摘要：為了考察知母飲片、水煎劑和配方顆粒之間化學成分的差異，采用HPLC法對三者的指紋圖譜進行了相關性研究。選用Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動相A，1%醋酸為流動相B進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為265 nm，采集時間為100 min，分別建立10 批知母飲片、10批知母水煎劑與10批知母配方顆粒的指紋圖譜。結果顯示，10批知母配方顆粒HPLC 指紋圖譜的9個指紋峰均可在飲片中得到追蹤，相似度均大于0.95，從9個共有峰中指認出芒果苷，知母飲片、水煎劑和配方顆粒的主要化學成分基本相同。本研究所建立的指紋圖譜方法重復性、穩(wěn)定性好，可用于飲片、配方顆粒生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

關鍵詞：中藥藥劑學；知母飲片；水煎劑；配方顆粒； HPLC；指紋圖譜

中圖分類號：R917文獻標志碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx03012

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根莖，具有滋陰降火、潤燥滑腸等功效[1]，其主要成分有薩爾薩皂苷元、嗎爾考皂苷元等，黃酮類有芒果苷、異芒果苷，多糖類有4種知母多糖（Anemarn A，B，C，D），生物堿類有膽堿、尼克酰胺及有機酸等[2-3]。知母配方顆粒是以符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定的知母飲片為原料，水作為提取溶媒，經(jīng)減壓濃縮、噴霧干燥、制粒加工而成，具有服用方便、便于攜帶、療效確切等優(yōu)點。第3期李軍山：知母飲片、水煎劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜相關性研究河北工業(yè)科技第35卷但知母飲片經(jīng)加工制成配方顆粒后，失去了傳統(tǒng)飲片的特征。為了全面客觀地評價傳統(tǒng)飲片、水煎劑與配方顆粒之間的關聯(lián)性，采用HPLC 法分別建立了知母飲片、水煎劑和配方顆粒的指紋圖譜，比較三者之間的差別，為配方顆粒臨床應用提供數(shù)據(jù)支撐。

1主要儀器與試劑

日本島津LC-20A高效液相色譜儀，賽多利斯CP225D 型電子分析天平，山東濟寧JCX-250超聲提取器。

知母對照藥材（批號為121070-201105），芒果苷對照品（批號為111607-201503），購自中國食品藥品檢定研究院；10批知母飲片來源見表1（編號為S1—S10），經(jīng)河北省食品藥品檢驗所鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根莖；10批知母配方顆粒（編號為B1—B10）見表2，由神威藥業(yè)集團有限公司提供；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。相似度計算軟件采用2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)。

2實驗方法

2.1溶液制備

2.1.1對照品溶液的制備

取芒果苷對照品10.85 mg，精確稱定，置于200 mL容量瓶中，加入稀乙醇（取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL）溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2飲片供試品溶液的制備

取知母飲片粉末（過3號篩）1 g，精密稱定，加入70 %（體積分數(shù)，下同）甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，共計109.65 g，超聲1 h，放冷，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，然后以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。過濾，即得。

2.1.3水煎劑供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地的合格知母飲片100 g，加9倍水浸泡30 min，然后加熱煎煮30 min，藥液用0.074 mm（200目）篩過濾。將藥渣再加7倍水煎煮，藥液用0074 mm（200目）篩過濾。合并2次濾液，真空旋蒸，于75 ℃旋至半干，然后放入烘箱烘干。將所得膏粉稱重，研細，用藥匙精確稱取0.5 g膏粉，加入70%的甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲0.5 h，放冷，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，即得。

2.1.4配方顆粒供試品溶液的制備

將知母配方顆粒研細，取約0.1 g，加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲0.5 h，放冷，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，即得。

2.2色譜條件[4-16]

色譜柱：Inertsil ODS-3 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，1%醋酸為流動相B，梯度洗脫條件見表3，檢測波長為265 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.3方法學考察

2.3.1系統(tǒng)適用性及專屬性試驗

取對照品溶液，飲片、水煎劑、配方顆粒供試品溶液和陰性樣品溶液進行檢測，考察實驗方法的適用性及專屬性，結果見圖1。由圖1可以看出，樣品中各個峰分離較好，峰形對稱，且陰性無干擾，表明方法的適用性及專屬性良好。

2.3.2精密度試驗

按照2.1項方法制備知母配方顆粒的供試品溶液，進樣6 次。結果發(fā)現(xiàn)，各主要指紋峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值為0.58%～1.62%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗

按照2.1 項方法制備知母配方顆粒的供試品溶液，分別于制備后的0，2，4，6，8，10 h 時檢測。結果發(fā)現(xiàn)，各主要指紋峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值為0.86%～1.05%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復性試驗

按照2.1 項方法制備6 份知母配方顆粒的供試品溶液，依前述方法測定。結果發(fā)現(xiàn)，各主要指紋峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值為072%～172%，表明方法的重復性良好。

2.4樣品測定

分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，按照擬訂的色譜條件進行測定，記錄100 min的色譜圖。

3結果與討論

31指放圖譜的建立

參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，分別進行知母飲片、知母水煎劑、知母配方顆粒HPLC 指紋圖譜測定，色譜圖見圖2—圖4。

3.2參照峰的選擇與共有指紋峰的標定

設定積分參數(shù)如下： 積分起止時間為10～100 min，斜率靈敏度為5，峰寬為0.03，最小峰的峰面積占總峰面積的比例大于1%。通過比對知母飲片、水煎劑、配方顆粒的指紋圖譜，選定三者均有的9個指紋峰作為共有峰。采用2012版指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件自動匹配知母配方顆粒HPLC 圖譜的相關參數(shù)，共有指紋峰面積均大于色譜峰總面積的90%。通過與對照品色譜圖比較可知，在指紋圖譜的9個共有峰中，峰3為知母素。分析結果見表4。

3.3相似度分析

采用2012版指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件計算相似度。以10批知母飲片、水煎劑、配方顆粒指紋圖譜生成共有模式為對照，計算飲片、水煎劑、配方顆粒的相似度，結果見表5，關聯(lián)指紋圖譜見圖5。

3.4方法選擇

比較了甲醇-1%磷酸、乙腈-1%磷酸、乙腈-1%醋酸3種流動相梯度洗脫的效果。結果表明，以乙腈-1%醋酸為流動相梯度洗脫，峰形及分離度均較好。全波長掃描顯示，在265 nm處有吸收峰，此檢測波長色譜圖的色譜峰數(shù)量較多，峰形和分離度較好。柱溫分別選用25，30，35 ℃，進樣分析結果顯示，30 ℃的峰形及分離度較好。

3.5特征峰鑒別

采用梯度洗脫，以便檢測出不同極性成分。本方法共檢出知母飲片、水煎劑、配方顆粒的9個主要特征峰，相似度均在0.97以上，說明知母飲片、水煎劑、配方顆粒較穩(wěn)定。飲片-水煎劑、飲片-配方顆粒、水煎劑-配方顆粒間的相似度均在0.95以上，表明知母飲片與知母水煎劑、知母配方顆粒在化學成分上的一致性。采用對照品對照，鑒別峰3為芒果苷峰。

4結語

本研究所建立的指紋圖譜分析方法重復性和穩(wěn)定性好，可用于飲片、配方顆粒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。中藥配方顆粒已失去飲片外觀形態(tài)及顯微特性，難以進行直觀鑒別，且僅將某成分含量限度作為配方顆粒質(zhì)量控制指標較難全面反映配方顆粒的整體面貌[17-20]。而中藥指紋圖譜能最大限度獲取有用的化學信息，較全面地反映從飲片加工到配方顆粒整個生產(chǎn)過程中化學成分方面的細微差異，有效控制中藥產(chǎn)品質(zhì)量。

中藥配方顆粒提取方式與傳統(tǒng)湯劑的煎煮方法相同，符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)用藥的方式，提取出的藥效成分與傳統(tǒng)湯劑的藥效成分近似。但在傳統(tǒng)湯劑合煎過程中，存在藥效成分的相互作用，如增溶助溶、拮抗抑制等，而中藥配方顆粒為單煎提取制粒，因此，對于配方顆粒與傳統(tǒng)合煎湯劑的物質(zhì)基礎差異及其導致的藥效區(qū)別均有待進行更為深入的研究。

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