古少波 李志瑕 杜倩 楊春飛 關(guān)發(fā)旭 蔡勇

摘要：從蘭州大尾羊、小尾寒羊、藏羊瘤胃液中分離出具有較強(qiáng)纖維素分解能力的菌株，測定其產(chǎn)酶特性，為進(jìn)一步開發(fā)綿羊纖維素酶飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。進(jìn)而采集新鮮瘤胃液，接種于羧甲基纖維素鈉平板，通過剛果紅染色和液體復(fù)篩培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出纖維素分解能力較強(qiáng)的好氧細(xì)菌。形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)與16SrDNA序列分析方法相結(jié)合對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)纖維素分解能力最強(qiáng)的1株細(xì)菌進(jìn)行不同條件下酶活力測定。發(fā)現(xiàn)分離得到一株纖維素分解能力最強(qiáng)的菌株命名為SD-1。經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定，該菌屬芽孢桿菌。對(duì)SD-1進(jìn)行獨(dú)立單因子試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SD-1最適發(fā)酵溫度為40℃，最適發(fā)酵pH為6.5，最佳發(fā)酵時(shí)間為12 h，最佳碳源及氮源分別為淀粉和酵母浸出物。

關(guān)鍵詞：SD-1；纖維素分解菌；酶活力

中圖分類號(hào)：X70 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.003

秸稈纖維質(zhì)是地球上最廉價(jià)、最豐富的有機(jī)資源。我國農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量每年就有6億t左右[1]。由于纖維素外層被木質(zhì)素所包裹，具有水不溶性的高結(jié)晶結(jié)構(gòu)且含糖量較低，作為粗飼料時(shí)消化率較低。目前仍沒有高效利用纖維素資源的方法，除了在飼喂牲畜、造紙、紡織、酒精發(fā)酵等方面利用一部分以外，其余大部分都被就地焚燒還田。不僅造成資源的極大浪費(fèi)，還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。運(yùn)用微生物技術(shù)處理秸稈，提高粗飼料中蛋白質(zhì)及可溶性糖含量被認(rèn)為是有效解決這一問題的出路。前人通過酸堿及蒸汽處理纖維素[2-4]，但這些方法存在降解產(chǎn)物得不到較高回收且造成二次污染的弊端，使得應(yīng)用受到極大限制。利用微生物產(chǎn)酶分解纖維素具有條件溫和、產(chǎn)物回收率高、污染較小等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前研究如何高效利用纖維素的熱點(diǎn)。主要的技術(shù)方法是利用微生物將秸稈中的纖維素等有機(jī)質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為可利用的簡單的低聚糖類、乙醇等能源或其它化工產(chǎn)品。產(chǎn)纖維素酶的微生物種類很多，目前國內(nèi)外已分離篩選出53個(gè)屬的數(shù)千個(gè)菌株[5-6]，這些菌種大多來自動(dòng)物糞便、土壤、林場、造紙廠等。蔡勇等[7]從造紙廠腐爛紙漿中分離出一株堿性纖維素分解菌，該菌具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，適用于洗滌工業(yè)酶制劑要求。白寶偉等[8]從棉稈腐解物中分離得到一株能夠高效分解棉桿的真菌，該菌具有較強(qiáng)的耐高溫性和耐堿性。王得武等[9]利用失重法及不同初始酸堿條件下研究纖維素分解菌群對(duì)不同纖維質(zhì)材料的分解能力，結(jié)果表明所分離的菌群對(duì)秸稈類木質(zhì)纖維材料具有較強(qiáng)的分解能力。付傳明等[10]從腐爛植物及朽木分離純化得到三株具有較強(qiáng)纖維素分解能力的絲狀真菌，并通過誘變處理，使突變菌種較之前具有更強(qiáng)的纖維素分解能力。朱博雅[11]從玉米農(nóng)田土壤中分離篩選得到一株鏈霉菌株，該菌株能夠促進(jìn)堆肥的腐熟。楊艷[12]從腐朽木材和枝條中分離得到一株鏈霉菌，通過不同生理?xiàng)l件下培養(yǎng)比較并對(duì)其產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究，從而對(duì)提高纖維素降解菌降解效率。劉曉梅等[13]利用杏鮑菇菌渣分離篩選出了高效分解纖維素菌株，為菌渣發(fā)酵腐熟堆肥提供了優(yōu)質(zhì)菌種。王少昆等[14]從科爾沁沙質(zhì)草地土壤中分離得到一株偽彎頭曲霉和一株尖孢鐮刀菌，這兩株菌對(duì)沙地凋落物分解和土壤有效養(yǎng)分輸入起到促進(jìn)作用。張盼等[15]從稻田腐質(zhì)土壤中分離得到三株糞產(chǎn)堿桿菌和一株解糖假蒼白桿菌，四株菌對(duì)秸稈的降解較自然降解均有較高效率。

瘤胃作為天然的、迄今已知降解纖維素能力最強(qiáng)的發(fā)酵罐，是反芻動(dòng)物體內(nèi)的飼料加工廠。瘤胃中生活著大量能夠分解纖維素的微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌、原蟲。目前人們也開展了一些從反芻動(dòng)物瘤胃液中分離篩選纖維素分解菌的研究工作。劉玉承等[16]從綿羊瘤胃內(nèi)容物中分離得到一株黃色瘤胃球菌和一株丁酸弧菌。周非帆[17]從蒙古綿羊瘤胃內(nèi)容物中分離得到4株纖維素分解細(xì)菌，分別為糞腸球菌、拜氏梭菌、白色瘤胃球菌、丁酸梭菌。李潤泫等[18]從牦牛瘤胃內(nèi)容物中分離得到4種產(chǎn)纖維素菌株，這些分離的菌株可為下一步關(guān)于產(chǎn)纖維素酶對(duì)牦牛生理、生活的影響以及產(chǎn)纖維素酶的研究奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。作者從3種綿羊瘤胃內(nèi)容物中分離純化出一株纖維素分解能力較強(qiáng)的細(xì)菌，對(duì)該菌在不同pH、溫度、碳源、氮源、培養(yǎng)時(shí)間等理化因素下進(jìn)行酶活測定，旨在檢測該菌在分解纖維素方面的最佳條件，為生產(chǎn)微生物制劑及飼料添加劑提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

瘤胃內(nèi)容物均來自永靖縣瑞霖養(yǎng)殖科技有限公司，健康狀況良好的蘭州大尾羊、小尾寒羊、藏羊。無菌采集瘤胃內(nèi)容物經(jīng)四層紗布過濾后帶回實(shí)驗(yàn)室，添加10%甘油后置于-80℃冰箱備用。

1.2 培養(yǎng)基及溶液

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉液體復(fù)篩培養(yǎng)基、0.5%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、3，5-二硝基水楊酸顯色液（DNS液）、CMC-Na磷酸緩沖液、1M NaCl 溶液。

1.3 方法

1.3.1 纖維素分解菌的分離及初篩

取新鮮瘤胃液適當(dāng)稀釋，涂布于羧甲基纖維素鈉平板，37℃恒溫培養(yǎng)12 h。加入1 mg/mL的剛果紅染液適量，30 min后棄去染液，加入適量1mol/L NaCl 溶液洗滌15 min，將菌落水解圈直徑與菌落直徑比值（D/d）較大的菌種進(jìn)一步分離純化，得到菌體的純培養(yǎng)。經(jīng)反復(fù)分離篩選得到D/d值較大的菌株若干。

1.3.2 菌種復(fù)篩

將初篩后水解圈較大的菌種接種于液體復(fù)篩培養(yǎng)基，37℃、225rpm連續(xù)發(fā)酵16 h，菌液經(jīng)8000rpm、4℃離心10 min，所得上清即為粗酶液，通過測定粗酶液的活性，篩選出纖維素分解能力最強(qiáng)的菌株SD-1。

1.3.3 菌種16SrDNA法鑒定

1.3.3.1 菌種基因組DNA提取

使用試劑盒TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit ver.2.0進(jìn)行菌種基因組DNA提取。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3.3.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物為：27F：5?-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3?，1492R： 5?-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3?。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.3.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系：DNA模板0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×Power Taq PCR MasterMix 11μL，加ddH2O至20μL。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)30次，72℃再延伸8 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3.4 進(jìn)化樹的構(gòu)建

將經(jīng)過PCR擴(kuò)增后特異性良好的產(chǎn)物移交測序，獲得SD-1菌種16SrDNA序列信息。將得到的堿基序列通過Genbank比對(duì)后構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹。測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0.5%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0（mL）至50 ml容量瓶，定容至刻度，各取1.5 ml至比色管中，加入1.5 ml DNS液于沸水中水浴5 min，冷卻后稀釋8倍并測量不同含量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液540 nm下吸光度值。利用Excel 2010軟件，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（酶活力）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為A540=0.0737U-0.0025，R2=0.9994，線性關(guān)系良好，能夠用于酶活力的測定。

1.3.5 菌體生長測定

發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)適當(dāng)稀釋，在600 nm紫外光處測其吸光度值，記為A600 nm。參比物為稀釋相同倍數(shù)的未接種培養(yǎng)基。

1.3.6 羧甲基纖維素酶活（CMCase）測定

加入1 mlCMC-Na磷酸緩沖液（pH4.5）于比色管內(nèi)，加入0.5 ml粗酶液，50℃水浴30 min后迅速加入1.5 ml DNS液置于沸水浴中5 min。作空白對(duì)照為加入CMC-Na磷酸緩沖液及粗酶液后直接加1.5 ml DNS液，沸水浴5 min。測定其在540 nm處的吸光度值。將在上述反應(yīng)條件下由底物轉(zhuǎn)變?yōu)?0 ug 還原糖所需酶量定義為一個(gè)酶活力，以U/ml表示。

1.4 各獨(dú)立單因子對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響

1.4.1 pH對(duì)SD-1產(chǎn)酶的影響

設(shè)置產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基pH梯度為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。接菌后于37℃、225rpm培養(yǎng)16 h測其A540 nm并計(jì)算酶活及其菌體A600 nm值。

1.4.2 溫度對(duì)SD-1產(chǎn)酶的影響

設(shè)置溫度梯度為25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃、46℃、49℃，在最適pH下發(fā)酵16 h，測其A540 nm并計(jì)算酶活及其菌體A600 nm值。

1.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SD-1產(chǎn)酶的影響

設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為12 h、17 h、22 h、27 h、32 h、37 h、42 h、47 h，在最適溫度和pH條件下進(jìn)行發(fā)酵，測其A540 nm并計(jì)算酶活及其菌體A600 nm值。

1.4.4 不同碳源對(duì)SD-1產(chǎn)酶的影響

分別設(shè)置CMC-Na、淀粉、濾紙為唯一碳源在最適溫度、pH及發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定不同碳源培養(yǎng)下菌種產(chǎn)酶活力。

1.4.5 不同氮源對(duì)SD-1產(chǎn)酶的影響

分別設(shè)置牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物為唯一氮源，在最適溫度、pH、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，碳源，測定不同氮源培養(yǎng)下菌體產(chǎn)酶活力。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株的分離、篩選與形態(tài)學(xué)鑒定

通過剛果紅染色使產(chǎn)纖維素酶的菌落周圍產(chǎn)生水解圈的方法，從羊瘤胃液中分離得到若干菌株，經(jīng)過連續(xù)純化培養(yǎng)對(duì)D/d值的比較及液體培養(yǎng)基復(fù)篩，得到產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)的菌株SD-1。SD-1在羧甲基纖維素鈉瓊脂平板上水解圈見圖1。

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)SD-1菌落表面粗糙不透明，褶皺隆起，邊緣不齊。菌落整體呈白色，可見芽孢。對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽性且呈桿狀。

2.2 16SrDNA 法鑒定SD-1菌種

SD-1菌種16SrDNA序列擴(kuò)增結(jié)果見圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1500bp左右，與預(yù)期片段大小相符，條帶清晰且無雜帶，特異性良好，能夠用于測序分析。

2.3 pH對(duì)SD-1生長及產(chǎn)酶的影響

由圖4可知SD-1最適產(chǎn)酶pH及最適生長pH均為6.5。

2.4 溫度對(duì)SD-1生長及產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，在pH6.5條件下，SD-1最適生長溫度為34℃，最適發(fā)酵溫度為40℃。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SD-1生長及產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，在最適溫度、pH條件下，SD-1最適生長時(shí)間為22 h，最適發(fā)酵時(shí)間為12 h。

2.6 不同碳源對(duì)SD-1產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，SD-1發(fā)酵最適碳源為淀粉。

2.7 不同氮源對(duì)SD-1生長及產(chǎn)酶的影響

由圖8可知，SD-1最適發(fā)酵氮源為酵母浸出物，最適生長氮源為蛋白胨。

3 討論

瘤胃中50%的纖維素的分解被認(rèn)為是瘤胃細(xì)菌、真菌、原蟲共同作用的結(jié)果，而在這個(gè)過程中的近80%是由細(xì)菌完成的[19]。瘤胃微生物產(chǎn)生的酶分布于瘤胃液，附著在飼料顆粒上和微生物菌體上，內(nèi)源葡聚糖酶和外源葡聚糖酶存在于細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)中。而β-葡糖苷酶和β-巖藻糖苷酶的糖苷降解酶主要存在于瘤胃液中。這表明瘤胃內(nèi)纖維素分解菌與附著在植物細(xì)胞壁的菌對(duì)纖維質(zhì)的分解至關(guān)重要。根據(jù)瘤胃液所含微生物數(shù)量及分泌的酶，瘤胃液中所分布的酶在瘤胃飼料降解中具有重要作用[20]。Martin認(rèn)為在瘤胃各部分15N 標(biāo)記微生物生物量中，固體附著微生物及其酶活約占瘤胃總微生物量及總酶的74%[21]。本實(shí)驗(yàn)中，作者從藏羊新鮮瘤胃液中篩選出一株纖維素分解能力較強(qiáng)的菌種SD-1，形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及16SrDNA序列比對(duì)相結(jié)合的方法鑒定該菌種為一株芽孢桿菌。SD-1產(chǎn)酶在pH 5.0～6.5、37～43℃內(nèi)水平較高，其中在pH6.5、40℃、發(fā)酵12 h條件下，菌種產(chǎn)酶活力最高，為12.8U/ml。碳源、氮源也是影響菌體生長及產(chǎn)酶代謝的直接因素。實(shí)驗(yàn)中，SD-1在3種碳源（CMC-Na、淀粉、濾紙）培養(yǎng)下，其產(chǎn)酶活力均在10U/ml以上，說明該菌種對(duì)不同的碳源均有較強(qiáng)的分解能力。而在不同氮源培養(yǎng)條件下，SD-1菌種的產(chǎn)酶能力較低。在以酵母浸出物為唯一氮源的培養(yǎng)基中，其最高產(chǎn)酶活力為7.3U/ml。這可能是由于單一氮源不能滿足菌種產(chǎn)酶代謝的需要。

目前已有將纖維素分解菌作為生物制劑及利用纖維素分解菌生產(chǎn)乙醇等能源物質(zhì)的例證。張海峰[22]將構(gòu)建的黑曲霉基因工程菌和釀酒酵母基因工程菌固態(tài)發(fā)酵水稻秸稈，通過原位產(chǎn)酶及同步糖化發(fā)酵工藝，乙醇產(chǎn)量提高16.8%。夏素銀等[23]通過對(duì)苜蓿草粉飼糧添加纖維素酶對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及養(yǎng)分利用率的影響的研究發(fā)現(xiàn)高水平的苜蓿草粉組添加纖維素酶后，使蛋雞粗蛋白質(zhì)、鈣和粗纖維的消化率有改進(jìn)。反芻動(dòng)物的瘤胃作為天然的發(fā)酵罐具有高效分解利用纖維素的功能。通過利用纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)飼料及產(chǎn)生乙醇等能源物質(zhì)是高效利用纖維素資源的有效途徑。利用纖維素分解菌處理秸稈，可使其含有多種酶解糖、易于消化。從飼喂安全角度考慮，從瘤胃中分離得到的纖維素分解菌可制備成飼料添加劑，理論上講，這種飼料添加劑易于動(dòng)物對(duì)纖維素的消化利用，提高安全性和適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，作者從藏羊瘤胃液中分離出一株纖維素分解能力較強(qiáng)的菌種SD-1，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及16SrDNA 序列比對(duì)法鑒定為一株芽孢桿菌，其最適產(chǎn)酶pH為6.5、最適溫度為40℃、最佳發(fā)酵時(shí)間為12 h、最佳碳源和氮源分別為淀粉和酵母浸出物。研究結(jié)果可以為制備生物制劑或飼料添加劑及乙醇等能源物質(zhì)，以解決當(dāng)前秸稈等纖維素資源過度浪費(fèi)提供一定的理論參考。

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