏（組方為香加皮、黃芪、三七、丹參、桂枝、益母草、桑白皮、澤瀉、葶藶子等，1 g浸膏相當于9.515 g生藥）由天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究中心提供。

胎牛血清（FBS，以色列BI公司，批號：04-001-1A）；DMEM高糖培養(yǎng)基（含雙抗）、0.25%胰蛋白酶、MTT粉末、即用型DAPI（4′ ，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號：12100-500、T1320、B0016K012500、c0065）；H2O2溶液（10 mol/L）、GAPDH內參抗體（美國Sigma公司，批號：MKBS8306V、G8795）；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（內含1×binding buffer、AnnexinⅤ、碘化丙啶等，美國BD公司，批號：6119909）；Trizol試劑（美國Ambion Life Technologies公司，批號：103105）；逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：c28025-032、c11744- 100）；胱天蛋白酶3（Caspase-3）兔多克隆抗體、Bax兔多克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號：9662、2772、2876）；?？雇妹庖咔虻鞍譍（IgG）-辣根過氧化酶標記物（HRP）、?？故驣gG-HRP（美國Santa Cruz公司，批號：sc-2370、sc-2380）；RIPA細胞裂解液（美國Thermo公司，批號：OC183166）；磷酸鹽緩沖液（PBS，本實驗室自制，pH 7.2～7.4）；其他試劑均為市售分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

H9c2大鼠心肌細胞由中國科學院上海細胞資源中心提供。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 加參方浸膏藥液 根據(jù)文獻[10]，稱取加參方浸膏干粉0.1 g，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL助溶，再加入含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)液”）10 mL混勻，經0.22 μm濾器濾過除菌，制成10 mg/mL的藥物原液，4 ℃保存。臨用時，以培養(yǎng)液稀釋制成3.0、1.8、0.9、0.3、0.1 mg/mL系列質量濃度的藥液。

2.1.2 H2O2溶液 取H2O2溶液（10 mol/L）適量，以培養(yǎng)液稀釋制成400、200、100、50、25 μmol/L系列濃度的溶液，即用即配。

2.1.3 MTT溶液 稱取MTT粉末50 mg，加入PBS 10 mL溶解，經0.22 μm濾器濾過，于4 ℃下避光保存。臨用時，以DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋制成0.5 mg/mL的溶液。

2.2 造模濃度/給藥濃度篩選

根據(jù)文獻[11]，采用MTT法篩選H2O2（模型誘導劑）的造模濃度和加參方浸膏（干預藥物）的給藥濃度。

2.2.1 H2O2造模濃度篩選 （1）細胞培養(yǎng)：取H9c2心肌細胞，以培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下（以下同）常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/孔接種于96孔板中，共接種6組，每組6個復孔，分別加入培養(yǎng)液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)至細胞密度達90%后棄上清液。（2）H2O2造模濃度篩選：上述各組孔中分別加入400、200、100、50、25、0（空白）μmol/L的H2O2溶液100 μL[加入0（空白）μmol/L H2O2溶液者作為空白對照組]，常規(guī)培養(yǎng)6 h以建立心肌細胞凋亡模型；棄上清液，加入MTT溶液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)2 h；棄上清液，加入DMSO 100 μL，室溫震蕩10 min后，采用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度（OD）值，以考察細胞活性。

2.2.2 加參方浸膏給藥濃度篩選 按照“2.2.1”項下方法培養(yǎng)細胞并分組。在各孔中分別加入3.0、1.8、0.9、0.3、0.1、0（空白）mg/mL的加參方浸膏藥液各100 μL[加入0（空白）mg/mL加參方浸膏藥液者作為空白對照組]，常規(guī)培養(yǎng)24 h；然后按“2.2.1”項下“棄上清液……于490 nm波長處測定OD值”步驟操作，以考察細胞活性。

2.3 加參方浸膏對H2O2致凋亡模型細胞的干預作用考察

2.3.1 加參方浸膏對心肌細胞形態(tài)學的影響 由于凋亡細胞的膜通透性增加， DAPI對其穿透力增強，因此在凋亡細胞中DAPI會產生亮藍色熒光，有別于正常細胞的微弱藍色熒光[12]?；诖耍驹囼灢捎肈API染色法觀察細胞形態(tài)學變化：按照“2.2.1”項下方法接種細胞于6孔板，培養(yǎng)至細胞密度達90%后棄上清液，分別設為正常組、模型組、加參方組。其中，正常組加入培養(yǎng)液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μL；模型組加入50 μmol/L H2O2溶液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μL；加參方組加入50 μmol/L H2O2溶液100 μL，常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，加入0.3 mg/mL加參方浸膏藥液100 μL。3組細胞均繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在室溫下以PBS沖洗2次，加入4%多聚甲醛1 mL固定10 min；洗去多聚甲醛，加入少量DAPI溶液覆蓋樣品，室溫下染色10 min；以水洗凈，晾干，熒光顯微鏡下（激發(fā)波長：360 nm）觀察，鏡下亮藍色細胞即為凋亡細胞。

2.3.2 加參方浸膏對心肌細胞凋亡的影響 按“2.3.1”項下方法進行細胞接種、培養(yǎng)、分組及給藥處理；收集細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液；1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌，收集細胞；加入1×bin- ding buffer、AnnexinⅤ（10 g/mL）和碘化丙啶（10 g/mL）后培養(yǎng)15 min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，以FlowJo 7.6軟件分析凋亡細胞的分布情況。

2.3.3 加參方浸膏對心肌細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響 采用熒光定量逆轉錄（RT）-PCR法。按“2.3.1”項下方法進行細胞接種、培養(yǎng)、分組及給藥處理；參照文獻[8]，用Trizol試劑提取細胞總RNA用于合成cDNA；以GAPDH為內參基因，分別對Caspase-3、Bax、Bcl-2進行擴增。RT-PCR反應體積為20 μL，反應條件：95 ℃預變性90 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。擴增反應結束后，建立PCR產物的熔解曲線（65～95 ℃），采用2-ΔΔCT相對定量法[13]計算mRNA表達水平。RT-PCR引物序列見表1。

2.3.4 加參方浸膏對心肌細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 采用Western Blot法。按“2.3.1”項下方法進行細胞接種、培養(yǎng)、分組及給藥處理；參照文獻[8]方法裂解細胞后，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，提取蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、封閉，分別加入一抗GAPDH抗體（1 ∶ 3 000）、Caspase-3兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、Bax兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、Bcl-2兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000），4 ℃冷藏過夜；TBST緩沖液洗膜，分別加入二抗?？雇肐gG-HRP（1 ∶ 2 000）、?？故?IgG-HRP（1 ∶ 3 000），37 ℃恒溫搖床孵育1 h，TBST緩沖液洗膜；采用化學發(fā)光法曝光，以ImageJ 1.8.0軟件測得蛋白條帶相對灰度值，用以表示蛋白表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

各項試驗均平行操作3次。試驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 H2O2造模濃度篩選結果

結果顯示，隨著H2O2濃度升高，細胞活性逐漸下降并呈濃度依賴性。與空白對照組比較，當H2O2濃度為50～400 μmol/L時，細胞OD值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明其對細胞的毒性顯著增強、細胞活性顯著下降。綜合考慮，選擇對細胞損傷程度適中的50 μmol/L H2O2建立細胞凋亡模型（該濃度組細胞活性約為空白對照組的一半）。

3.2 加參方浸膏給藥濃度篩選結果

結果顯示，隨著加參方浸膏質量濃度升高，細胞活性逐漸下降并呈濃度依賴性。與空白對照組比較，當加參方浸膏質量濃度為0.1～0.3 mg/mL時，細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明其對細胞無明顯毒性；當加參方浸膏質量濃度為0.9～3.0 mg/mL時，細胞OD值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明其對細胞已經產生明顯的毒性作用。考慮到藥物濃度過高也會對細胞造成損傷，因此選擇無細胞毒性的最高質量濃度的0.3 mg/mL加參方浸膏進行后續(xù)試驗。

3.3 加參方浸膏對心肌細胞形態(tài)學的影響結果

熒光顯微鏡下可見，正常組細胞核形態(tài)呈圓形或橢圓形，邊緣清晰，染色均勻，呈現(xiàn)較弱的藍色熒光；模型組有大量呈現(xiàn)亮藍色熒光的凋亡細胞，細胞邊緣不規(guī)整；加參方組的凋亡細胞數(shù)量較模型組少，大部分細胞呈現(xiàn)較弱的藍色熒光，詳見圖1（圖中，細箭頭所指為正常細胞，粗箭頭所指為凋亡細胞）。

3.4 加參方浸膏對心肌細胞凋亡的影響結果

流式細胞儀檢測結果顯示，與正常組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，加參方組細胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組細胞流式細胞圖見圖2，凋亡率比較見圖3。

3.5 加參方浸膏對心肌細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響結果

結果顯示，與正常組比較，模型組細胞中Caspase-3、Bax mRNA表達水平均顯著升高，Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，加參方組細胞中Caspase-3、Bax mRNA表達水平均顯著降低，Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果表明，加參方浸膏可通過下調Caspase-3、Bax，上調Bcl-2的mRNA表達水平起到保護心肌細胞的作用。各組細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達水平比較見圖4。

3.6 加參方浸膏對心肌細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響結果

結果顯示，與正常組比較，模型組細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達水平均顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組比較，加參方組細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達水平均顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果表明，加參方浸膏可通過下調Caspase-3、Bax，上調Bcl-2的蛋白表達水平起到保護心肌細胞的作用。各組細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白電泳圖見圖5，蛋白表達水平比較見圖6。

4 討論

心力衰竭是一種常見的心血管疾病，是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段。發(fā)生心力衰竭時，心肌細胞凋亡導致心臟電活動和心肌收縮功能嚴重紊亂，促使心力衰竭進一步發(fā)展[1]。因此，減少心肌細胞凋亡是治療心力衰竭的重要策略。加參方是經張伯禮院士臨床驗證治療慢性心力衰竭有效的經驗方，方中以香加皮、黃芪補益心氣，丹參、三七活血化瘀，桂枝溫通心脈，澤瀉、葶藶子、益母草、桑白皮化濕利水，諸藥配合以達益氣活血、溫陽利水之效[14-15]。本課題組采用H2O2建立H9c2心肌細胞凋亡模型，考察加參方浸膏對細胞凋亡的干預作用及其可能的作用機制。

H9c2心肌細胞屬于永生大鼠心肌細胞系，已被證明其形態(tài)特征與原代心肌細胞相似，且仍保留成年大鼠心肌細胞信號轉導特征[16]，因此被廣泛用于試驗研究。

H2O2作為細胞系或原代細胞凋亡誘導劑，其使用劑量在不同研究中各有差異[17-18]。本課題組考察了不同濃度H2O2對心肌細胞活性的影響，結果顯示，H2O2濃度越高，心肌細胞活性越低；當H2O2濃度在50～400 μmol/L時，細胞活性較正常組細胞顯著降低，表明H2O2對細胞的毒性呈明顯的濃度依賴性。綜合考慮，選擇對細胞損傷程度適中的50 μmol/L H2O2建立細胞凋亡模型。

對加參方浸膏給藥濃度的篩選結果顯示，與正常組細胞比較，加參方浸膏質量濃度為0.1～0.3 mg/mL時細胞活性未見顯著下降，表明這一質量濃度范圍的加參方浸膏無明顯細胞毒性作用；而隨著加參方浸膏質量濃度的進一步增加（0.9～3.0 mg/mL），細胞活性顯著下降，呈現(xiàn)出明顯的細胞毒性。為避免藥物本身對細胞造成的損傷，同時也為確保藥效足夠，故選擇無細胞毒性的最高質量濃度的0.3 mg/mL加參方浸膏進行后續(xù)試驗。

對正常細胞、經50 μmol/L H2O2處理的細胞以及經0.3 mg/mL加參方浸膏+50 μmol/L H2O2共同處理的細胞進行形態(tài)學觀察和凋亡率測定，結果顯示，加參方浸膏能顯著抑制細胞凋亡，具有心肌細胞保護作用。

Bcl-2家族蛋白在調節(jié)細胞凋亡中起著關鍵作用。Bcl-2家族包含20余種Bcl-2的同源蛋白，可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白：典型的抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-W等主要存在于線粒體外膜，具有抗細胞凋亡活性；典型的促凋亡蛋白如Bax，其與Bcl-2具有高度的氨基酸序列同源性，在正常細胞中以單體形式存在于細胞質，當受到相關的凋亡信號刺激時會轉移到線粒體上，改變線粒體膜電位與線粒體通透性，促進凋亡活性物質細胞色素C釋放[19]。Bcl-2能與Bax結合形成異源二聚體，阻止Bax釋放，從而發(fā)揮抑制細胞凋亡、保護細胞的作用；Bcl-2過表達可以減少氧自由基的產生、抑制ROS的脂質過氧化作用[20]。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，一旦被信號轉導途徑激活，就能降解細胞內蛋白，使細胞不可逆地發(fā)生凋亡[20]。Caspase-3屬于Caspase家族的“執(zhí)行者”，可以直接降解細胞內結構蛋白和功能蛋白，參與線粒體通路的細胞凋亡[20]。存在于線粒體膜上的Bcl-2過表達時可以抑制線粒體通透性的改變，減少細胞色素C的釋放，抑制Caspase激活，從而抑制細胞凋亡；Bcl-2過表達可引起細胞核谷胱甘肽（GSH）的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低Caspase的活性。當細胞發(fā)生氧化應激時，ROS與Caspase相互影響，共同促進細胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經H2O2作用后的心肌細胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低，Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達水平均顯著上升，表明H2O2誘導的心肌細胞凋亡模型成功建立；而這一作用均可被加參方浸膏逆轉。本研究結果表明，加參方浸膏抑制H2O2致心肌細胞凋亡的作用可能與其參與調節(jié)Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達相關。

綜上所述，加參方浸膏可能通過下調Caspase-3、Bax和上調Bcl-2的mRNA及蛋白表達，發(fā)揮抗H2O2誘導的氧化應激損傷、抑制細胞凋亡的作用，從而保護心肌細胞。本研究可為加參方相關制劑研發(fā)及臨床治療心力衰竭提供理論基礎和試驗依據(jù)。

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（收稿日期：2018-02-28 修回日期：2018-06-05）

（編輯：段思怡）