姚瑞玲　李慧娟　張曉寧　王胤

摘要： 馬尾松（Pinus massoniana）是我國南方生態(tài)建設(shè)與造林用材的主要樹種，為了揭示馬尾松抗蟲機理尤其是誘導(dǎo)抗蟲性的分子機制，該研究以馬尾松幼苗為材料，通過外源噴施茉利酸甲酯（MeJA），分析了處理與對照間植株針葉顯微結(jié)構(gòu)、萜類合成酶活性及其細(xì)胞化學(xué)定位的變化。結(jié)果表明：在0.2 mmol·L-1 MeJA處理下馬尾松植株松針中萜類物質(zhì)，尤其是單萜、二萜的相對含量增加，馬尾松毛蟲拒食性明顯，誘導(dǎo)抗性增強。顯微觀測中，針葉葉肉細(xì)胞內(nèi)樹脂道分泌物增加，葉綠體數(shù)目減少，但葉綠體體積增大，葉綠體片層結(jié)構(gòu)增加。MeJA處理4周后，針葉中萜類合成酶活性增加，通過電鏡酶細(xì)胞化學(xué)觀察，膜系統(tǒng)尤其是葉綠體膜上萜類合成酶活性定位明顯增強。這說明MeJA誘導(dǎo)的馬尾松誘導(dǎo)抗性可能與改變的葉綠體結(jié)構(gòu)及綠色質(zhì)體萜類合成酶活性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 馬尾松， 誘導(dǎo)抗性， 細(xì)胞化學(xué)， 萜類物質(zhì)

中圖分類號： S722.8文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0876-10

Abstract： Pinus massoniana is one of the most important tree species for afforestation in South China， and it is of great economic value and ecological benefit. This study aimed to reveal the cytological basis in relation to induced resistance during the biosynthesis of terpenoids in P. massoniana， and provide the guide for the further research on molecular mechanism of induced insect resistance in P. massoniana. In the illumination incubator with strictly controlled conditions of light and temperature， variations of microscopic structure， terpenoid synthetase activity and its cytochemical localization of needles were investigated in P. massoniana seedlings treated by exogenous jasmonates. The results showed that there were increases in the relative contents of terpenoids， especially， in those of monoterpenoids and diterpenoids， and the antifeedant of Dendrolimus punctatus against needles in Pinus massoniana seedlings was increased following the treatment of 0.2 mmol·L-1 MeJA， which indicated that the induced resistance of P. massoniana were strengthened. For the variations of anatomical structure， secretions of resin canal were enhanced， the number of chloroplast was reduced， the volume of it was increased， and the thylakoid of it was enhanced in the needles of P. massoniana seedlings. The activity of terpenoid synthetase was increased after four weeks of MeJA treatment. The localization of terpenoid synthetase activity was remarkably increased from membrane system， especially， from chloroplast membrane in the needles of P. massoniana seedlings using the method for electron microscopic cytochemistry of enzyme. This implies that the induced resistance is closely related to the changed chloroplast structure and terpenoid synthetase activity in green plastids in P. massaniana exposed to MeJA treatment.

Key words： Pinus massoniana， induced resistance， cytochemistry， terpenoid

馬尾松（Pinus massoniana）是我國造林用材與生態(tài)建設(shè)的主要造林樹種，人工林面積達1 200萬hm2，居全國喬木樹種的首位，其利用價值高，生態(tài)、經(jīng)濟與社會效益顯著，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景（丁貴杰等，2006）。馬尾松蟲害嚴(yán)重，發(fā)生面積最大，在我國周期性暴發(fā)成災(zāi)，制約了馬尾松產(chǎn)業(yè)的高效發(fā)展（戈峰等，2002）。目前，利用馬尾松組成抗性通過良種選育在蟲害防治方面取得了顯著成效，但在馬尾松誘導(dǎo)抗性方面的報道仍鮮少見，其抗蟲機制仍不清楚（胡少波等，1988；馬尾松抗松毛蟲抗性研究組，1990；孫艷麗，2010）。在馬尾松的誘導(dǎo)抗性機理研究中，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬尾松抗蟲性與萜類物質(zhì)有關(guān)（胡少波等，1988；胡永建，2010）。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）屬茉莉酸類物質(zhì)，其廣泛地存在于植物體中，化學(xué)起源于膜脂，由α-亞麻酸經(jīng)系列酶促反應(yīng)生成（Creelman & Mullet， 1997）。眾多研究表明，MeJA對植物有廣泛的生理效應(yīng)，在代謝和生理功能上具有植物激素的特點（Fldt et al， 2003； Mithfer & Boland， 2012）。MeJA作為內(nèi)源信號分子不僅調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，而且通過外源應(yīng)用能夠誘導(dǎo)植物對機械傷害、病蟲害、干旱、鹽漬和低溫等逆境的防御反應(yīng)（張秋菊等，2012；Hung & Kao， 2004； Ananieva et al， 2007）。研究證明，外源施用MeJA可顯著增加植物內(nèi)源萜類次生代謝物質(zhì)的合成，植株抗蟲性增強（胡永建，2010；馮宏祖等，2013）。王立春等（2008）發(fā)現(xiàn)，通過噴灑MeJA于馬尾松植株上，針葉中萜類物質(zhì)含量增加，抗蟲性增強。萜類物質(zhì)種類繁多，在不同的細(xì)胞場所形成不同的萜類化合物（王凌健等，2013），但在外源MeJA誘導(dǎo)下，導(dǎo)致馬尾松植株針葉中萜類組分變化的細(xì)胞學(xué)機制仍不清楚。

萜類化合物（terpenoids）是植物次生代謝物中的一類重要化合物，許多萜類化合物被植物用于防御外來植食性害蟲和其伴生致病真菌的侵害，是植物重要防御物質(zhì)（Erbilgin & Colgan，2012）。萜類化合物經(jīng)甲羥戊酸途徑（MVA）和 5-磷酸脫氧木酮糖/2C-甲基4-磷酸-4D-赤蘚糖醇途徑（DOXP/MEP）途徑合成。這兩種途徑存在于植物細(xì)胞內(nèi)的不同位置，分隔卻非絕對獨立，其中共有的少量代謝物可以在質(zhì)體膜上相互交換（Kasahara et al， 2002）。少量來自細(xì)胞質(zhì)中 MVA 途徑的產(chǎn)物可以進入質(zhì)體，形成部分單萜和二萜（Arigoni et al， 1997）。

萜類物質(zhì)可以被鋨酸固定成為嗜鋨滴，根據(jù)細(xì)胞中嗜鋨滴的分布，可以說明萜類物質(zhì)合成的場所與轉(zhuǎn)運情況（梁社堅和吳鴻，2010；Fahn & Benayoun， 1976）。因此，國內(nèi)外許多學(xué)者采用電子顯微鏡觀測了萜類物質(zhì)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的變化。然而由于鋨酸與萜類物質(zhì)之間的結(jié)合并非特異性反應(yīng)，其靈敏度不高，且嗜鋨滴的分布及變化情況并不能精確顯示萜類物質(zhì)在細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)移。酶細(xì)胞化學(xué)方法是研究萜類物質(zhì)的合成過程和分泌途徑的有效方法。電鏡酶細(xì)胞化學(xué)（electron microscopic cytochemistry of enzyme）采用電子顯微鏡超薄切片技術(shù)，研究細(xì)胞中各種酶在超微結(jié)構(gòu)水平上的分布及其在細(xì)胞生理和病理過程中的變化，以及這些變化與細(xì)胞功能的關(guān)系（鄭國锠和谷祝平， 1987）。本研究通過外源噴施茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），分析了馬尾松針葉解剖構(gòu)造及萜類合成酶活性細(xì)胞化學(xué)定位的變化，以期揭示馬尾松誘導(dǎo)抗性機制中萜類物質(zhì)生物合成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，為深入開展馬尾松誘導(dǎo)抗蟲性的分子調(diào)控機制提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1 試驗處理

選擇長勢良好、高度為20～30 cm，未受蟲害、無機械損傷的盆栽健康馬尾松幼苗（來自廣西寧明縣派陽山林場桐棉松），噴灑茉莉酸甲酯（茉莉酸甲酯購買于Sigma-Aldrich Chem.Co.，純度>95%）。根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，本研究選擇處理后馬尾松毛蟲拒食性明顯、GC-MS分析萜類組分相對含量變化較大，而植株受傷害程度相對較輕的MeJA實驗處理濃度，即0.2 mmol·L-1（pH 7. 0，含0. 01%吐溫-20），對照（control）為蒸餾水（pH 7. 0，含0. 01%吐溫-20）。將處理溶液葉面噴施馬尾松幼苗，每次噴施溶液量每盆100 mL，每個處理重復(fù)30盆，共處理60盆。連續(xù)處理幼苗4周，每2 d噴施一次，共噴施14次，停止噴施5 d后采樣測定。采樣時，對照、MeJA 處理各選取8株幼苗，每個處理每個重復(fù)選取1株，每株選擇在處理進行期間形成的健康、完全伸展的成熟針葉束。處理在人工氣候箱（PQX-250）中進行，溫度25 ℃/20 ℃（晝/夜），光周期12 h，光強6 000 lx，相對濕度85%。

1.2 試驗方法

1.2.1 松毛蟲拒食性觀察馬尾松毛蟲是馬尾松的優(yōu)勢害蟲（章康華等，2002）。本試驗在HPS-280生化培養(yǎng)箱內(nèi)進行，試驗條件為溫度（25±0.5）℃，光照16 h·d-1，相對濕度60%。在1 000 mL 燒杯內(nèi)，用各處理的新鮮松針飼養(yǎng)蟲齡一致的馬尾松毛蟲幼蟲。選取馬尾松毛蟲第2代期間幼蟲20條，每處理10條，每3 d植株上采集以上各處理新鮮無雜物松針作為馬尾松毛蟲的食物來源，然后根據(jù)幼蟲攝食量來判斷MeJA處理對馬尾松毛蟲拒食性的影響。幼蟲攝食量的計算采用李鎮(zhèn)宇等（1998）的方法：每日取食量=（當(dāng)日投食量-次日殘留剩余量）×（1-失水率）。

1.2.2 次生代謝物質(zhì)GC-MS分析從對照和MeJA中每處理取樣10株，將樣葉經(jīng)流水沖洗干凈后，切下約10 mm烘干后磨成粉作為樣品備用。樣品用正己烷浸提制備，正己烷浸提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，然后加入正己烷溶解，過濾，濾液待進樣分析。重復(fù)制樣3次。儀器采用7890A / 5975C型GC-MS聯(lián)用儀（美國Agilent公司生產(chǎn)），氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；柱溫為100 ℃，以3 ℃·min-1速率升溫至180 ℃，又以10 ℃·min-1速率升溫至250 ℃；汽化室溫度250 ℃；FID檢測器加熱器250 ℃；載氣為體積分?jǐn)?shù)99. 999%的高純氦氣；載氣流量1.0 mL·min-1；進樣量4.0 μL，分流進樣，分流比40∶1。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃；MS四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；溶劑延遲3.4 min；質(zhì)量范圍80～500 amu。數(shù)據(jù)通過Agilent Chemstation化學(xué)工作站NIST05a.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照，鑒定各組分峰，并按峰面積歸一化法計算求得各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 葉片顯微構(gòu)造觀察馬尾松幼苗經(jīng)MeJA噴施處理4周，并停止噴施5 d后的24 h內(nèi)，分別選取對照和MeJA處理中生長健壯、無病蟲害部位的功能針葉為試驗材料，觀察馬尾松針葉葉肉組織與細(xì)胞顯微構(gòu)造的變化。取樣時，每處理取樣3株，每株取3根針葉，切成小塊后，每處理至少取10個小塊進行觀察。葉肉組織與細(xì)胞制樣與觀察的方法分別如下：

將葉片經(jīng)流水沖洗干凈后，切下5～8 mm長度的針葉，轉(zhuǎn)入FAA 固定液進行，依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精系列脫水，然后進行透蠟和包埋。最后用轉(zhuǎn)動切片機切片，進行番紅固綠對染后用阿拉伯中性樹膠封片，觀察葉肉組織解剖構(gòu)造并顯微拍照。

將葉片橫切成3 mm×4 mm大小葉塊，以2% OsO4固定，酒精梯度脫水并包埋于環(huán)氧樹脂（Epon 812）中，用超薄切片機 Leica-ULTRACUT型（ 德國）切片。超薄切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，在電子透射顯微鏡（JEM-1230型，日本） 下觀察細(xì)胞構(gòu)造并照相。

1.2.4 萜類合成酶活性測定采用上海嵐派生物科技有限公司48T的檢測試劑盒進行萜類合成酶活性測定。具體試驗流程如下：

從對照和MeJA中每處理取樣3株，每株分別準(zhǔn)確稱取針葉0.5 g，加入4.5 mL 0.01mol·L-1 的PBS勻漿液（pH=7.4），迅速研磨樣品至完全勻漿狀。4 ℃離心20 min左右（2 000～3 000 r·min-1），仔細(xì)收集上清，進行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣，用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液（將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍）洗滌，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。每孔加滿洗滌液洗滌，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。加終止液后15 min以內(nèi)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。用標(biāo)準(zhǔn)物的活性與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品活性，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際活性。

1.2.5 萜類合成酶細(xì)胞化學(xué)定位參照李愛明（2004）和Kenneth（1987）的方法，制作超薄切片，方法略有改動。從對照和MeJA中每處理取樣3株，分別將針葉切成0.1 mm3大小，迅速投入由0.05 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液配制，pH7.0配制而成的4%甲醛和1%戊二醛的固定液中12 ℃固定10～30 min。二甲砷酸鈉緩沖液洗滌3次，每次20 min，在3 mmol·L-1的鐵氰化鉀（0.05 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液配制，pH7.0）溶液中室溫預(yù)孵育20 min，隨后用方法洗滌。在如下孵育液中室溫孵育45 min。

孵育液的組成如下：含乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A的完全孵育液中，2 mg·mL-1鐵氰化鉀，1 mg·mL-1醋酸鈾，0.8 mg·mL-1乙酰輔酶A鈉鹽，1.6 mg·mL-1乙酰乙酰輔酶A鈉鹽，0.05 mol·mL-1二甲砷酸鈉緩沖液，pH7.0；加熱使酶失活的對照（固定后，在90 ℃的二甲砷酸鈉緩沖液中處理20 min，再預(yù)孵育，然后孵育）。孵育完后，在2%鋨酸（0.05 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液，pH7.0）中室溫固定1 h。二甲砷酸鈉緩沖液洗滌。系列酒精（50%、70%、85%、95%、100%）脫水，環(huán)氧丙烷過渡，EPON812和環(huán)氧丙烷滲透，EPON812包埋。35 ℃聚合24 h，45 ℃聚合24 h，60 ℃聚合24 h。每處理至少取10個樣塊進行觀察，切片后，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察與拍照 。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗差異顯著性分析。其中，不同小寫字母表示在α=0.05水平對照與MeJA處理間各指標(biāo)差異達顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1 馬尾松誘導(dǎo)抗性分析

從圖1可以看出，在MeJA噴灑處理下，馬尾松毛蟲幼蟲在處理植株松針上的取食量與對照相比差異達顯著水平。MeJA處理7 d時，馬尾松毛蟲齡期為3齡，馬尾松針葉上取食的幼蟲日平均取食量為每頭0.15 g，為對照植株針葉上取食量的71.4%；處理14 d時，馬尾松毛蟲齡期為4齡，為對照取食量的59.5%；處理達21～28 d時，馬尾松毛蟲齡期為5～6齡，僅為對照取食量的26.5%～32.0%。

從幼蟲各發(fā)育時期取食量的變化來看，在處理21 d以上時，幼蟲齡期達5～6齡，在對照植株上取食量顯著增加，為3齡期取食量的3.6～5.1倍；而在MeJA處理下，處理14～28 d時，幼蟲齡期為4～6齡，隨著幼蟲齡期增長幼蟲取食量變化不明顯，均為3齡期取食量的1.6倍左右。

以上結(jié)果表明，在MeJA處理植株松針上的取食量都比未處理對照植株松針上小，且MeJA處理時間越長，與對照植株松針上幼蟲取食量的差異越明顯。這說明，馬尾松毛蟲對MeJA處理后的馬尾松植株松針產(chǎn)生了明顯的拒食性，即是說在MeJA處理下，馬尾松對松毛蟲的誘導(dǎo)抗性增強。

在MeJA處理下，植物產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗性與MeJA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性物質(zhì)有關(guān)（王立春等，2008；馮宏祖等，2013）。為進一步分析MeJA處理植株中抗性物質(zhì)的變化，對松針中萜烯類、有機酸類、醇類等次生代謝物質(zhì)進行了GC-MS分析。

經(jīng)GC-MS檢測，根據(jù)含量與匹配度較高的檢出化合物，馬尾松植株松針以萜烯類物質(zhì)為主，其對應(yīng)的總離子流氣相色譜圖如圖2所示。其中，對照植株松針中萜烯物質(zhì)占檢出化合物總量的80.1%；而MeJA處理植株松針中萜烯物質(zhì)含量占檢出化合物總量的97.4%。從萜烯組分及相對含量變化來看，以單萜、二萜類物質(zhì)所占比例較大，經(jīng)MeJA處理后其相對含量明顯增加，其中對照植株松針中單萜、二萜類物質(zhì)為35.7%，MeJA處理為61.5%。

2.2 針葉顯微構(gòu)造變化

從針葉顯微構(gòu)造觀測結(jié)果來看，與對照相比，外源噴施MeJA 4周后，馬尾松針葉角質(zhì)層增厚，樹脂道分泌物增多，內(nèi)皮層明顯增厚，細(xì)胞排列整齊、體積變?。▓D版Ⅰ：B）；電鏡下觀察，葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目減少，葉綠體體積增大，葉綠體類囊體、基粒片層結(jié)構(gòu)增多，淀粉粒極為明顯，液泡變小，細(xì)胞質(zhì)變濃（圖版Ⅰ：D）。

2.3 萜類合成酶活性變化

從圖3可以看出，MeJA處理后馬尾松幼苗針葉中萜類合成酶活性顯著增加。萜類合成酶是萜類化合物合成的關(guān)鍵酶，其活性越高，萜類物質(zhì)含量越高。根據(jù)GC-MS分析檢測結(jié)果，0.2 mmol·L-1 MeJA處理4周后針葉中萜類化合物組分變化不大，但萜類物質(zhì)相對含量明顯增加（圖2），這與本試驗測定的萜類合成酶活性結(jié)果是相吻合的。

2.4 萜類合成酶細(xì)胞化學(xué)定位

本研究進一步分析MeJA處理下馬尾松針葉中萜類生物合成與代謝場所的變化，對萜類合成酶活性進行了細(xì)胞化學(xué)定位觀察。萜類合成酶細(xì)胞化學(xué)定位是按照細(xì)胞中萜類合成酶反應(yīng)產(chǎn)物亞鐵氰化鈾沉淀的多少和部位來判斷萜類合成酶的活性和分布。在加熱使酶失活的對照中，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物亞鐵氰化鈾（圖版Ⅱ：A，C），而經(jīng)酶活性反應(yīng)的切片中則可見亞鐵氰化鈾沉淀（顆粒性狀不規(guī)則，較嗜鋨顆粒密集）均勻分布（圖版Ⅱ：B，D），這說明萜類合成酶反應(yīng)活性觀察結(jié)果是可靠的。

電鏡分析結(jié)果表明，萜類合成酶在馬尾松針葉細(xì)胞內(nèi)主要分布在葉綠體膜、質(zhì)膜及細(xì)胞壁等膜系統(tǒng)中（圖版Ⅱ：B，D）。馬尾松幼苗針葉細(xì)胞內(nèi)葉綠體結(jié)構(gòu)完整，葉綠體內(nèi)有嗜鋨顆粒分布，葉綠體內(nèi)可見淀粉粒。與對照相比，MeJA處理4周后萜類合成酶活性在葉綠體膜上活性明顯增強（圖版Ⅱ：D，如箭頭所示）。

3討論與結(jié)論

在本研究中，經(jīng)0.2 mmol·L-1MeJA處理4周，馬尾松植株針葉中萜類物質(zhì)增多，馬尾松毛蟲拒食性明顯，馬尾松誘導(dǎo)抗性增強，這與王立春等（2008）的研究結(jié)果是相似的。從細(xì)胞解剖構(gòu)造來看，經(jīng)MeJA處理后馬尾松植株松針表皮角質(zhì)層與內(nèi)皮層增厚，細(xì)胞排列緊密，外生樹脂道中分泌物增多，葉綠體體積增大、葉綠體內(nèi)類囊體片層結(jié)構(gòu)明顯增加。馬尾松樹脂道中形成的產(chǎn)物主要為萜烯物質(zhì)，并以單萜、二萜類化合物所占比例較大（李愛民，2004）。在本試驗GC-MS分析檢測中，MeJA處理后檢出化合物中萜類物質(zhì)的相對含量增加，高達97.4%，其中單萜、二萜類化合物占61.5%，較對照植株增加了25.8%。初步認(rèn)為，MeJA促進了馬尾松樹脂道中萜類，尤其是單萜、二萜類化合物的形成。高等植物通過光合同化CO2合成并積累形成葡萄糖，而葡萄糖經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化生成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，并進一步合成為萜類等次生物質(zhì)（Bartram et al， 2006； Eisenreich et al， 2010）。葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，而萜類物質(zhì)的生物合成與光合作用過程密切相關(guān)（王凌健等，2013）。這說明，外源噴施MeJA誘導(dǎo)馬尾松針葉中萜類物質(zhì)含量的增加，可能與其葉肉細(xì)胞中葉綠體構(gòu)造的改變有關(guān)。

萜類合成酶直接影響萜類化合物的生物合成（Tholl， 2006）。以往研究發(fā)現(xiàn)，不同抗性品種白松在單萜、倍半萜、二萜等萜類合成酶組成性表達上均沒有什么差異。但在創(chuàng)傷后16 d，抗性樹與易感樹的單萜合成酶和倍半萜合成酶在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出顯著性差異，創(chuàng)傷導(dǎo)致抗性樹和易感樹的萜類合成酶在轉(zhuǎn)錄水平上的增加（Byun-McKay et al， 2006）。在本研究中，萜類合成酶活性在MeJA處理4周后，相較對照萜類合成酶活性顯著增加。這與MeJA處理下，馬尾松幼苗針葉中萜類化合物相對含量明顯增加的變化趨勢是一致的。

萜類合成酶通過催化前體底物香葉酯二磷酸、法呢基焦磷酸、=牛兒基=牛兒基焦磷酸分別形成單萜、倍半萜和二萜等萜類物質(zhì)（龔治等，2010；岳躍沖和范燕萍，2011）。因此，萜類合成酶根據(jù)其功能可以分為單萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶等類型。從萜類物質(zhì)的合成代謝過程來看，由于萜類合成酶的變化，不同萜類化合物分別在細(xì)胞質(zhì)、線粒體、質(zhì)體等不同的細(xì)胞場所完成（王凌健等，2013）。本試驗萜類合成酶細(xì)胞化學(xué)定位觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較對照，MeJA處理后誘導(dǎo)了萜類合成酶在細(xì)胞膜系統(tǒng)活性定位的增強，尤其是在葉綠體膜上的酶活性定位明顯增加。從GC-MS檢測結(jié)果是來看，MeJA處理下檢出化合物中單萜、二萜的相對含量明顯增加。單萜、二萜合成酶主要位于質(zhì)體中（龔治等，2010；岳躍沖和范燕萍，2011；王凌健等，2013），葉綠體是質(zhì)體中的一種，這即是說，質(zhì)體上萜類合成酶活性增加將有利馬尾松誘導(dǎo)抗性中萜類物質(zhì)的增加。通過改變質(zhì)體（葉綠體）的結(jié)構(gòu)發(fā)育完整性、穩(wěn)定性及該場所萜類合成酶活性的生理生化與分子生物學(xué)基礎(chǔ)，來實現(xiàn)對馬尾松誘導(dǎo)抗蟲性的調(diào)控，這為今后深入開展馬尾松的誘導(dǎo)抗性機制提供了新的思路。

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