陳金武 齊璐璐 段瑩瑩

摘要 [目的]獲得穩(wěn)定表達(dá)重組人生長(zhǎng)激素的中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞株，并分析目的蛋白體內(nèi)促動(dòng)物生長(zhǎng)活性及免疫原性。[方法]PCR擴(kuò)增獲得rhGH基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒rhGH1 pOptiVEC，并進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO/DG44 dhfr 細(xì)胞，利用SDS PAGE電泳及Western blot檢測(cè)目的蛋白，并用氨甲喋呤（MTX）加壓篩選陽(yáng)性克隆。采用Co2+親和層析法純化rhGH。促去垂體家兔生長(zhǎng)法檢測(cè)rhGH體內(nèi)活性，同時(shí)采用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)重組蛋白誘生抗體滴度，分析其免疫原性。[結(jié)果]PCR擴(kuò)增得到696 bp的rhGH序列，雙酶切及測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的rhGH1 pOptiVEC質(zhì)粒正確。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MTX加壓使得蛋白表達(dá)量明顯提高。純化的rhGH能夠促進(jìn)去垂體家兔體重增加。誘生抗體滴度分析結(jié)果顯示該蛋白具有與市售商品化蛋白相似的免疫原性。[結(jié)論]真核表達(dá)rhGH蛋白能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，可用于相關(guān)藥物研究。

關(guān)鍵詞 重組人生長(zhǎng)激素；真核表達(dá)； 促生長(zhǎng)活性；免疫原性

中圖分類號(hào)：R335；Q291 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3305（2018）03-071-04

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.029

Abstract [Objective]To construct the stable expressing vector rhGH1 pOptiVEC for recombinant human growth hormone in CHO/DG44 dhfr cells and identified the growth promoting activity and immunogenicity. [Methods]rhGH gene was amplified by PCR. The PCR product and pOptiVEC vector were digested by double enzymes. Then the two digested products were jointed together with T4 ligase. Then the plasmid was transfected to CHO/DG44 dhfr cells and the positive clones were further screened by different concentration of MTX. The target protein was purified by Co2+ affinity chromatography and analyzed by SDS PAGE electrophoresis & western blot. The body weight gain tests of hypophysectomized rabbits were carried out for potency determination of rhGH in vitro. Rabbits were immunized with rhGH and the serum antibody was also determined by ELISA.[Results]The rhGH1 pOptiVEC vector was constructed correctly， which was proved by double enzymes digestion and DNA sequencing. The positive CHO/DG44 dhfr clones could stably express rhGH with 1000 nmol/L MTX and the molecular mass of the target protein was about 23 kDa. rhGH could be purified to a high concentration（90%）by Co2+ affinity chromatography. It also could promote hypophysectomized rabbits to grow up. The antibody induced by rhGH was similar to that induced by the commercially available drug.[Conclusions]The CHO/DG44 dhfr cells which can highly express rhGH had been successfully constructed. The rhGH protein with the similar growth promoting activity and immunogenicity to the commercially available drug had been also obtained.

Key words Recombinant human growth hormone（rhGH）；Eukaryotic expression；Growth promoting activity；Immunogenicity

人生長(zhǎng)激素（human growth hormone，hGH）是一個(gè)由191個(gè)氨基酸殘基組成的非糖基化蛋白質(zhì)激素[1]，分子量為22 KDa。該蛋白由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌，蛋白質(zhì)分泌量一般在青春期達(dá)到最大值[2-3]。目前人生長(zhǎng)激素主要用于治療兒童的生長(zhǎng)障礙和成人生長(zhǎng)激素缺乏癥（GHD），且具有良好的效果。同時(shí)，生長(zhǎng)激素也被批準(zhǔn)用于特納綜合癥、慢性腎功能不全、兒童特發(fā)性身材矮小、燒傷燙傷手術(shù)后的恢復(fù)以及脂肪積累相關(guān)的成人脂肪代謝障礙等[4]。早期，hGH主要來(lái)自于人類尸體腦垂體，產(chǎn)量非常低，因此科學(xué)家嘗試多種途徑人工合成GH。重組人生長(zhǎng)激素（recombi nant hGH，rhGH）是一種非天然的，由重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的基因工程藥物，最早由Martial等通過(guò)大腸桿菌中的原核表達(dá)而獲得。因此，直到1979年開發(fā)出第一個(gè)重組人生長(zhǎng)激素，hGH才得以進(jìn)行大規(guī)模的科學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用[5-7]。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者關(guān)注于重組人生長(zhǎng)激素穩(wěn)定表達(dá)體系的構(gòu)建。一個(gè)良好的載體需要具備能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄與翻譯的啟動(dòng)子，同時(shí)要確保蛋白序列的穩(wěn)定性[8-9]。該次試驗(yàn)構(gòu)建了rhGH真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)氨甲喋呤（MTX）加壓，在CHO/DG44細(xì)胞中成功表達(dá)rhGH。經(jīng)鑒定，該蛋白具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)活性，且具有與市售蛋白相似的免疫原性。該結(jié)果為高效表達(dá)rhGH提供試驗(yàn)支持，同時(shí)為rhGH在人體及動(dòng)物相關(guān)疾病治療方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5α、中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞DG44 dhfr 細(xì)胞株（CHO/DG44 dhfr ）由合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存。pOptiVEC質(zhì)粒、含hGH CDS序列的質(zhì)粒GC hGH1由合肥師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存；成年家兔（雌性，1.8～2.2 kg），購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。PrimeSTAR HS DNA ploymerase購(gòu)自TAKARA公司；T4 DNA ligase、dNTPs、Nhe I、Cla I限制性內(nèi)切酶、Pre stained protein Marker、Unstained protein Marker、BCA定量試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、氨甲喋呤（MTX）、無(wú)血清培養(yǎng)基CD Opti CHOTM Medium均購(gòu)自Thermo Fisher公司；DNA分子量Marker購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自成都福際生物公司；alpha MEM（+）、alpha MEM（-）培養(yǎng)基購(gòu)自GIBOCO公司；胎牛血清購(gòu)自HyClone公司；注射用重組人生長(zhǎng)激素由自安科生物惠贈(zèng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 表達(dá)載體rhGH1 pOptiVEC的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的hGH CDS序列設(shè)計(jì)引物，該引物由金唯智生物科技有限公司合成。上游引物rhGH1 F：5 attgctagcgccaccatggctacaggct 3、下游引物rhGH1 R：5 ttaatcgatctaatgat gatgatgatgatggaagccacagctg 3。rhGH 1 F含Nhe I酶切位點(diǎn)（GCTAGC）、Kozak序列、保護(hù)堿基。rhGH1 R含Cla I酶切位點(diǎn)（ATCGAT）、6×His Tag、終止密碼子、保護(hù)堿基。

以GC hGH1質(zhì)粒為模板，使用上述引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得rhGH表達(dá)片段。PCR體系：去離子水32.5 μl、5×反應(yīng)緩沖液10.0 μl、dNTP Mix 4.0 μl、上下游引物各1.0 μl、模板1.0 μl、PrimeStar DNA聚合酶0.5 μl。擴(kuò)增參數(shù)為：98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次后72℃延伸2 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并用膠回收試劑盒回收。

用Nhe I、Cla I雙酶切PCR產(chǎn)物及真核表達(dá)載體pOptiVEC。膠回收雙酶切產(chǎn)物，用T4連接酶16℃連接過(guò)夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素篩選陽(yáng)性單克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取無(wú)內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定后，將正確的真核表達(dá)質(zhì)粒命名為rhGH1 pOptiVEC。

1.3 MTX加壓建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株

1.3.1 轉(zhuǎn)染CHO/DG44 dhfr 細(xì)胞 將CHO/DG44 dhfr 細(xì)胞接種于alpha MEM（+）（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。參照Lipo fectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書，用重組質(zhì)粒rhGH1 pOptiVEC轉(zhuǎn)染CHO/DG44 dhfr 細(xì)胞，48 h后改用alpha MEM（-）（含5%胎牛血清）進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，每72 h更換培養(yǎng)基1次，使用G418進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的CHO/DG44 dhfr 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3.2 親和層析法純化rhGH蛋白 將篩選得到的陽(yáng)性細(xì)胞克隆培養(yǎng)2～3 d后，離心（5 000 r/min，5 min）收集培養(yǎng)基上清液，置于透析袋內(nèi)經(jīng)PEG20000吸水濃縮4 h，再參照Talon Metal Affinity Resin說(shuō)明書，采用Co2+親和層析法純化目的蛋白。吸取適量Co2+ beads置于空柱中，待beads完全沉淀后，添加10 ml磷酸鹽緩沖液平衡柱子。培養(yǎng)基上清倒入親和層析柱中，垂直旋轉(zhuǎn)1 h，使蛋白與beads充分結(jié)合。去塞子使上清流出，用10 ml磷酸鹽緩沖液洗柱2次，去除雜質(zhì)。10 mmol/L咪唑洗脫緩沖洗柱2次，去除非特異性結(jié)合蛋白。150 mmol/L咪唑洗脫緩沖洗柱，獲得rhGH蛋白。將蛋白加入超濾管進(jìn)行超濾，以TBS 緩沖液（Tris 3.028 g NaCl 8.766 g）為超濾緩沖液，超濾5次。最后倒置超濾，獲得目的蛋白。

1.3.3 SDS PAGE電泳及Western Blot檢測(cè) 采用SDS PAGE電泳法鑒定純化的目的蛋白。然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），經(jīng)5%脫脂奶粉封閉4 h后PBST（1×PBS + 0.1% Tween20）洗滌5次。用anti GH單克隆抗體孵育，洗滌并用HRP標(biāo)記的兔抗小鼠二抗孵育。最后采用ECL法曝光顯影。

1.3.4 MTX加壓獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞 對(duì)培養(yǎng)至匯合度90%且狀態(tài)良好的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行MTX加壓篩選。MTX濃度設(shè)為：50， 100， 200， 400， 800， 1 000，1 500 nmol/L，每個(gè)濃度加壓5代。待細(xì)胞在一個(gè)濃度MTX的條件下生長(zhǎng)到匯合度達(dá)90%時(shí)更換培養(yǎng)基為CD Opti CHOTM Medium，72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照1.3.3方法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。將表達(dá)量最高的克隆傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行下一個(gè)MTX濃度篩選。

獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞后，采用1.3.2方法純化目的蛋白，取少量蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)濃度，其余蛋白分裝經(jīng)液氮急凍再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

1.4 rhGH促去垂體家兔生長(zhǎng)活性分析

參照文獻(xiàn)[10-11]，采用徒手定向穿刺法射頻毀損家兔垂體，建立去腦垂體家兔模型，并于動(dòng)物房精心飼養(yǎng)2周后備用。將處理后家兔分為3組，即陽(yáng)性對(duì)照注射用重組人生長(zhǎng)激素組、目的蛋白rhGH組、陰性對(duì)照組，每組8只，記錄體重。陽(yáng)性對(duì)照組、rhGH組對(duì)家兔每日1次經(jīng)頸部皮下給藥，劑量為40 μg/kg，連續(xù)給藥5周。陰性對(duì)照組給予含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的生理鹽水。

記錄每只動(dòng)物給藥后體重與給藥前體重之差即：ΔW=Wi-W0，其中ΔW為體重增重；W0為給藥前體重；Wi為給藥后體重。以家兔體重增重ΔW為縱坐標(biāo)，給藥時(shí)間T為橫坐標(biāo)繪制體重增重-時(shí)間曲線。三組間用t檢驗(yàn)顯著性差異，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 rhGH免疫原性分析

參照文獻(xiàn)[12-13]采用ELISA間接法檢測(cè)rhGH誘生抗體的能力來(lái)分析rhGH免疫原性。將體重約為2.0 kg的雌兔隨機(jī)分為3組，每組3只。每周一、四、日分別皮下注射給藥：rhGH、注射用重組人生長(zhǎng)激素及生理鹽水，單次劑量為100 μg/kg，連續(xù)給藥3周。給藥后每周耳緣靜脈取血1次，離心取上清。將血清用PBS稀釋成1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000的滴度梯度作為一抗包被酶標(biāo)板，洗滌酶標(biāo)板后用BSA封閉，再用HRP-羊抗兔為二抗，OPD顯色并于酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)吸收度（A490）。同時(shí)，設(shè)置空白血清孔，計(jì)算樣本孔與空白血清孔的A490比值，當(dāng)A490樣本∶A490空白血清≥2.1，判斷該樣本抗體呈陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 rhGh1 pOptiVEC真核表達(dá)載體的構(gòu)建

已知rhGH基因長(zhǎng)度為696 bp，用1.2中引物PCR擴(kuò)增后目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

獲得的重組質(zhì)粒rhGH1 pOptiVEC經(jīng)Nhe I、Cla I雙酶切后，瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到了分別與預(yù)期載體及插入片段長(zhǎng)度相符的2條帶（圖2），表明目的片段已成功插入到表達(dá)載體中。將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測(cè)序，結(jié)果顯示序列正確。

2.2 rhGH的SDS PAGE電泳及West ern Blot檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。72 h后離心收集培養(yǎng)基上清，采用Co2+親和層析法純化帶His標(biāo)簽的rhGH蛋白。純化過(guò)程中經(jīng)咪唑梯度濃度洗脫，選擇最適洗脫濃度，最終選用150 mmol/L咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。親和層析法純化的rhGH蛋白進(jìn)行SDS PAGE電泳，如圖3所示，目的蛋白分子量約為23 kDa，與預(yù)期大小一致，且純化蛋白純度達(dá)90%，純化方法可用于大量蛋白提取。用anti hGH單克隆抗體對(duì)目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果如圖4所示，在約23 KDa處有信號(hào)，說(shuō)明純化的蛋白為rhGH。

2.3 MTX濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響

用不同濃度MTX對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行加壓篩選，經(jīng)蛋白純化后對(duì)目的蛋白進(jìn)行表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)MTX濃度影響蛋白的表達(dá)。隨MTX濃度增加，蛋白表達(dá)量明顯升高（表1）。當(dāng)MTX濃度達(dá)到1 000 nmol/L時(shí)，表達(dá)量最高，而MTX濃度進(jìn)一步增大時(shí)，蛋白表達(dá)量無(wú)明顯增加。因此，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，選擇1 000 nmol/L MTX加壓。

2.4 rhGH體內(nèi)促去垂體家兔生長(zhǎng)活性檢測(cè)

由去垂體家兔凈增體重-時(shí)間曲線（圖5）可以得出，注射rhGH和陽(yáng)性對(duì)照的去垂體家兔在6周內(nèi)體重明顯增加。因生長(zhǎng)激素體內(nèi)代謝較快，體內(nèi)活性無(wú)法長(zhǎng)期維持，所以給藥第5周后2組家兔體重增幅減緩。注射含牛血清白蛋白生理鹽水的對(duì)照組家兔在6周內(nèi)體重沒有明顯變化。而rhGH組與陽(yáng)性對(duì)照組體重增加沒有明顯差異，同樣能顯著地促進(jìn)去垂體家兔體重增加。由此可見，經(jīng)該次試驗(yàn)構(gòu)建的真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化出的rhGH具有促進(jìn)生長(zhǎng)的活性。

2.5 rhGH免疫原性分析

對(duì)經(jīng)rhGH蛋白免疫的家兔提取血清，在490 nm處檢測(cè)檢測(cè)誘生抗體的低度。以空白血清作為陰性對(duì)照，當(dāng)A490樣本∶A490空白血清≥2.1時(shí)，可判斷該家兔產(chǎn)生了抗rhGH的抗體。從圖6可以看出，注射了rhGH的家兔在1周后即開始產(chǎn)生抗體，且抗體滴度在2周后快速達(dá)到最大值。隨著rhGH在體內(nèi)的代謝，抗體滴度在維持一定時(shí)間后逐漸下降。rhGH與商品化的注射用重組人生長(zhǎng)激素在抗體滴度以及維持時(shí)間方面沒有明顯差異。生理鹽水組抗體一直呈陰性，故圖中不顯示。

3 結(jié)論與討論

作為一種多肽激素，GH是調(diào)控有機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)的主要作用因子。其通過(guò)刺激體細(xì)胞的增大和數(shù)量增多，進(jìn)而促進(jìn)有機(jī)體所有組織的發(fā)育和增大。此外，生長(zhǎng)激素對(duì)免疫系統(tǒng)的影響也受到關(guān)注。有報(bào)道稱，生長(zhǎng)激素對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、NK細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等均有調(diào)節(jié)作用，并能影響IL 2、IL 2R、IFN γ和TNF α等細(xì)胞因子的分泌，與機(jī)體的免疫系統(tǒng)關(guān)系密切[14]。目前，hGH的基因工程產(chǎn)品已用于多種疾病的治療[15-17]，但由于hGH半壽期很短，必須長(zhǎng)期注射，這就導(dǎo)致病患各種各樣的副作用，且費(fèi)用高，在一定程度上影響其廣泛的臨床應(yīng)用[18-19]。

在該次研究中，參照GenBank設(shè)計(jì)rhGH的擴(kuò)增引物，使得表達(dá)序列帶有His純化標(biāo)簽，同時(shí)序列保留信號(hào)肽部分，便于細(xì)胞表達(dá)后蛋白的收集。然后將rhGH與pOptiVEC連接，構(gòu)建了rhGH1 pOptiVEC真核表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒上含有IRES序列，因而可以將目的基因和DHFR基因連接在一起構(gòu)建雙順反子表達(dá)載體，以共同的效率和比例表達(dá)目的基因和DHFR基因。其次，該次試驗(yàn)選用CHO/DG44 dhfr 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)rhGH。該細(xì)胞在真核表達(dá)方面具有多重優(yōu)勢(shì)。外源蛋白在CHO細(xì)胞中能夠以分泌形式釋放到培養(yǎng)基中，且蛋白可進(jìn)行折疊、切割以及修飾加工，使得其結(jié)構(gòu)和功能均與天然蛋白相似。同時(shí)，該細(xì)胞為二氫葉酸還原酶（dhfr）缺陷型，在MTX選擇壓力下，編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴(kuò)增而擴(kuò)增，大幅提高蛋白產(chǎn)量。文中當(dāng)MTX濃度為1 000 nmol/L時(shí)，rhGH蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。將該重組蛋白作用于去垂體家兔，可在6周內(nèi)促進(jìn)家兔體重增加。同時(shí)通過(guò)免疫動(dòng)物，分析該蛋白免疫原性。7周內(nèi)，該重組蛋白誘生抗體滴度與注射用重組人生長(zhǎng)激素相似。以上結(jié)果表明，該次試驗(yàn)所建立的真核表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)出大量rhGH，且該重組蛋白無(wú)論是體內(nèi)活性亦或是免疫原性，均與市售的注射用藥物相似。

該次試構(gòu)建的rhGH真核表達(dá)系統(tǒng)為大規(guī)模制備rhGH提供了一定的參考依據(jù)，也為研究hGH的各種生理功能、作用機(jī)制以及人體及家畜相關(guān)疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：劉赟