張書芹

摘要：【目的】研究激素與棉花蕾鈴脫落的關(guān)系，為解析離層脫落相關(guān)基因的表達(dá)、調(diào)控及功能鑒定提供基礎(chǔ)資料。【方法】以50 mg/L赤霉素（GA3）和250 mg/L乙烯利（CEPA）分別處理的棉花蕾鈴離層cDNA為Tester，H2O處理的棉花蕾鈴離層cDNA為Driver，利用抑制消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建經(jīng)GA3和乙烯處理后的消減文庫，反向Northern blo-tting篩選出離層差異表達(dá)的EST序列，然后進(jìn)行基因功能注釋與功能分類，并分析蕾鈴離層差異表達(dá)基因的組織表達(dá)模式和GA3誘導(dǎo)表達(dá)規(guī)律?！窘Y(jié)果】以GA3處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，所構(gòu)建的cDNA文庫命名為GA文庫；以CEPA處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，所構(gòu)建的cDNA文庫命名為CE文庫。從構(gòu)建的兩個(gè)消減文庫（GA和CE）中共篩選出29個(gè)在離層差異表達(dá)的EST序列，通過基因功能注釋與功能分類，可將這些EST序列分為翻譯相關(guān)、代謝相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、蛋白合成、能量代謝、抗逆相關(guān)、基因組序列和未知功能等九大類，其中與翻譯相關(guān)的EST序列占24.14%，說明經(jīng)激素處理后棉花蕾鈴離層有大量的蛋白合成。從消減文庫中挑選10個(gè)差異表達(dá)基因（EST序列）進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以GA3處理棉花蕾鈴離層后部分相關(guān)基因的表達(dá)模式會(huì)發(fā)生變化?！窘Y(jié)論】棉花蕾鈴離層經(jīng)激素處理后能激活脫落相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響器官脫落，是其對(duì)逆境脅迫反應(yīng)的結(jié)果。

關(guān)鍵詞： 棉花蕾鈴；赤霉素；乙烯；離層；cDNA文庫；抑制消減雜交（SSH）

中圖分類號(hào)： S562 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）05-0832-07

Abstract：【Objective】The present study investigated the relationship between hormones and abscission of cotton boll to provide basic data on gene expression， regulation and function of abscission related genes. 【Method】The cDNA of boll abscission layers treated by 50 mg/L gibberellin solution（GA3） and 250 mg/L ethephon solution（CEPA） respectively was used as Tester， while cDNA prepared from abscission layers which were treated with H2O was used as Driver. Subtractive library treated with GA3 and CEPA was constructed by suppression subtractive hybridization（SSH） technology and the EST sequence differentially expressed in abscission layer was selected by reverse Northern blotting. Then gene function annotation and function classification were carried out. The tissue expression patterns and GA3 induced expression patterns of the differentially expressed genes in boll abscission layer were analyzed. 【Result】The Tester was the cDNA prepared from abscission layers treated with GA3， the Driver was the cDNA prepared from abscission layers treated with H2O. The constructed library was named GA library. The Tester was the cDNA prepared from abscission layers treated with CEPA， the Driver was the cDNA prepared from abscission layers treated with H2O. The constructed library was named GA library.Twenty-nine EST sequences differentially expressed in abscission layer were found in the two constructed subtractive libraries（GA and CE） by sequence analyzed. Through gene function annotation and function classification， the EST sequences were involved in translation， metabolism， signal transduction， transcription， protein synthesis， energy metabolism， stress defense， genome DNA and unknown function. The genes that related to translation accounted for 24.14%， which showed that there was a great deal of protein synthesis after hormonal treatment in abscission layer cells. Ten diffe-rentially expressed genes（EST sequence） from these libraries were analyzed by RT-PCR. It was found that the expression patterns of some genes changed after the cotton boll abscission layer was treated with GA3. 【Conclusion】After hormone treatment， the abscission layer of cotton boll can activate the expression of abscission-related genes， thus affecting the abscission of organs， which is the result of their response to adversity stress.

Key words： cotton boll； gibberellin； ethylene； abscission layer； cDNA library； suppression subtractive hybridization（SSH）

0 引言

【研究意義】棉花（Gossypium）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，棉纖維是紡織工業(yè)自然纖維的主要來源。在實(shí)際生產(chǎn)中，棉花蕾鈴脫落是非常普遍的現(xiàn)象，其脫落高峰在棉株盛花期后5～10 d，脫落率在60%～70%，高的可達(dá)80%。不同棉種其蕾鈴脫落率也不同，一般表現(xiàn)為陸地棉脫落率高于海島棉（張炎等，2012；鄧忠等，2017）。影響棉花蕾鈴脫落的因素較多，除了生理脫落因素外，生育期的灌溉與施肥策略也發(fā)揮著重要作用，因此，解析棉花蕾鈴脫落機(jī)制對(duì)提高棉花單位面積產(chǎn)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】乙烯在植物器官脫落過程中起促進(jìn)作用（Tranbarger et al.，2017），如蘋果幼果脫落與乙烯含量上升密切相關(guān)（Yuan，2007；Zhu et al.，2011），而外源施用乙烯或乙烯利可促進(jìn)植物器官脫落，采用乙烯處理玫瑰后其花瓣脫落率顯著升高（Singh et al.，2011），處理橄欖后其成熟果實(shí)脫落也顯著增加（Gil-Amado and Gomez-Jimenez，2012），采用2 mL/L乙烯利噴施龍眼果穗10 d內(nèi)可造成62.46%的果實(shí)脫落（楊子琴等，2015），噴施1.80 g/L乙烯利2和4周后澳洲堅(jiān)果的落果率分別達(dá)98.75%和100.00%（柳覲等，2017）。盡管現(xiàn)有的研究已表明乙烯濃度上升與植物器官脫落呈正相關(guān)，但乙烯濃度上升只是器官脫落的中間環(huán)節(jié)；因?yàn)橹挥写偈挂蚁┖铣刹艜?huì)引起離層細(xì)胞壁水解酶活性增強(qiáng)及相關(guān)基因表達(dá)量上升，離層細(xì)胞壁破碎，最終導(dǎo)致器官脫落（Roberts et al.，2002）。赤霉素（GA3）對(duì)植物器官脫落也有一定的調(diào)控作用。Bains等（1999）在芒果中研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源GA3含量不論是在脫落的果實(shí)還是果蒂中，均低于未脫落的果實(shí)和果蒂；Gómez-Cadenas等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，脫落柑橘果實(shí)中的活性GA3含量較未脫落時(shí)約降低400%；孫穎等（2014）研究表明，噴施不同濃度的外源GA3均能抑制油桐花芽分化，其中以噴施200 mg/L的抑制效果最明顯；楊波等（2015）研究表明，新梢和幼果中對(duì)應(yīng)內(nèi)源激素間的濃度平衡關(guān)系是調(diào)控扁桃幼果生理脫落的重要因素，表現(xiàn)為幼果中高GA3和生長(zhǎng)素（IAA）濃度、低脫落酸（ABA）濃度有利于扁桃坐果；李長(zhǎng)江等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，庫爾勒香梨萼片脫落與內(nèi)源激素的分布密切相關(guān)，其中幼果萼端GA3的積累可能有利于果實(shí)萼片脫落?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已有學(xué)者從離層相關(guān)基因方面研究揭示植物器官脫落的原理。Cho等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，IDA、HSL2、HAE和MAPK激酶調(diào)控花器官離層的形成；Leslie等（2010）、Lewis等（2010）、Niederhuth等（2013）研究認(rèn)為，類受體細(xì)胞質(zhì)激酶負(fù)調(diào)控IDA/HAE信號(hào)蛋白，進(jìn)而影響離層發(fā)育；常璟等（2015）從陸地棉中克隆獲得調(diào)控離層分化及形成相關(guān)的BOP基因；但至今鮮見針對(duì)棉花蕾鈴脫落的分子機(jī)制研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以50 mg/L GA3和250 mg/L乙烯利分別處理的離層cDNA為Tester，H2O處理的棉花蕾鈴離層cDNA為Driver，利用抑制消減雜交（Suppression subtraction hybridization，SSH）技術(shù)構(gòu)建經(jīng)GA3和乙烯處理后的cDNA文庫，對(duì)獲得的離層差異表達(dá)EST序列進(jìn)行基因功能注釋與功能分類，并分析離層差異表達(dá)基因的組織表達(dá)模式和GA3誘導(dǎo)表達(dá)規(guī)律，為解析離層脫落相關(guān)基因的表達(dá)、調(diào)控及功能鑒定提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花試驗(yàn)田種植的陸地棉（G. hirsutum）遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，于棉蕾開花當(dāng)天分別用50 mg/L GA3、250 mg/L乙烯利（CEPA）和H2O（CK）點(diǎn)涂其離層，并于點(diǎn)涂后0、1、2、4、8、12、24、48和72 h及5 d以刀片切取約0.5 cm的離層組織，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 核酸提取及mRNA分離

采用改良的異硫氰酸胍法提取總RNA（Li et al.，2002），用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定其濃度和純度。取GA3、CEPA和H2O處理各時(shí)期的RNA分別等量混合，按照Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）說明，從總RNA中分離純化出mRNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1. 3 抑制消減文庫構(gòu)建

以50 mg/L GA3處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構(gòu)建cDNA文庫GA；以250 mg/L CEPA處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構(gòu)建cDNA文庫CE。采用Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtractive Kit試劑盒（美國(guó)BD公司）完成抑制消減雜交，對(duì)消減后的第二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，即獲得消減文庫。

1. 4 消減文庫鑒定及序列分析

挑取陽性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，取菌液進(jìn)行PCR鑒定。然后挑選插入片段大于250 bp、帶型單一的PCR產(chǎn)物點(diǎn)制Microarray。將GA3、CEPA和H2O處理各時(shí)期的RNA等量混合，采用MLV Reverse Transcriptase（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以1.00 μL的10 m Ci/mL[α-32P]-dCTP進(jìn)行探針標(biāo)記，經(jīng)雜交、洗膜和磷屏成像，通過Array Gauge Version 1.0對(duì)信號(hào)值進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。選取雜交信號(hào)值變化明顯的克隆進(jìn)行接菌培養(yǎng)及測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果去除載體和接頭序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLASTx分析對(duì)所獲得的EST序列進(jìn)行功能分類。

1. 5 RT-PCR分析差異基因表達(dá)情況

對(duì)兩個(gè)消減文庫中差異表達(dá)的EST序列設(shè)計(jì)特異引物，以陸地棉TM-1的根、莖和葉及經(jīng)GA3處理0.5、2.0、4.0、8.0和12.0 h的蕾鈴離層，共8個(gè)材料的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.00 ?L：10×Buffer 2.00 ?L、MgCl2（25 mmol/L）1.50 ?L、正、反向引物（10 μmol/L）各0.25 ?L、dNTP（10 mmol/L）0.40 ?L、稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.00 ?L、Taq DNA酶1 U、ddH2O補(bǔ)足至20.00 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取8.00 ?L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA和mRNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

GA3、CEPA和H2O處理各時(shí)期總RNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28S、18S和5S條帶清晰，無明顯拖尾，且18S和28S兩條條帶明亮（圖1），說明總RNA完整性良好。所有樣品的OD260/OD280均在1.8以上，濃度超過1 ?g/?L，說明RNA純度高，符合建庫要求。采用Oligotex法分離mRNA，然后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示3個(gè)材料的mRNA均無明顯28S和18S條帶，呈彌散狀（圖2），說明rRNA已剔除，mRNA完整性良好。

2. 2 抑制消減文庫構(gòu)建情況

以GA3處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構(gòu)建的文庫命名為GA文庫；以CEPA處理的離層cDNA為Tester、H2O處理的離層cDNA為Driver，構(gòu)建的cDNA文庫命名為CE文庫。經(jīng)第二輪PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳檢測(cè)顯示兩個(gè)文庫消減后的產(chǎn)物均呈彌散狀分布，無明顯主帶，分子量大小為250～1000 bp，平均在500 bp左右（圖3），符合對(duì)文庫裝載片段大小的要求。

2. 3 消減文庫的PCR鑒定及反向Northern blotting篩選結(jié)果

第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的白色菌落使用SP6和T7通用引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，插入片段分子量范圍在200～1000 bp，平均在500 bp左右。說明插入片段呈隨機(jī)分布，擴(kuò)增效率好。部分克隆的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖4，反向Northern blotting篩選結(jié)果見圖5。

2. 4 EST同源性分析結(jié)果

從GA文庫中選取雜交信號(hào)比值大于3或小于1/3的克隆97個(gè)，從CE文庫中選取雜交信號(hào)比值大于3或小于1/3的克隆11個(gè)進(jìn)行測(cè)序分析，去除重復(fù)序列和低質(zhì)量序列后，從GA文庫中共獲得68條高質(zhì)量的EST序列，從CE文庫中共獲得11條高質(zhì)量的EST序列。對(duì)獲得的EST序列先以TBLASTx進(jìn)行注釋比較，然后用ClustalX對(duì)同一基因的不同片段合并后，文庫GA有25條EST序列，文庫CE有4條EST序列，共產(chǎn)生29條EST序列。這29條EST序列中來自擬南芥的有11條，來自棉花的有6條，其余的來自其他物種。

為進(jìn)一步了解這些EST序列的功能，參照Bevan等（1998）、Mahalingam等（2003）的方法對(duì)其功能進(jìn)行分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選出的29條EST序列可分為翻譯相關(guān)、代謝相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、蛋白合成、能量代謝、抗逆相關(guān)、基因組序列和未知功能九大類（表1）。其中，與翻譯相關(guān)的EST序列占24.14%，與信號(hào)傳導(dǎo)、代謝相關(guān)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的EST序列各占13.79%，與能量代謝相關(guān)的EST序列占10.35%，與蛋白合成、抗逆相關(guān)和基因組序列相關(guān)的EST序列各占6.90%，未知功能的EST序列占3.45%。

2. 5 RT-PCR分析結(jié)果

從消減文庫中挑選10個(gè)差異表達(dá)基因（EST序列）進(jìn)行RT-PCR，分析其在陸地棉TM-1根、莖、葉及經(jīng)GA3處理蕾鈴離層中的誘導(dǎo)表達(dá)模式。結(jié)果（圖6）表明，查耳酮合酶（Chalcone synthase）基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，GA3誘導(dǎo)2.0 h后其在蕾鈴離層中的表達(dá)量最高。脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase）基因在各組織均有表達(dá)，但在蕾鈴離層中的表達(dá)量明顯高于其他組織。肽基脯氨?；樂串悩?gòu)酶（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）基因在根和莖中表達(dá)量很高，在葉和GA3誘導(dǎo)蕾鈴離層中表達(dá)較弱，經(jīng)GA3誘導(dǎo)2.0 h后幾乎不表達(dá)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因在各組織均有表達(dá)，GA3誘導(dǎo)2.0和8.0 h后的表達(dá)量最高。纖維蛋白（Fiber protein）基因在根和葉中表達(dá)很弱，在莖和蕾鈴離層中的表達(dá)強(qiáng)度一般。翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein）基因在根和莖中表達(dá)量非常高，在葉中幾乎不表達(dá)，GA3誘導(dǎo)0.5 h后在蕾鈴離層中微弱表達(dá)，誘導(dǎo)12.0 h后表達(dá)量達(dá)最高值。GA-2-A23在根、莖、葉和蕾鈴離層中表達(dá)量均較高；CE-1-K17需在GA3誘導(dǎo)4.0～12.0 h后才表達(dá)，以誘導(dǎo)4.0 h的表達(dá)量最高，然后逐漸下降；GA-1-L22在根、莖和葉中均不表達(dá)，經(jīng)GA3誘導(dǎo)后呈微弱的表達(dá)；GA-2-N8在莖和葉中均不表達(dá)，在根和GA3誘導(dǎo)蕾鈴離層中的表達(dá)量也較低。可見，以GA3處理蕾鈴離層后部分基因的表達(dá)模式會(huì)發(fā)生變化。

3 討論

SSH技術(shù)是以兩輪消減雜交和兩次PCR擴(kuò)增為核心，致使差異表達(dá)的基因片段大量富集，具有假陽性低、靈敏度高、篩選效率高、操作簡(jiǎn)單、周期短等優(yōu)點(diǎn)（周變?nèi)A等，2011；蔣小珍等，2014；樊瑩和董霞，2015）。目前，利用SSH技術(shù)已分離獲得棉花體細(xì)胞胚發(fā)生過程中的相關(guān)基因（Zeng et al.，2006）、原生質(zhì)體培養(yǎng)棉花細(xì)胞壁再生相關(guān)基因（Yang et al.，2008）及棉花受黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)的差異基因（Xu et al.，2011）等。本研究采用SSH技術(shù)構(gòu)建棉花蕾鈴離層經(jīng)GA3、乙烯處理后的cDNA文庫，并從構(gòu)建的兩個(gè)消減文庫（GA和CE）中篩選出29個(gè)在離層差異表達(dá)的EST序列，通過基因功能注釋與功能分類，可將這些EST序列分為翻譯相關(guān)、代謝相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、蛋白合成、能量代謝、抗逆相關(guān)、基因組序列和未知功能等九大類。其中，與翻譯相關(guān)的EST序列占24.14%，與信號(hào)傳導(dǎo)、代謝相關(guān)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的EST序列各占13.79%，與能量代謝相關(guān)的EST序列占10.35%，與蛋白合成、抗逆相關(guān)和基因組序列相關(guān)的EST序列各占6.90%，未知功能的EST序列占3.45%。該結(jié)論為進(jìn)一步研究棉花蕾鈴脫落機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

本研究采用GA3和乙烯利處理棉花蕾鈴離層，構(gòu)建了兩個(gè)消減文庫（GA和CE），測(cè)序分析和序列注釋分析結(jié)果表明大部分基因是核糖體基因，可能是蛋白質(zhì)大量翻譯造成核糖體基因富集，也說明經(jīng)激素處理后激活了大量基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其中，翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白在物種間高度保守，并具有多種生物學(xué)功能。Lopez和Franco（2006）首次從草莓果實(shí)中克隆獲得翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白基因，且發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)的成熟其表達(dá)量逐漸增加。陳科等（2012）研究表明，翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化及細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，能夠激活干細(xì)胞標(biāo)記基因Oct4和Nanog的轉(zhuǎn)錄；調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、腫瘤逆轉(zhuǎn)、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)及保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激的損傷。本研究結(jié)果表明，翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白基因在陸地棉的根、莖和經(jīng)GA3誘導(dǎo)蕾鈴離層中呈上調(diào)表達(dá)，且在GA3誘導(dǎo)12.0 h后表達(dá)量達(dá)峰值。肽基脯氨?；樂串悩?gòu)酶基因與植物響應(yīng)逆境有關(guān)（Romano et al.，2004）。本研究從GA3處理的GA文庫中也克隆出該基因，但在葉和GA3誘導(dǎo)蕾鈴離層中表達(dá)較弱，尤其是經(jīng)GA3誘導(dǎo)2.0 h后幾乎不表達(dá)，說明其表達(dá)與GA3誘導(dǎo)處理有關(guān)。查耳酮合酶是類黃酮類物質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，是廣泛存在于高等植物中的次生代謝物，在植物花色素形成及抗蟲、抗病方面發(fā)揮重要作用（楊繼和顧紅雅，2006）。在本研究中，查耳酮合酶基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，經(jīng)GA3誘導(dǎo)2.0 h后其在蕾鈴離層中的表達(dá)量最高?？梢姡藁ɡ兮忞x層經(jīng)激素處理后能激活脫落相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響器官脫落，是其對(duì)逆境脅迫反應(yīng)的結(jié)果。

4 結(jié)論

棉花蕾鈴離層經(jīng)激素處理后能激活脫落相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響器官脫落，是其對(duì)逆境脅迫反應(yīng)的結(jié)果。該結(jié)論為進(jìn)一步研究棉花蕾鈴脫落機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）