趙鳳 杜娟 李尚偉 張澤杰

摘?要：稻縱卷葉螟是危害水稻的主要害蟲之一，幾丁質(zhì)合成酶是昆蟲幾丁質(zhì)合成通路上最后一個酶，對昆蟲的生長發(fā)育至關(guān)重要。本研究對轉(zhuǎn)稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因雙鏈RNA（dsCmCSA）水稻進行了室內(nèi)和田間RNA干擾（RNAi）效應(yīng)鑒定。結(jié)果表明，相比于對照組，取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻的稻縱卷葉螟體型變小，蛻皮困難，出現(xiàn)畸形表型，死亡率明顯增加。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析表明，取食轉(zhuǎn)基因水稻株系CAⅡ-5的幼蟲體內(nèi)CmCSA表達量比對照組下降了54.00%。田間實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻株系CAⅡ-5的卷葉率和白葉率分別為7.98%和5.04%，與對照組差異顯著。轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻具有明顯的RNAi效應(yīng)，抗蟲效果較好。該研究為利用轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)對稻縱卷葉螟進行綠色防控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：稻縱卷葉螟;幾丁質(zhì)合成酶A;RNA干擾;抗蟲性

中圖分類號：Q966

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2018）06-0036-05?國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.007

水稻是一種主要的谷類糧食作物，全球有一半以上的人口以大米為食。我國是主要的稻米生產(chǎn)國和消費國之一，因此，水稻的豐產(chǎn)和我國經(jīng)濟的發(fā)展具有緊密的聯(lián)系。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis），俗稱卷葉蟲、苞葉蟲等，屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是危害水稻的四大害蟲之一，嚴重影響水稻的產(chǎn)量[1-2]。稻縱卷葉螟是一種典型的遷飛性害蟲，目前對該蟲的防治方法主要是噴灑農(nóng)藥，但由于長期使用化學(xué)藥物，不僅帶來嚴重的“3R”問題，還使得糧食的安全問題日益突顯。因此，尋找一種綠色、環(huán)保、經(jīng)濟的害蟲防治方法迫在眉睫。

幾丁質(zhì)（chitin）是存在于自然界中的一類天然多聚物，是昆蟲外骨骼、氣管、中腸等組織的重要組分，對昆蟲的生長發(fā)育和繁殖等生理過程具有重要作用[3]。昆蟲幾丁質(zhì)的合成是一個由多種酶參與調(diào)控的復(fù)雜過程，其中幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase）是幾丁質(zhì)合成通路中最后一個酶，能催化UDP-N-乙酰氨基葡糖形成幾丁質(zhì)多聚物，在幾丁質(zhì)合成過程中至關(guān)重要，是控制害蟲的理想靶標。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是機體抵抗病毒或其它外來核酸入侵的重要保護性機制，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）抑制細胞內(nèi)與其同源基因的表達，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[4]。由于RNAi作用具有高度的特異性、高效性和放大效應(yīng)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于如抗人體病毒研究、腫瘤治療、植株品種改良等生物領(lǐng)域[5]。在昆蟲學(xué)中，RNAi技術(shù)主要用于基因功能研究以及害蟲的防治，研究者將體外合成靶標基因的dsRNA或小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）通過飼喂、注射、轉(zhuǎn)基因等方式導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)引發(fā)RNAi效應(yīng)，獲得目標基因的生理缺陷，從而一方面可鑒定昆蟲基因功能，另一方面也達到防治害蟲的目的。Chen等[6]通過RNAi沉默甜菜夜蛾Spodoptera exigua 幾丁質(zhì)合成酶A基因（SeCSA），昆蟲的生長發(fā)育受到抑制，出現(xiàn)蛻皮障礙、表皮幾丁質(zhì)層不能正常形成、氣管發(fā)育畸形等現(xiàn)象。Mao等[7]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將細胞色素P450基因?qū)朊藁ㄖ?，棉鈴蟲 Helicoverpa armigera在取食表達靶標基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花后出現(xiàn)發(fā)育遲緩癥狀。應(yīng)用 RNAi 技術(shù)能有效地保護農(nóng)作物抵抗害蟲危害，在農(nóng)作物遺傳改良進行精準抗蟲方面具有重大的應(yīng)用前景。

本實驗室利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得表達稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A（CmCSA）基因dsRNA （dsCmCSA）的轉(zhuǎn)基因水稻。本研究用轉(zhuǎn)基因水稻子一代植株葉片分別在室內(nèi)和田間飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲，鑒定轉(zhuǎn)基因水稻株系的RNAi效應(yīng)，旨在為利用轉(zhuǎn)基因RNAi防治稻縱卷葉螟奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試昆蟲與水稻

供試昆蟲稻縱卷葉螟由本實驗室飼養(yǎng)[8]。在人工氣候箱內(nèi)用稻苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，相對濕度70%～80%，光周期14L∶10D。供試水稻為本實驗室種植的轉(zhuǎn)dsCmCSA 的中花11。

1.2?引物設(shè)計

利用Primer 6.0根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻靶標片段設(shè)計特異性PCR引物，同時針對CmCSA的開放閱讀框序列設(shè)計實時熒光定量PCR（RT-qPCR）引物（表 1），檢測取食轉(zhuǎn)基因水稻植株的稻縱卷葉螟CmCSA基因mRNA表達水平。以稻縱卷葉螟看家基因CmActin（GenBank登錄號：JN029806）為內(nèi)參對照。

1.3?轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻的PCR檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法分株提取8個轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻子一代株系（CAⅠ-3.1、CAⅠ-3.2、CAⅡ-2、CAⅡ-3.1、CAⅡ-3.2、CAⅡ-4.1、CAⅡ-4.2和CAⅡ-5）的DNA，以其為模板，利用表1中的引物，進行PCR擴增，檢測水稻植株中是否存在轉(zhuǎn)入的目標序列。反應(yīng)條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共36個循環(huán)，72℃ 延伸10 min，10℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4?室內(nèi)抗蟲性檢測

用葉片測定法進行RNAi水稻的室內(nèi)抗蟲性鑒定。分別剪取8個轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻株系的5片葉，用浸有保鮮液的棉花包裹好后放入不同的玻璃直管（12 cm×3 cm）中，每管接15頭稻縱卷葉螟3齡幼蟲，將玻璃直管兩端用紗布封口，然后將玻璃直管置于條件為：溫度（26±1）℃，相對濕度70%～80%，光周期14L∶10D的人工培養(yǎng)箱，每天定時在直管兩端噴灑保鮮液，3 d更換一次葉片。用正常水稻作為對照，每組設(shè)3個重復(fù)。每隔24 h，觀察記錄幼蟲取食、表型及存活情況。

1.5?死亡率與校正死亡率

稻縱卷葉螟取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻后，檢測CmCSA敲低對稻縱卷葉螟生長的影響。在接蟲7 d后統(tǒng)計死亡率和校正死亡率，死亡率計算公式：死亡率=死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100%;校正死亡率計算公式：校正死亡率=（實驗組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率） ×100%。

1.6?CmCSA基因沉默效應(yīng)檢測

為了更精確地檢測RNAi效應(yīng)，使用RT-qPCR技術(shù)檢測取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株的稻縱卷葉螟體內(nèi)CmCSA的mRNA表達水平，以CmActin為內(nèi)參對照。在稻縱卷葉螟3齡幼蟲取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株葉片7 d 后，分別收集實驗組和對照組玻璃直管中各2頭存活的幼蟲，用HP Total RNA Kit（Omega Bio-tek，USA）分別提取總RNA，具體步驟按照說明書進行操作。用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分別檢測總RNA的完整性和純度。按照PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa，China）試劑盒說明書，取1 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：1 μL RNA，1 μL Olige （dT）18 Primer，4 μL 5×Reaction Buffer，1 μL RNase Inhibitor（20 U/μL），2 μL dNTP Mixture，1 μL Revert Aid M-MuLV RTase （200 U/μL），10 μL RNase free Water。反應(yīng)條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min。然后以cDNA為模板在C1000 qPCR儀上進行RT-qPCR檢測。PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad，USA），補加滅菌水到總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行40個循環(huán)。采用CFX Manager軟件（Bio-Rad，USA）進行實驗數(shù)據(jù)記錄與分析。

1.7?田間抗蟲性檢測

將轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻以小區(qū)塊種植于惠水縣試驗田，選25株罩上尼龍網(wǎng)，至分蘗盛期（7月下旬），在每個網(wǎng)中的水稻上人工接種50頭稻縱卷葉螟低齡幼蟲，30 d后統(tǒng)計水稻的卷葉率和白葉率。平均每株卷葉率=卷葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/25;平均每株白葉率=白葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/25。每個處理重復(fù)3次，以正常水稻作為對照。

1.8?數(shù)據(jù)與分析

采用2-ΔΔCt 法分析稻縱卷葉螟取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻葉片后，其體內(nèi)CmCSA基因的mRNA相對表達量。結(jié)果以平均值±標準差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制柱形圖。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件中的方差分析（ANOVA）的最小顯著性差異（LSD）法進行多重比較檢驗（P <0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1?轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻的外源DNA片段檢測

以不同轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株的DNA為模板，進行PCR檢測，電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻子一代植株存在靶標DNA片段，可以用于后續(xù)的抗蟲性鑒定實驗。

2.2?CmCSA基因mRNA表達水平

在稻縱卷葉螟幼蟲取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻7 d 后，分別提取實驗組和對照組稻縱卷葉螟總RNA，進行RT-qPCR檢測。結(jié)果顯示，在取食8個不同轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株后，稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因的表達水平明顯下降，與對照組相比，差異顯著。因此，取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻后，稻縱卷葉螟體內(nèi)CmCSA基因具有明顯的沉默效應(yīng)。

2.3?取食和表型變化

接蟲后每隔24 h觀察稻縱卷葉螟幼蟲的取食情況，檢測轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻子一代株系對試蟲的RNAi效應(yīng)。結(jié)果顯示，在取食表達CmCSA dsRNA水稻葉片24 h后，稻縱卷葉螟幼蟲的取食情況和對照組沒有明顯差異;但48 h后，實驗組幼蟲出現(xiàn)明顯的拒食現(xiàn)象，而對照組水稻葉片被大量取食。在接蟲7 d后，實驗組幼蟲明顯小于對照組，蛻皮困難，出現(xiàn)畸形和死亡現(xiàn)象;部分存活幼蟲也不能正?；迹词鼓軌蚧?，但是蛹明顯小于對照組或出現(xiàn)畸形。這些結(jié)果表明，取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻葉片后，稻縱卷葉螟幼蟲活力降低，生長發(fā)育受阻。

1，4：取食正常水稻葉片的幼蟲; 2：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲變小; 3：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲出現(xiàn)畸形;5，7，9：取食正常水稻葉片的幼蟲能正?；?6，8：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲不能化蛹;10：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲化成的蛹變小

2.3?死亡率與校正死亡率

接蟲7 d 后，統(tǒng)計實驗組和對照組幼蟲存活情況，結(jié)果表明，在分別取食8個轉(zhuǎn)基因水稻植株7 d后，相較于對照組（701），稻縱卷葉螟死亡率大幅增加，實驗組與對照組差異顯著（表2）。這些結(jié)果表明，RNAi效應(yīng)明顯，轉(zhuǎn)基因水稻子一代株系對稻縱卷葉螟產(chǎn)生明顯的致死效應(yīng)。

2.5?田間抗蟲性檢測

在田間人工接蟲30 d后，轉(zhuǎn)基因水稻株系的卷葉率和白葉率明顯少于對照組（表3），二者之間差異顯著。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻能引發(fā)RNAi效應(yīng)，稻縱卷葉螟選擇性拒食這些轉(zhuǎn)基因水稻。

3?結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)是昆蟲體壁、中腸、氣管等多個組織的重要組成成分，對昆蟲的生長發(fā)育、蛻皮、繁殖具有重要作用。幾丁質(zhì)的合成是一個有多種酶參與調(diào)控的復(fù)雜過程，幾丁質(zhì)合成酶是幾丁質(zhì)合成通路上的最后一個酶，對昆蟲幾丁質(zhì)的合成至關(guān)重要。幾丁質(zhì)合成酶是無脊椎動物體內(nèi)特有的酶，故常被作為潛在綠色殺蟲劑的理想靶標。本研究中，通過給稻縱卷葉螟飼喂表達CmCSA基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因水稻葉片，可以觀察到試蟲生長發(fā)育受阻，蛻皮困難，并出現(xiàn)畸形，最終導(dǎo)致死亡;部分能完成蛻皮，體型比對照組幼蟲小，無法繼續(xù)生長至化蛹;或者能夠化蛹，但是蛹的大小明顯小于對照組或發(fā)育為畸形蛹。RT-qPCR檢測結(jié)果表明，CmCSA基因被有效沉默，mRNA表達水平顯著低于對照組。我們推測出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是由于CmCSA表達下降，幾丁質(zhì)合成通路紊亂，幾丁質(zhì)含量降低，影響新表皮的形成，導(dǎo)致試蟲蛻皮困難，發(fā)育阻滯。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)SeCSA表達被抑制之后，甜菜夜蛾生長發(fā)育受到阻礙，蟲體無法正常完成蛻皮，即使完成蛻皮，蟲體小于正常幼蟲，無法繼續(xù)生長至蛹。Arakane 等[9]干擾赤擬谷盜Tribolium castaneum幾丁質(zhì)合成酶基因（TcCHS1），發(fā)現(xiàn)TcCHS1能影響幼蟲-幼蟲，幼蟲-蛹和蛹-成蟲的蛻皮，且對于昆蟲的繁殖和卵的孵化都有影響。Zhang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗Locusta migratoria 2 齡若蟲LmCHS1 （LmCHSA）被抑制后，飛蝗蛻皮時新舊表皮難以分離，無法正常完成蛻皮，最終死亡。以上研究結(jié)果表明，CSA在昆蟲的生長發(fā)育過程中至關(guān)重要，該基因表達下降直接影響昆蟲的正常生長發(fā)育。

自2001年Johansen首次通過構(gòu)建了具有綠色熒光蛋白基因（GFP）回文序列的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入煙草中成功表達dsRNA，成功沉默轉(zhuǎn)GFP基因煙草中的熒光信號以來，培育表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因作物技術(shù)已逐漸成熟，并已經(jīng)被用于研究多種植食性昆蟲的防治[12]。2007年，Baum等[13]通過飼喂表達V-ATP基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，發(fā)現(xiàn)玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera發(fā)育遲緩，死亡率升高，顯著減少其對玉米的為害，對玉米有顯著的保護作用;同年Mao等[7]將棉鈴蟲H.armigera中與解毒代謝直接相關(guān)的CYP6AE14 dsRNA在擬南芥和煙草上成功表達，使得取食轉(zhuǎn)基因植物的棉鈴蟲CYP6AE14基因表達受到抑制，從而使棉鈴蟲對棉子酚的抗性顯著降低，導(dǎo)致其出現(xiàn)發(fā)育遲緩癥狀。這兩項研究結(jié)果表明，通過RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物用于害蟲控制有巨大的潛能。在此之后，RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)成功被用于多種害蟲的防治。如Han等[14]飼喂棉鈴蟲H.armigera表達dsHaHR3的棉花，導(dǎo)致棉鈴蟲畸形并大幅死亡，棉花產(chǎn)量大幅增加;Zha等[15]通過在水稻中表達褐飛虱Nilaparvata lugens中腸里高表達的3個基因NlHT1、Nlcar和Nltry，取食轉(zhuǎn)基因水稻的褐飛虱，這3個基因均有效地被沉默;Mao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，取食表達hunchback基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草后，煙蚜Myzus persicae繁殖受阻，hunchback基因的表達顯著被抑制。上述研究表明，選擇合適的靶標基因，通過植物介導(dǎo)的RNAi沉默昆蟲體內(nèi)的特定基因表達，能夠控制蟲害的發(fā)生，這將有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染，為作物害蟲防治開辟了新的領(lǐng)域。

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