吳有芳 曹米蘭 檀軍 郭建軍

摘要：小皺蝽為九香蟲的偽品，市場(chǎng)上常被作為九香蟲銷售。本實(shí)驗(yàn)旨在用MTT法檢測(cè)九香蟲和小皺蝽血淋巴對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制作用，比較二者對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外增殖抑制作用。用九香蟲和小皺蝽血淋巴分別作用于體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞，測(cè)定其抑制率。結(jié)果表明，九香蟲和小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞皆有抑制作用，且抑制率隨時(shí)間和濃度的增加而增加;相同濃度不同時(shí)間（24 h、48 h、72 h）和相同時(shí)間不同濃度（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L）小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率皆高于九香蟲。

關(guān)鍵詞：九香蟲;小皺蝽;人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞;抑制率;MTT法

Comparison of the Inhibitory Effects between Aspongopus chinensis and Cyclopelta parva on Proliferation of Human Gastric Cancer Cell SGC-7901

WU You?fang，CAO Mi?lan，TAN Jun， GUO Jian?jun*

（Institute of Entomology， Guizhou ?Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：Cyclopelta parva is a counterfeit species of Aspongopus chinensis， which usually be sold as A.?chinensis in the market.?This paper ?aimed to clarify the inhibitory effect of C.?parva on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells in vitro by comparing their inhibitory effects on human gastric cancer cell SGC-7901 with A.?chinensis by MTT method.?The results demonstrated that the inhibition rates of SGC-7901 treated by A.?chinensis and C.?parva heamolymph both increased with times and concentrations.?C.?parva haemolymph had higher inhibitory effects on SGC-7901 than A.?chinensis regardless of the same concentration with different times or different concentrations with the same time.

Key words：Aspongopus chinensis; Cyclopelta parva; SGC?7901; inhibition rate; MTT method

九香蟲Aspongopus chinensis Dallas，1851隸屬于昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae[1]，是傳統(tǒng)的藥用資源昆蟲，主治膈脘滯氣、脾腎虧損、壯元陽、胃寒脹、腰膝酸痛[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明九香蟲對(duì)胃癌、乳腺癌均有一定的療效，以九香蟲為原料的一些中成藥，如復(fù)方香龍散、九香抗癌定痛散等對(duì)抑制癌細(xì)胞都有一定的作用。九香蟲血淋巴提取物對(duì)胃癌和乳腺癌體外細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用[4-6]。小皺蝽Cyclopelta parva Distant隸屬于昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae[7]。小皺蝽和九香蟲外形較為相似，在市場(chǎng)上常被當(dāng)成九香蟲廣泛出售，又被稱為“小九香蟲”。但是其是否具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的功效尚不清楚。目前國內(nèi)外還未出現(xiàn)過與小皺蝽抑制癌細(xì)胞相關(guān)的研究報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)研究小皺蝽和九香蟲對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用比較，明確小皺蝽是否具有抑制胃癌細(xì)胞的作用及與九香蟲的差異。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試蟲源

九香蟲成蟲采集自貴州省習(xí)水縣習(xí)酒鎮(zhèn)河灘上，習(xí)酒鎮(zhèn)地處北緯28°09′，東經(jīng)106°10′。

小皺蝽成蟲采集自貴州省貴陽市花溪區(qū)田園北路刺槐，花溪區(qū)地處北緯26°11′～26°34′，東經(jīng)106°27′～106°52′。

上述采集獲得的活蟲置于-80℃冰箱（美國Thermo公司）冷凍備用。

1.1.2主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司），二辛可酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京康為世紀(jì)公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Amresco公司），胰蛋白酶（美國賽默飛世爾科技有限公司），噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1九香蟲和小皺蝽血淋巴制備

九香蟲和小皺蝽血淋巴制備參照楊佳琪等 [6] 的方法。

1.2.2九香蟲和小皺蝽蛋白濃度測(cè)定

利用BCA法測(cè)定九香蟲和小皺蝽的蛋白濃度。參照BCA蛋白定量試劑盒說明書制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將九香蟲和小皺蝽的血淋巴稀釋100倍加入酶標(biāo)孔板中，每孔25 μL，設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔，每孔加入200 μL已配制好的BCA工作液。放入37℃環(huán)境下，孵育30 min。冷卻至室溫，在562 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算九香蟲和小皺蝽總蛋白濃度。

1.2.3SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4MMT法檢測(cè)九香蟲和小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率

實(shí)驗(yàn)設(shè)有實(shí)驗(yàn)組，無藥對(duì)照組和空白對(duì)照組。

將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的SGC-7901細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)液稀釋，使細(xì)胞密度達(dá)到1×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，接種3塊96孔板。置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，吸盡原培養(yǎng)液，分別加入含100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L九香蟲和小皺蝽血淋巴的DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組加入不含血淋巴的DMEM培養(yǎng)液;每個(gè)處理5個(gè)復(fù)孔。置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h，48 h，72 h后各取出1塊96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩20 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后在570 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD）值。

計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（無藥對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;采用Excel軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1BCA法測(cè)定九香蟲和小皺蝽蛋白含量

應(yīng)用BCA法測(cè)得各濃度標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白吸光度值，計(jì)算平均值（表1）。

以吸光度為橫坐標(biāo)（X），濃度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析，得到蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)線（圖1）：Y=0.9609X-0.0607，R2=0.9887。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)得的九香蟲和小皺蝽血淋巴稀釋液的吸光度值計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，得到小皺蝽血淋巴液蛋白濃度比九香蟲血淋巴液的蛋白濃度低（見表2）。

2.2九香蟲和小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制率的比較

根據(jù)BCA蛋白測(cè)定法確定的九香蟲和小皺蝽血淋巴的蛋白含量，計(jì)算用于SGC-7901細(xì)胞的九香蟲和小皺蝽的血淋巴濃度分別為100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L。MTT法檢測(cè)結(jié)果（見表3），血淋巴處理24 h、48 h、72 h后，九香蟲和小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖都有明顯抑制作用。相同時(shí)間不同濃度下九香蟲和小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率與無藥對(duì)照組比較，有顯著差異（P<0.05）。相同時(shí)間不同濃度下九香蟲和小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制率比較，有顯著差異（P<0.05）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），相同時(shí)間不同濃度下，九香蟲和小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨濃度的增加而增加，且小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901的抑制作用比九香蟲血淋巴的明顯。相同濃度不同時(shí)間下，九香蟲和小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨時(shí)間的增加而增加。處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，在試驗(yàn)的任何濃度下，小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用比九香蟲血淋巴明顯，最高抑制率為400 mg/L時(shí)，抑制率達(dá)到64.13%。處理48 h后，小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用在實(shí)驗(yàn)的任何濃度下同樣比九香蟲高，抑制率最高是400 mg/L時(shí)，小皺蝽為91.44%，九香蟲為80.48%。血淋巴處理72 h后，小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用同樣比九香蟲好，在400 mg/L時(shí)，抑制率最高，達(dá)到了99.06%。處理72 h后，九香蟲和小皺蝽血淋巴對(duì)SGC-7901的抑制率都比較高，但相同濃度下，小皺蝽對(duì)SGC-7901的抑制率同樣高于九香蟲。

3結(jié)論與討論

九香蟲作為傳統(tǒng)藥用昆蟲，除了本草綱目中有所記載，在《動(dòng)物藥》也載錄了九香蟲可與多種中藥治療肝胃氣痛、十二指腸潰瘍、胃炎和血管瘤等多種疾病[8]，且九香蟲的蛋白提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用[9]。并在臨床上得到應(yīng)用，具有重要的藥用價(jià)值。在市場(chǎng)上小皺蝽常作為九香蟲售賣，但對(duì)于小皺蝽藥用價(jià)值研究報(bào)道的比較少。目前，國內(nèi)外還沒有對(duì)小皺蝽抗癌方面的研究進(jìn)行報(bào)道。所以研究探討小皺蝽是否具有抗癌活性以及其抗癌活性的高低對(duì)開發(fā)有藥用價(jià)值的昆蟲，發(fā)掘更多抗腫瘤藥用昆蟲有著重要的意義。

本研究顯示，九香蟲對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用隨時(shí)間和濃度的增加而增加，有較好抑制體外SGC-7901細(xì)胞增殖的作用，這與檀軍等 [5] 的研究結(jié)果一致。小皺蝽雖然作為九香蟲偽品，但其血淋巴對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞有明顯的抑制作用。在用九香蟲和小皺蝽血淋巴分別作用SGC-7901細(xì)胞24 h和48 h后，小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用明顯高于九香蟲;特別是處理24 h后，小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用顯著高于九香蟲;在處理72 h后，小皺蝽和九香蟲對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖都有較明顯的抑制作用，但小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率依然高于九香蟲。小皺蝽與九香蟲對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制差異可能是九香蟲和小皺蝽的作用物質(zhì)或作用機(jī)制不同導(dǎo)致小皺蝽在較短的時(shí)間就對(duì)SGC-7901細(xì)胞有比九香蟲高的抑制率;這還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究驗(yàn)證。從本研究可以確定的是小皺蝽對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用高于九香蟲。

小皺蝽前期研究也已證明其具有良好的抗菌活性[10-11];該結(jié)果與九香蟲前期研究相吻合[12]。因而初步推測(cè)小皺蝽和九香蟲相似，都可以作為藥用資源昆蟲，且具有類似的抗菌、消炎、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)機(jī)體免疫力功效。

盡管小皺蝽已經(jīng)明確其具有類似九香蟲的藥物功效，但是九香蟲的活性物質(zhì)已經(jīng)初步明確為功能多肽（實(shí)驗(yàn)室發(fā)表中），作用途徑為內(nèi)源線粒體凋亡途徑[13]。小皺蝽的抑制癌細(xì)胞活性物質(zhì)、作用途徑、作用機(jī)制等是否和九香蟲一致或類似，仍未可知，仍需進(jìn)一步明確。并且除了對(duì)小皺蝽抗菌活性和抑制癌細(xì)胞增殖的作用有過研究，其他領(lǐng)域還沒有過多的研究，因此還需要對(duì)小皺蝽進(jìn)行更多方面的研究來確定其是否真的如九香蟲一樣具有良好的藥用價(jià)值。因而小皺蝽作為九香蟲替代品的合理性也仍需進(jìn)一步研究和探討。

相信上述問題的明確可以為小皺蝽這一新提出的藥用資源昆蟲[7]的開發(fā)利用奠定堅(jiān)實(shí)的應(yīng)用基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]彩萬志，龐雄飛，花保禎，等. 普通昆蟲學(xué)（第二版）[M].北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011： 306-307.

[2]李時(shí)珍.本草綱目（第四版）[M].北京： 人民衛(wèi)生出版社，1979： 2258-2259.

[3]國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].北京： 中國醫(yī)藥科技出版社，2015： 11.

[4]蔣三俊.中國藥用昆蟲集成[M].北京： 中國林業(yè)出版社，1999： 131.

[5]檀軍，郭建軍，魏超，等. 九香蟲血淋巴對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞體外增殖的抑制作用[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2013，32（2）： 119-122.

[6]楊佳琪，郭建軍，檀軍，等. CCK-8法檢測(cè)九香蟲血淋巴對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017a，39（1）： 193-197.

[7]中國藥用動(dòng)物志協(xié)作組.中國藥用動(dòng)物志[M].天津： 天津科學(xué)科技出版社，1979： 86.

[8]張保國，張大祿.動(dòng)物藥[M].北京： 中國醫(yī)藥科技出版社，2003： 1-6.

[9]曹米蘭，檀軍，郭建軍，等.九香蟲淋巴三種生物分子對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖影響[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2018，37（2）：41-45.

[10]楊澤宏，楊星勇，袁小紅，等. 高效液相色譜法分離純化小皺蝽抗菌肽AMP-1[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23（2）： 104-107.

[11]楊澤宏，楊星勇，羅克明，等. 小皺蝽抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)及抗菌肽AMP-2的分離純化和特性[J].應(yīng)用與環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2006，12（2）： 210-214.

[12]吳瑪莉，金道超，九香蟲血淋巴及其純化蛋白抑菌活性的研究[J].昆蟲知識(shí)，2005，42（3）： 315-318.

[13]楊佳琪，郭建軍，龍金麟，等. 九香蟲血淋巴對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].生物資源，2017b，39（5）： 360-365.