陳少美 薛小蘭

摘要：利用正交法篩選菌草灰樹花蛋白質最優(yōu)提取工藝，結果表明：提取因素對指標影響依次為C（細胞超聲破碎次數(shù)）>D（浸提pH值）>B（浸提溫度）>A（料液比）；最優(yōu)提取工藝為料液比1∶50、浸提溫度45℃、浸提pH值10、細胞超聲粉碎5次，提取率達到095%。

關鍵詞：灰樹花；蛋白質提??；工藝優(yōu)化

DOI： 1013651/jcnkifjnykj201802011

Optimization of Protein Extraction Technology for Grifola Frondosa

CHEN Shaomei， XUE Xiaolan

（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350007）

Abstract： An orthogonal experimental design was used to optimize the protein extraction technology for Grifola frondosa. The results showed that the influence of extraction factors on the index was decreased in order C>D>B>A. The optimal extraction technology included， the ratio of material to liquid was 1∶50， the extracting temperature was 45℃， the pH value was 10， and 5 times of the cells ultrasonic crush， and under these conditions， the extraction rate for protein of Grifola frondosa reached 095%.

Key words： Grifola frondosa； protein extraction； technology optimization

灰樹花俗稱“栗子蘑”，又名貝葉多孔菌、蓮花菌等，隸屬于擔子菌綱、多孔菌目。灰樹花是一種十分珍貴的藥用真菌[1]，化學成分主要包括多糖、蛋白質、核酸、多酚等，除多糖外，灰樹花中含量較高的另一功能性成分是蛋白質， Nanba h等[2]最早發(fā)現(xiàn)了灰樹花中的抗腫瘤多糖，其組分中含有1%～20%的蛋白可能具有獨特作用。另研究表明，從灰樹花中提取的小分子蛋白具有抗單純孢疹病毒I型的作用[3]。Tsao y w等[4]研究發(fā)現(xiàn)灰樹花蛋白具有刺激小鼠樹突狀細胞和增強小鼠抗腫瘤免疫的功能。

國內對灰樹花菌絲體蛋白的提取工藝鮮有報道。真菌蛋白的提取一般采用堿提法或水浸提法，但耗時長而且效率較低[5-6]。為提高提取效率和縮短提取時間，通過正交試驗對提取條件進行優(yōu)化，以期為灰樹花蛋白提取提供參考。

1材料與方法

11材料與試劑

灰樹花干品（來源于浙江金華）粉碎過篩備用。試劑：硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、磷酸（以上試劑均為分析純），考馬斯亮藍G-250。

12儀器與設備

細胞超聲粉碎機（scientz-ⅡD）、高速冷凍離心機（sigma1-15k）、紫外分光光度計（T6）。

13方法

稱取一定量的灰樹花干粉，一定料液比細胞超聲破碎，在一定溫度下堿液溶解、過濾，取上清液加硫酸銨固體（20%）→靜置，離心（10000 r·min-1， 10℃，20 min）→取上清液，繼續(xù)加硫酸銨固體（80%）→離心（10 000 r·min-1， 10℃，20 min），棄去上清液，留取粗蛋白，待透析完全后冷凍干燥備用。

稱考馬斯亮藍G-25020 mg，溶于20 mL 95%的乙醇后，再加入85%的磷酸20 mL，稀釋至100 mL。標準蛋白質溶液配制：用牛血清蛋白（BSA）配制成10 mg·mL-1標準蛋白質溶液。樣品蛋白配制：取透析完全的蛋白經(jīng)冷凍干燥按20 μg·mL-1，在波長595 nm下比色，測定吸光度值。

14提取工藝優(yōu)化設計

141單因素試驗設計干粉→水浸提→細胞破碎→堿液下溶解，分別研究A料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、B浸提溫度（30、35、40、45、50、55、60）℃、C細胞超聲破碎次數(shù)（4、5、6）、D浸提pH值（80、85、90、95、100、105、110）4個因素對提取率的影響。

陳少美等：菌草灰樹花蛋白質提取工藝優(yōu)化研究2018年第2期2018年第2期陳少美等：菌草灰樹花蛋白質提取工藝優(yōu)化研究142正交法試驗設計在單因素的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計料液比、浸提溫度、pH值、超聲破碎對蛋白質提取的影響，確定最優(yōu)提取工藝條件。各因素及水平設計見下表1。

2結果與分析

21單因素試驗結果

211料液比對提取率的影響從圖1可知，隨料液比增加，蛋白質提取率呈提高趨勢，料液比在1∶40時提取率達最大值；繼續(xù)增加，提取率無明顯提高。說明最佳料液比區(qū)間1∶30～50。

212浸提溫度對提取率的影響從圖2可知，隨著浸提溫度升高，提取率增加，在50℃時達最大值，隨后呈降低趨勢。最佳浸提溫度區(qū)間40～50℃。

213細胞超聲破碎次數(shù)對提取率的影響由圖3可知，超聲次數(shù)在5次后提取率保持穩(wěn)定，溶出物較完全。因此超聲次數(shù)以5次為最佳。

214浸提溶液pH值對提取率的影響由圖4可知，浸提pH值100時提取率達最大值，pH值 大于105提取率呈降低趨勢。表明提取pH值100左右為最佳。

3結論

在單因素試驗的基礎上，正交試驗得到灰樹花子實體蛋白質提取因素對提取率影響的次序為：C>D>B>A，采用的最佳工藝條件組合為：C3D2B2A2，即料液比1∶50、浸提溫度45℃、浸提pH值10、細胞超聲粉碎5次，該組合下提取率達到095%。該工藝操作簡便，提取效果好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻：

[1]吳智艷，閆訓友，等灰樹花生理活性物質的研究進展[J]北方園藝，2006（6）：173-174

[2]NANBA H，HAMAGUCHI A，KURODA H.The chemical stmcture of an antitumor polysaccharide in fruit bodies of Grifola frondosa （maital）[J].Chem Pharm Bull，1987，35（3）：1162-1168.

[3]GU C Q，U J W，CHA0 FH，et al.Isolation，identification and function of a novel anti-HSV-l protein from Grifola frondosa[J]Antivir Res，2007，75（3）：250-257.

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[6]陳貴堂，王麗敏，姚舒愉，等.灰樹花子實體多糖和蛋白的同步提取工藝優(yōu)化[J].食品科技，2014，39（7）：248-251，257.