邵勝勇

摘要：口蹄疫是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的A類烈性動物傳染病，我國列為一類動物傳染病?？谔阋吖灿?種血清型，亞洲I型是其中一種。目前，國內(nèi)還沒有對豬亞洲I型口蹄疫進(jìn)行強(qiáng)制免疫，我們通過2015-2017年對13958頭豬進(jìn)行亞洲I型口蹄疫免疫抗體的檢測，旨在對本地區(qū)豬群通過免疫口蹄疫O型-亞I型疫苗產(chǎn)生的抗體進(jìn)行監(jiān)測，掌握群體免疫抗體水平，評價(jià)免疫疫苗的有效性，并對免疫效果進(jìn)行總結(jié)，對生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行分析，提出解決的對策。方法為：豬群在免疫口蹄疫O型-亞洲I型二價(jià)滅活疫苗28 d至4個(gè)月之間，免疫次數(shù)從一免至五免，采集豬血清，以亞洲I型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，定量檢測樣品抗體水品。通過分析檢測數(shù)據(jù)，得出如下結(jié)論：豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體陽性率和抗體水平總體不高，但具備較好的保護(hù)力；商品豬免疫抗體陽性率和抗體水平均高于種豬；免疫抗體陽性率隨免疫次數(shù)增加呈逐漸上升趨勢，但四免后陽性率下降，到五免時(shí)則再次上升。通過檢測免疫抗體，分析其變化特征及規(guī)律，為豬亞洲I型口蹄疫的防控、研究及免疫提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：口蹄疫；亞洲I型；免疫抗體；檢測

中圖分類號：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.002

1 方法

1.1 疫苗

疫苗均為口蹄疫O型-亞洲I型二價(jià)滅活疫苗，中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生藥廠生產(chǎn)。

1.2 疫苗免疫及樣品采集

由于實(shí)際生產(chǎn)中不對豬進(jìn)行亞洲I型口蹄疫單獨(dú)免疫，因此免疫程序均按照口蹄疫O型-亞洲I型二價(jià)滅活疫苗的免疫程序進(jìn)行免疫，即仔豬30日齡時(shí)首免，1個(gè)月后二免，之后每4個(gè)月免疫1次。 所檢測血清樣品均為免疫后28天至4個(gè)月以內(nèi)的樣品，免疫次數(shù)從一免至五免。無菌采集血液，經(jīng)離心，分離出血清進(jìn)行檢測。2015-2017年檢測樣品數(shù)分別為4689份、3314份、5955份，其中一免至五免樣品數(shù)分別為3455份、4905份、2234份、1784份、1580份，種豬檢測數(shù)6799份、商品豬檢測數(shù)7159份。

1.3 抗體檢測試劑盒

亞洲I型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，購自中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.4 抗體檢測方法

亞洲I型口蹄疫抗體檢測液相阻斷ELISA方法，操作步驟如下：

1.4.1 稀釋血清

在U型反應(yīng)板上，以50μL/孔的量用1×PBST將待檢血清從1：4開始做2 倍連續(xù)稀釋至1：512（即每列第一孔加入75μL1×PBST，再加入25μL被檢血清，其余7孔各加入50μL1×PBST），陽性對照血清從1：2稀釋至1：256，陰性對照血清從1：2稀釋至1：4。設(shè)病毒抗原對照孔4孔。

1.4.2 加病毒抗原

將病毒抗原用1×PBST稀釋至工作濃度，向被檢血清、陰陽性對照血清的每一稀釋孔內(nèi)，各加入50μl，4孔病毒抗原對照孔各加入100μl。封板，振蕩，4℃靜置過夜或者37℃溫育90 min。

1.4.3 將U型反應(yīng)板上的抗原抗體混合液按次序轉(zhuǎn)移到已包被口蹄疫亞洲I型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，37℃溫育60 min。

1.4.4 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入口蹄疫亞洲I型豚鼠抗體工作液，封板，37℃溫育30 min。

1.4.5 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封板，37℃溫育30 min。

1.4.6 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入底物溶液（務(wù)必加雙氧水，每1 ml底物溶液加入10μL3%雙氧水），封板，37℃溫育15 min，每孔再加50μL終止液終止反應(yīng)，立即在492 nm波長下讀取光吸收值（D492 nm值）。

1.5 結(jié)果判定

1.5.1 試驗(yàn)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)

每塊板設(shè)4孔抗原對照，病毒抗原對照D492 nm值應(yīng)在1.5±0.5范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價(jià)應(yīng)在1：1024±1滴度以內(nèi)，陰性對照血清抗體效價(jià)應(yīng)<1：8。

1.5.2 血清抗體效價(jià)判定

抗原對照4孔，棄去最高和最低D492 nm值，計(jì)算其余2孔的平均D492 nm值，再除以2，即50%對照值，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對照D492 nm值。被檢血清D492 nm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的D492 nm值孔為陽性孔。若臨界值與稀釋倍數(shù)最高陽性孔的D492 nm值相同，則以被檢血清陽性孔的最高稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價(jià)；若臨界值處于兩個(gè)稀釋孔D492 nm值之間，抗體效價(jià)取相鄰陽性孔和陰性孔稀釋倍數(shù)的反對數(shù)中間值?？贵w效價(jià)計(jì)算對照表見試劑盒使用說明書。

1.5.3 結(jié)果判定

參考該試劑盒規(guī)定的牛羊亞洲I型口蹄疫抗體效價(jià)同保護(hù)力的關(guān)系，即“抗體效價(jià)≥1：128，保護(hù)率99%”的標(biāo)準(zhǔn)，作為豬的免疫保護(hù)臨界線，即：抗體效價(jià)≥1：128判定為亞洲I型口蹄疫抗體陽性，抗體效價(jià)<1：64，判定為陰性，介于1：64～1：128時(shí)，判定為可疑。群體免疫抗體陽性率≥70%即表明該群體對亞洲I型口蹄疫具備免疫保護(hù)力。

2 結(jié)果

通過2015-2017年連續(xù)3年中檢測到的豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體，3年檢測樣品13958份，整體平均免疫抗體陽性率為37.84%。按照年度逐月對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，免疫抗體陽性率如表1所示；2015-2017年平均抗體效價(jià)如表2所示。

按照養(yǎng)殖類型的不同，將檢測樣品按照種豬、商品豬進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，按年度計(jì)算免疫抗體陽性率及抗體效價(jià)，結(jié)果如下表3。

檢測樣品從免疫1次至免疫5次，統(tǒng)計(jì)各年份中所檢測樣品不同免疫次數(shù)下免疫抗體陽性率及抗體效價(jià)，得到表4所示結(jié)果。

3 分析與結(jié)論

統(tǒng)計(jì)3年的免疫抗體檢測結(jié)果（見表4），豬亞洲I型口蹄疫免疫抗體陽性率較低，整體平均為37.84%，平均抗體效價(jià)也較低，主要原因?yàn)椋糜诿庖叩目谔阋逴型-亞洲I型二價(jià)滅活疫苗為牛源疫苗，用于豬的免疫，其免疫原性較低，不能產(chǎn)生很好的免疫應(yīng)答。從實(shí)際生產(chǎn)情況看，豬患亞洲I型口蹄疫的癥狀及程度并不嚴(yán)重[1]。通過大量的檢測數(shù)據(jù)，雖然總體免疫抗體陽性率與免疫抗體效價(jià)均較低，但被檢測到的個(gè)體及其所在的群體并未發(fā)生亞洲I型口蹄疫，因此可以認(rèn)為，在堅(jiān)持對豬群實(shí)施免疫的情況下，豬只對亞洲I型口蹄疫是具備抵抗力的。按照種豬（后備種豬）、商品豬分析免疫效果，商品豬不論從免疫抗體陽性率還是抗體效價(jià)來看，都要高于種豬。后備種豬一般在8月齡進(jìn)行首次配種，配種前1個(gè)月免疫1次（即三免），配種后則按照4個(gè)月免疫一次的程序進(jìn)行免疫管理。而商品豬生長周期較短，一般在5個(gè)月左右，其免疫程序基本是按照30日齡、65日齡、95日齡、125日齡進(jìn)行免疫，免疫間隔較短，免疫抗體保持在較高水平。種豬（后備種豬）、商品豬之間免疫程序的差異導(dǎo)致了兩者間免疫抗體的差異。

韋顯凱[2]等通過對豬口蹄疫免疫抗體的研究，得到結(jié)果是抗體陽性率一免、二免、三免依次升高，但沒有對四免及以后免疫情況進(jìn)行研究，本文則將檢測的對象擴(kuò)大到五免以后。從免疫次數(shù)看，一免至三免，免疫抗體陽性率均呈逐漸上升的趨勢，但四免后免疫抗體陽性率卻均呈下降走勢，到五免時(shí)則再次上升。這個(gè)現(xiàn)象目前尚無同樣報(bào)道或研究。通過對相關(guān)豬場進(jìn)行調(diào)查，分析造成此現(xiàn)象的原因主要是：后備母豬首次配種時(shí)間一般在220～260日齡，而按照疫苗免疫程序，三免的時(shí)間在7～8月齡，配種時(shí)間恰好與三免時(shí)間重合，而豬場為了疫病防控的需要，會在配種前1個(gè)月對后備母豬實(shí)施免疫，免疫后再行配種。而四免時(shí)間在11～12月齡之間，此時(shí)的母豬妊娠期已達(dá)3～4個(gè)月，按照免疫程序應(yīng)該實(shí)施免疫，但母豬即將臨產(chǎn)，為減少對母豬及胎兒的影響，免疫時(shí)間會被推后至分免疫后進(jìn)行，這對免疫抗體的產(chǎn)生有一定影響。另一方面，生產(chǎn)后的母豬體內(nèi)激素水平的變化也可能對免疫抗體的產(chǎn)生具有一定影響。 本項(xiàng)檢測中所采樣品為口蹄疫O型-亞洲I型二價(jià)滅活疫苗免疫程序免疫所得樣品，各場在實(shí)際生產(chǎn)中，免疫程序往往與疫苗推薦程序有差異，后備母豬基本能按照4個(gè)月免疫1次的推薦程序進(jìn)行免疫，但商品豬則頻繁免疫，基本是按照1月1次開展免疫，整個(gè)生長周期中免疫4次。本項(xiàng)檢測中數(shù)據(jù)也表明，商品豬頻繁免疫，其免疫抗體水平雖比后備母豬略高，但差異并不顯著，因此其免疫程序并不合理。靳興軍等[3]曾對豬的口蹄疫亞洲I型疫苗探索免疫程序，研究確定了豬亞洲I型口蹄疫免疫程序：45日齡首免，間隔1.5～2個(gè)月二免，再間隔4～4.5個(gè)月三免， 以后每4～5個(gè)月免疫1次，以該程序進(jìn)行免疫，免疫效果確實(shí)，該程序可以推薦作為商品豬免疫程序。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃武光.豬的亞洲Ⅰ型口蹄疫的發(fā)病特點(diǎn)及控制措施研究[J].中國動物保健，2008（12）：92-94.

[2] 韋顯凱.規(guī)模豬場不同免疫次數(shù)對口蹄疫抗體產(chǎn)生效果的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（3）：494-497.

[3] 靳興軍.豬亞洲I型口蹄疫免疫程序試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2006（9）：15-16.