齊璐璐 馬慶

摘要 應用聚合酶鏈式反應技術從魯原92自交系玉米基因組中擴增了Zmrr3基因的第5外顯子特異性片段，并以測序過的目的片段構建了RNAi的載體pCAMBIA303+RNAi+2F，該載體還有潮霉素、卡那霉素、GUS等篩選基因?？梢杂糜诩毎至阉卣{控葉序變化的分子機制研究。

關鍵詞 細胞分裂素；小干涉RNA；表達載體的構建；玉米

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2018）03-003-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.002

Abstract The PCR technique was used to amplify the exonspecific segments of Zmrr3 gene from Luyuan 92 of maize genome， and the Expression Vector with RNAi expression pCAMBIA303+RNAi+2F was constructed with the sequence of the target fragment， which contains Hygromycin， kanamycin kanamycin and GUS slective gene. It can be used to study the relation between cytokinins and phyllotaxis of Maizet in molecular mechanism.

Key words Zmrr3 gene； Small interference RNA； Construction of expression vector； Maize

玉米是禾本科黍屬（Zea）中僅有的一個種（Mays）。國內關于對生玉米的性狀具體研究早在1971年時就有過報道，調節(jié)植物生長的重要基因和內外環(huán)境可能是植物葉發(fā)育進過程中的兩大重要因素。而在玉米對生葉序突變體的研究發(fā)現(xiàn)其內源細胞分裂素的水平升高是對生突變的重要特征，但是這個結果還不能清楚解釋葉序排列是如何發(fā)生的。美國冷泉港實驗室的研究報道認為在玉米中細胞分裂素調控基因Zmrr3發(fā)生轉座導致了其葉序對生的形成。ABPH蛋白是細胞分裂素調控基因Zmrr3的表達產物，只要是通過植物內源細胞分裂素的誘導，在內源細胞分裂素的作用下其在玉米頂端分生組織的空間表達迅速改變，因此會造成葉原基排布的變化。為進一步了解在玉米葉原基分化類型轉換的調控中外源細胞分裂素所起的作用，設計了對玉米胚添加不同濃度的細胞分裂素處理，最終互生玉米幼胚莖尖分生組織位點在較高濃度的外源細胞分裂素的處理下發(fā)生膨大，但并未改變成對生植株，這可能與可獲得的玉米胚材料葉原基已經(jīng)形成有關。

RNA干涉是指雙鏈RNA在是指由短雙鏈 RNA 誘導的同源 RNA 降解，從而導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表現(xiàn)型缺失的現(xiàn)象。Cioppa 等人為篩選煙草耐旱或抗病等優(yōu)良性狀，用煙草 mosaic 病毒導入了不同的遺傳序列，進而系統(tǒng)地進行基因敲除來實現(xiàn)。Knutzon等向油菜中導入硬脂酸ACP脫飽和酶的反義基因，結果直接使得其種子硬脂酸含量由2%提高到40%且轉基因植株生活力正常。在植物的遺傳發(fā)育及作物的抗病及優(yōu)良品種選育等領域，RNAi應用的比較廣泛。因此，為驗證細胞分裂素與玉米葉序類型之間的關系，該次試驗設計構建了細胞分裂素調控基因Zmrr3RNAi載體，以期為進一步研究細胞分裂素與葉序類型轉換之間的關系奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 作物材料 互生玉米自交系魯源92葉片。

1.1.2 菌種及質粒 質粒轉化受體菌DH5α、載體pCAMBIA1303安徽省作物生物學重點實驗室提供；農桿菌 LBA4404，中科院等離子體物理研究所植物分子生物學實驗室提供；質粒pUCCRNAi，中科院遺傳所提供。

1.1.3 酶及試劑 MgCl2、PCR buffer、dNTPs、和Taq DNA聚合酶，購自上海生工生物工程有限公司；限制性內切酶和T4DNA連接酶，購自 Takara大連寶生物工程有限公司，PCR Marker DL2000和Genome DNA Markerλ＼HindⅢ，購自Takara公司；AS（乙酰丁香酮）、TrisHCl和RNase，購自Promega公司；DNA抽提純化試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；其他常用藥品均為國產分析純試劑。Takara大連寶生物工程有限公司完成PCR引物由合成，上海博亞生物工程公司完成測序服務。

1.2 細胞分裂素Zmrr3基因片段的PCR擴增

通過NCBI網(wǎng)站獲取玉米細胞分裂素調控基因Zmrr3的全長基因序列和cDNA序列。運用clustal W軟件對以上序列進行同源性搜索和比對分析，確定目的基因片段序列為玉米Zmrr3基因的第5個外顯子特異序列共86 bp。分別在正、反向上游引物的5分別添加了BamHⅠ。正向下游、引物的5分別添加了NcoⅠ和XbaⅠ位點，反向下游引物的5添加了XbaⅠ位點，采用手工設計，并利用引物設計程序進行輔助分析。（目的片段加酶切位點和保護堿基后的總大小如下， 正向片段109 bp； 反向片段103 bp）

正、反向上游引物：5ATAGGATCCGCGGCAAGTAGTAGCACAGC3

正向下游引物：5CCTCTAGACCATGGAATGCCGCTGCTACAGCTAC3

反向下游引物：5CCTCTAGAAATGCCGCTGCTACAGCTAC3

劃線部分為酶切位點，其評估與優(yōu)化工作由Primer Design程序完成。

通過Biometra96梯度PCR儀擴增，PCR擴增反應體系（50 μl）：ddH2O，37.6 μl；3primer（10 μmol/L），2 μl；5primer（10 μmol/L），2 μl；dNTP（10 mmol/L），1 μl；10×PCR buffer（包括MgCl2）， 5 μl； Template（50 ng/μl），2 μl；Taq DNA polymerase（5 U/μl），0.4 μl。

PCR優(yōu)化反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，62.5℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

擴增后的產物在含有0.5 μg/ml溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為5 V/cm，電泳結果由Kodark凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄分析。

1.3 PCR產物的克隆、篩選和序列分析

PCR產物電泳回收后，與pMD18T vector以3∶1的比例，加Ligation Solution I 4.0 ml混勻，l6℃反應過夜，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α。挑選白斑用堿裂解法提取質粒，限制性內切酶酶切鑒定，得到重組質粒，其中插入的目的基因，測序完成后用DNASIS軟件進行核酸序列分析。

1.4 siRNA表達載體的建立

將pUCCRNAi質粒和PCR產物分別用XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切，酶切反應體系為20 μl，具體為：pUCCRNAi或純化的PCR片段1 μl，10×bufferM 8 μl，XbaⅠ1 μl，1%BSA 0.1μl，電動混勻，37℃保溫6 h，60℃滅活15 min。再加入ddH2O 7 μl，10×bufferK 2 μl，BamHⅠ 1 μl，電動混勻，30℃保溫3 h，60℃滅活15 min，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒚盖泻蟮妮d體與擴增產物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳，并且將膠純化回收的片段置于16℃連接過夜，連接反應體系如表1所示。

將PCR擴增的目的基因片段和pUCCRNAi質粒分別用BamHⅠ、XbaⅠ酶切、連接，得重組質粒pUCRNAi+1F，并酶切驗證；對重組質粒pUCRNAi+1F進行BglⅡ、SpeⅠ雙酶切，再與用BamHⅠ、NcoⅠ雙酶切的目的片段連接，從而構建成含有正反目的片段的pUCRNAi+2F載體，酶切驗證同上。然后對pUCRNAi+2F載體進行SpeⅠ與NcoⅠ雙酶切，回收目的片段，然后與經(jīng)過SpeⅠ與NcoⅠ雙酶切雙酶切的pCAMBIA1303載體進行連接，構建成pCAMBIA1303+RNAi+2F載體如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 目的基因片段的獲得

采用CTAB法提取自交系魯原92玉米葉片基因組，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測如圖2所示，表明提取的玉米基因組主帶清晰，OD260/OD280均在1.8～2.0之間，符合試驗要求。

2.2 細胞分裂素Zmrr3基因片段擴增

使用引物1和2擴增Zmrr3基因的第5個外顯子片段， 并通過于3.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示，分別得到與預期目的片段大小一致的單一擴增帶。pMD18T載體與擴增目的條帶回收后連接并轉化大腸桿菌DH5α。篩選出陽性克隆，經(jīng)酶切分析，分別得到103 bp和109 bp大小的2條片段。說明按預期設計，該目的基因插入到載體上。并通過測序驗證了其正、反序列與已發(fā)表的基因一致。

2.3 pCAMBIA1303+RNAi+2F載體的構建

Zmrr3基因PCR擴增的109 bp的正向片段和pUCCRNAi質粒分別用XbaⅠ、BamHⅠ酶切、連接，篩選重組質粒pUCRNAi+1F，并通過PstⅠ酶切鑒定，得到一條約362 bp特異帶，證明109 bp的干涉片段已經(jīng)正向連接在pUCCRNAi載體上。對重組質粒pUCRNAi+1F進行BglⅡ、 SpeⅠ雙酶切，然后與NcoⅠ、 BamHⅠ雙酶切的103 bp的反向目的片段連接，PstⅠ酶切驗證重組質粒pUCRNAi+2F，得到465bp的特異帶，表明反向干涉片段已反接到pUCCRNAi載體上，如圖4所示。

對SpeⅠ、NcoⅠ雙酶切后的pUCRNAi+2F載體和pCAMBIA1303載體連接，構建成pCAMBIA1303+RNAi+2F載體。并通過酶切（XhoⅠ）驗證構建pCAMBIA1303+RNAi+2F載體，得到1 094 bp特異帶如圖5所示。表明pUCRNAi+2F片段已連接到pCAMBIA1303載體上，從而方便以后將目的片段通過農桿菌介導轉入玉米優(yōu)良自交系。

3 結論與討論

RNA干涉技術發(fā)展迅速，已廣泛應用于動植物的相關基因的功能研究。如果后續(xù)Zmrr3干涉的載體轉化能夠達到預期結果，即可以直觀地觀察到葉序的變化時，那么也可以考慮將載體中的正反干涉片段作為一種篩選標記基因整合到欲轉化的載體上，通過轉化過程中抑制細胞分裂素調控基因的表達導致葉序的轉變來起到篩選的作用。其優(yōu)點表現(xiàn)為以下2點：①篩選方便，可直接根據(jù)觀測到的葉序類型的變化來判斷是否轉入到受體植株中；②安全，高效。普遍使用的常規(guī)抗生素篩選標記，如氨卞青霉素、卡那霉素、潮霉素等，其在篩選過程中均會造成不少轉基因植株的死亡，從而在不同程度上影響了轉基因的效率。而若使用干涉片段作為篩選標記時，該環(huán)節(jié)的損失相對有所減少，提高了轉基因的效率。

此外，椐報道RNAi介導的基因沉默可能受環(huán)境的影響，基因沉默可能收到溫度方面的影響。溫度越低，基因沉默越易受到抑制， siRNAs 同時也會隨之降低；反之，溫度越高， 基因沉默越容易被激活，且siRNAs也隨之增加。所以在后續(xù)的載體保存和轉化中還應注意試驗溫度的影響。

有研究報道有些植物對卡那霉素不敏感，玉米也是其中之一，但很多文獻報道玉米、小麥等對潮霉素較敏感，因此潮霉素是玉米等作物轉基因植株較理想的篩選標記。該次試驗中構建的細胞分裂素Zmrr3干涉的表達載體中含有潮霉素抗性基因，并且還含有GUS檢測基因，利用GUS作為報告基因，為后續(xù)轉化體的瞬時檢測提供了方便。

參考文獻

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責任編輯：劉赟