黃曉慧 巫偉峰 陳春 張毅智 汪長水 徐建球 陳發(fā)興 陳孝丑

摘要：【目的】優(yōu)化中國蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系，并篩選適用于中國蘭ISSR分析的候選引物，為ISSR分子標(biāo)記在中國蘭的輔助育種及親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析等提供技術(shù)參考?！痉椒ā恳?個中國蘭品種為材料，采集其葉片樣品，分別用研缽法和研磨儀法進行破碎研磨，比較兩種方法提取DNA的效果，利用L25（53）正交試驗和單因素試驗對DNA模板量、引物濃度、2×Taq Master Mix添加量、循環(huán)數(shù)和退火溫度進行優(yōu)化，建立最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系，并從ISSR分子標(biāo)記通用引物中篩選適用于中國蘭的ISSR分析候選引物?！窘Y(jié)果】研磨儀法提取的DNA濃度明顯高于研缽研磨法，但二者提取的DNA質(zhì)量均較好（OD260/OD280為1.7～2.0）。對ISSR-PCR反應(yīng)體系擴增結(jié)果的影響程度排序為DNA模板量>引物濃度>2×Taq Master Mix添加量。綜合考慮成本和DNA模板量，最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：DNA模板10.0 ng、引物0.8 μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0 μL。最佳循環(huán)數(shù)為35，最佳退火溫度為49.6 ℃?；谏鲜鰞?yōu)化結(jié)果，從100條引物中共篩選出42條適用于中國蘭的ISSR候選引物?！窘Y(jié)論】研磨儀法可有效提高中國蘭基因組DNA的提取率和質(zhì)量，且利用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴增程序及篩選出的引物，擴增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定，多樣性好，可用于中國蘭的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等分析研究。

關(guān)鍵詞： 中國蘭；ISSR；分子標(biāo)記；反應(yīng)；引物篩選

中圖分類號： S682.310.36 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1282-07

0 引言

【研究意義】中國蘭又稱國蘭，是中國傳統(tǒng)蘭花的統(tǒng)稱，為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）植物，其味幽香，花色淡雅，素有花中君子和天下第一香之美稱，且具有獨特的內(nèi)涵和意境，觀賞和經(jīng)濟價值很高（陳心啟，2011）。中國蘭約有50種，其中以地生蘭為主，分為春蘭（C. goeringii）、蕙蘭（C. faberi）、建蘭（C. ensifolium）、墨蘭（C. sinense）、寒蘭（C. kanran）、春劍（C. goeringii var. longibracteatum）、蓮瓣蘭（C. tortisepalum）和豆瓣蘭（C. serratum）八大類（陳心啟，2011），集中分布在長江流域、西南和東南等地區(qū)，其中以西南分布最多，其次為東南地區(qū)（曾碧玉等，2005）。目前，種質(zhì)資源缺乏是影響中國蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一（陳和明等，2007），利用分子標(biāo)記技術(shù)研究中國蘭的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等遺傳特征可為中國蘭育種及種質(zhì)資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。近年來，ISSR（Inter-simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)區(qū)間）分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于中國蘭的遺傳多樣性（高麗和楊波，2006a）、居群遺傳結(jié)構(gòu)（Yao and Yang，2007）和親緣關(guān)系（Qian et al.，2014）分析及雜交后代的雜種真實性鑒定（周麗和胡春根，2016）等研究。因此，優(yōu)化中國蘭ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對其輔助育種及親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析等研究均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有研究人員采用單因素試驗和均勻設(shè)計等方法對春蘭、建蘭、蕙蘭和墨蘭等的ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴增程序進行優(yōu)化。高麗和楊波（2006b）通過單因素試驗對DNA模板量、dNTPs濃度、MgCl2濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶添加量、退火溫度和循環(huán)數(shù)進行優(yōu)化，建立了春蘭的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，并發(fā)現(xiàn)上述因素對擴增效果均具有一定的影響。胡薇等（2007）通過均勻設(shè)計對引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和Taq DNA聚合酶添加量進行4因素5水平和4因素3水平優(yōu)化，建立了建蘭的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系，并篩選出14條擴增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的ISSR引物。劉菲等（2011）將單因素試驗和正交設(shè)計試驗相結(jié)合對中國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系中的dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+濃度和Taq DNA聚合酶添加量進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶添加量對擴增效果影響最明顯。王朝雯等（2014）通過單因素試驗研究多花蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶添加量、dNTPs濃度和DNA模板量對擴增效果的影響，結(jié)果表明除Mg2+濃度外，其他因素對擴增效果影響均較大。【本研究切入點】迄今，鮮見從DNA提取、反應(yīng)體系、擴增程序和引物篩選等方面進行系統(tǒng)優(yōu)化中國蘭ISSR-PCR技術(shù)的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用L25（53）正交設(shè)計試驗和單因素試驗對ISSR-PCR反應(yīng)體系中的DNA模板量、引物濃度和2×Taq Master Mix（PCR預(yù)混反應(yīng)液）及循環(huán)數(shù)、退火溫度等5個因素進行優(yōu)化，建立中國蘭的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系，并利用最佳反應(yīng)體系從哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR通用引物中篩選出適用于中國蘭的ISSR候選引物，為利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進行中國蘭種質(zhì)資源鑒定、分子輔助育種及親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析等提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

供試中國蘭為墨蘭品種企黑、春劍品種邊草、寒蘭品種應(yīng)欽素、春蘭品種翠一品、蕙蘭品種虞山梅和蓮瓣蘭品種合家歡，種植于福建省林業(yè)科技試驗中心蘭花種質(zhì)資源圃，均為5年生，分別采集其健康葉片，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饕噭焊咝е参锘蚪MDNA提取試劑盒和2×Taq Master Mix（由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和MgCl2混合而成）購自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設(shè)備：離心機（SIGMA 1-14K）、高通量組織研磨儀（YMY-200）、電泳儀（BIO-RAD PowerPac Universal）、電泳凝膠成像儀（BIO-RAD Gel DOCTMXR+）、超微量核酸測定儀（Thermo NANODROP ONE）、移液器（Eppendorf Research Plus）和PCR儀（BIO-RAD T100TM）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 對采集的葉片樣品分別用兩種方式進行破碎研磨：（1）陶瓷研缽研磨法（簡稱研缽法）：陶瓷研缽用液氮預(yù)冷，稱取0.5 g葉片樣品置于陶瓷研缽中充分研磨至粉末狀，取粉末。（2）高通量組織研磨儀鋼珠高頻振蕩破碎法（簡稱研磨儀法）：研磨儀配套的離心管盒、離心管和鋼珠用液氮預(yù)冷，稱取0.5 g葉片樣品置于裝有1個鋼珠的離心管，蓋好蓋子，以頻率1800次/min進行振蕩破碎，時間為3 min，結(jié)束后取粉末。

參照高效植物基因組DNA提取試劑盒說明，分別提取兩種破碎研磨方式獲得的粉末基因組DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（110 V恒壓下電泳25.0～30.0 min），用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1. 2. 2 引物設(shè)計及合成 本研究所用引物為UBC公布的100條ISSR通用引物，編號為UBC801～ UBC900，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1. 2. 3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗 采用L25（53）正交試驗設(shè)計，以合家歡基因組DNA為模板，對ISSR-PCR反應(yīng)體系中的引物濃度、DNA模板量和2×Taq Master Mix添加量進行優(yōu)化，因素和水平設(shè)計如表1所示，共25個組合，每個組合設(shè)2個重復(fù)，均以UBC807為引物。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4.0 min；94 ℃ 1.0 min，50 ℃ 1.0 min，72 ℃ 1.5 min，進行40個循環(huán)；72 ℃延伸8.0 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（110 V恒壓下電泳25.0～30.0 min），凝膠成像系統(tǒng)下成像拍照。

參考尚小紅等（2018）的直觀分析法進行電泳擴增譜帶分析，即根據(jù)電泳圖譜中電泳條帶數(shù)量、清晰度、重復(fù)性、亮度和背景干凈程度分別對25個組合進行打分，1～4分（清晰條帶少，亮度弱，雜帶多，重復(fù)性差，背景模糊），5～8分（清晰條帶多，但亮度較弱，有雜帶，重復(fù)性好，背景較干凈），9～12分（清晰條帶多，亮度較強，無雜帶，重復(fù)性好，背景清晰），13～16分（清晰條帶多，亮度強，無雜帶，重復(fù)性好，背景清晰）。利用Excel 2007計算均值（Km）和極差R，確定最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系。

1. 2. 4 退火溫度和循環(huán)次數(shù)優(yōu)化 以UBC807為引物，利用最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系對擴增程序中的退火溫度和循環(huán)數(shù)進行單因素試驗，其中循環(huán)數(shù)設(shè)為30、35、40和45共4個梯度，退火溫度使用PCR儀的自動梯度48.0、48.3、48.8、49.6、50.5、51.2、51.7和52.0 ℃共8個梯度，共32個組合。通過電泳圖的直觀觀察，選擇條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性好、成本低的組合作為最佳組合。

1. 2. 5 引物篩選 利用優(yōu)化獲得的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系、退火溫度和循環(huán)數(shù)對UBC公布的100條ISSR通用引物進行篩選，篩選出條帶清晰，多態(tài)性好的引物作為中國蘭的ISSR候選引物。為了使篩選結(jié)果更具代表性，將企黑、邊草、應(yīng)欽素、翠一品、虞山梅和合家歡的DNA進行同濃度等量混合組成的基因池為模板。

2 結(jié)果與分析

2. 1 兩種破碎研磨方法對DNA提取效果的影響

由圖1可知，研缽法和研磨儀法提取的DNA電泳條帶清晰，均具有較好的完整性，但研缽法提取的DNA（圖1-A）較研磨儀法（圖1-B）存在較明顯的降解現(xiàn)象。由表2可知，研磨儀法提取的DNA濃度達167.5～238.7 ng/μL，但研缽法提取的DNA濃度僅為16.3～25.7 ng/μL，即研磨儀法的DNA濃度明顯高于研缽法。兩種方法提取的DNA OD260/OD280均在1.70～2.00，表明使用這兩種方法均可得到質(zhì)量較好的中國蘭葉片DNA。

2. 2 PCR反應(yīng)體系的正交試驗結(jié)果

根據(jù)電泳結(jié)果可知，正交試驗25個組合的擴增條帶數(shù)量、清晰度、亮度和重復(fù)性等均存在明顯差異，其中合家歡的25個組合擴增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。利用直觀分析法分別對其進行打分，打分結(jié)果如表3所示。組合1、6、11和16擴增譜帶的多態(tài)性較高，但條帶模糊；組合10的多態(tài)性最低；組合4、5、13、20、24和25的擴增效果較理想。Km表示因素m水平下的均值，Km越大，該水平擴增效果越好；R反映因素對擴增效果的影響程度，R越大，該因素對擴增效果的影響越大（尚小紅等，2018），因此可確定3個因素對ISSR-PCR反應(yīng)體系擴增效果的影響程度排序為DNA模板量>引物濃度>2×Taq Master Mix添加量，最佳組合為DNA模板量50 ng，引物濃度1.0 μmol/L，2×Taq Master Mix添加量10.0 μL。但綜合考慮成本，以較少的試劑用量達相似效果即為最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系。在25個組合中，組合4的DNA模板、引物和2×Taq Master Mix用量均較少，擴增效果較佳，因此確定組合4為最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系，即20.0 μL反應(yīng)體系中含10 ng DNA模板、引物0.8 μmol/L、2×Taq Master Mix 9.0 μL。

2. 3 退火溫度和循環(huán)數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知，35個循環(huán)+48.3 ℃、35個循環(huán)+48.8 ℃、35個循環(huán)+49.6 ℃、40個循環(huán)+48.0 ℃、40個循環(huán)+48.3 ℃、40個循環(huán)+49.6 ℃、40個循環(huán)+50.5 ℃、40個循環(huán)+51.2 ℃、45個循環(huán)+48.0 ℃、45個循環(huán)+51.2 ℃、45個循環(huán)+51.7 ℃和45個循環(huán)+52.0 ℃共12個組合具有清晰、穩(wěn)定的擴增譜帶。當(dāng)循環(huán)數(shù)為30個時，擴增譜帶模糊，而循環(huán)數(shù)為35、40和45個時均可擴增出清晰易辨的譜帶。綜合擴增時長和譜帶質(zhì)量，最佳的PCR程序循環(huán)數(shù)為35個，退火溫度為48.0～49.6 ℃時，均可獲得較好的擴增效果，其中以退火溫度為49.6 ℃時最佳。

2. 4 引物篩選結(jié)果

以混合的DNA基因池為模板，應(yīng)用最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增，結(jié)果如圖4所示。從100條ISSR引物中共篩選出44條電泳條帶清晰的通用引物，但以具有3條或3條以上清晰條帶作為多態(tài)性較好的標(biāo)準(zhǔn)，UBC878和UBC853被剔除，剩余的42條引物擴增條帶清晰、多態(tài)性良好，可作為中國蘭的ISSR候選引物，引物序列見表4。優(yōu)化獲得的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系不僅適用于引物UBC807，同時適用于其他41條ISSR引物。

3 討論

ISSR分子標(biāo)記是一種以微衛(wèi)星序列為引物進行多位點PCR擴增技術(shù)。清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好的DNA指紋圖譜是ISSR分析的基礎(chǔ)，而DNA模板量和質(zhì)量、引物濃度、DNA聚合酶量、循環(huán)數(shù)和退火溫度等均是影響圖譜質(zhì)量的主要因素，因此，優(yōu)化DNA提取方法、ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴增程序尤為重要。

高質(zhì)量的DNA模板是ISSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。對于中國蘭，尤其是名貴中國蘭品種，采摘葉片對其植株的生長影響較大，尤其是采摘幼葉，由于葉片組織的纖維較多，質(zhì)地較硬且粗糙，研磨時常見條狀纖維，故破壁效果較差，但采摘花苞對中國蘭生長影響小，及時摘除花苞反而能減少營養(yǎng)消耗，且花苞易研磨，因此，花苞是提取中國蘭DNA的首選材料（陳惠云等，2005），但受采摘時間限制，且花苞的蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)含量遠高于葉片，提取高質(zhì)量DNA較葉片困難（陳惠云等，2005；李小玲和華智銳，2014）。相對于普通中國蘭品種，葉片仍是提取基因組DNA的主要材料，提取率與葉片的幼嫩程度相關(guān)，老葉木質(zhì)化程度較高導(dǎo)致研磨困難，提取率較低，嫩葉易研磨，提取率較高（胡薇等，2004；李小玲和華智銳，2014）。本研究對采集的葉片樣品分別用研缽法和研磨儀法進行破碎研磨，比較兩種方法提取DNA的效果，結(jié)果顯示，研磨儀法提取的DNA濃度明顯高于研磨法，表明研磨儀研磨可促進葉片的破碎，從而提高DNA提取率?？梢姡崛≈袊mDNA可優(yōu)先選擇研磨儀研磨。

ISSR分子標(biāo)記是一種基于PCR擴增的遺傳分析技術(shù)，擴增效果受諸多因素影響，主要有DNA模板量、引物濃度、Taq DNA聚合酶、退火溫度和循環(huán)數(shù)等。高麗和楊波（2006b）研究表明，DNA模板量、dNTPs濃度、MgCl2濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶添加量、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)對春蘭的ISSR-PCR擴增效果具有不同程度的影響，其中DNA模板量對擴增效率的影響較小，但引物濃度對擴增效率的影響較大。馬麗婭等（2008）研究表明，DNA模板量對ISSR-PCR擴增效果的影響不明顯。以上研究結(jié)果均顯示，DNA模板量對擴增效果的影響較小，其原因可能是以上研究均采用單因素試驗，研究結(jié)果只代表在單一維度下不同因子的影響力。而本研究采用正交試驗，從多維度對中國蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，結(jié)果表明，DNA模板對PCR反應(yīng)結(jié)果的影響最大，其次為引物濃度，2×Taq Master Mix添加量的影響最小。傳統(tǒng)的ISSR分析方法需在反應(yīng)體系中加入Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反應(yīng)緩沖液等多種試劑（高麗和楊波，2006a；胡薇等，2007；馬麗婭等，2008），但本研究使用2×Taq Master Mix，該試劑混合了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反應(yīng)緩沖液，即2×Taq Master Mix作為一個整體，與將Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2等試劑單獨作為考察因子的研究存在一定差異，今后應(yīng)深入研究其差異，以全面系統(tǒng)地優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系。

4 結(jié)論

研磨儀法可有效提高中國蘭基因組DNA的提取率和質(zhì)量，且利用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴增程序及篩選出的引物擴增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定，多樣性好，可用于中國蘭的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等分析研究。

參考文獻：

陳和明，朱根發(fā)，廖飛雄，王碧青，龔妮，胡哲森. 2007. 廣東省蘭花種質(zhì)資源的收集保存與評價利用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，（6）：27-29. [Chen H M，Zhu G F，Liao F X，Wang B Q，Gong N，Hu Z S. 2007. Collection，conservation，eva-luation and utilization of orchidaceae germplasm in Guangdong[J]. Guangdong Agricultural Sciences，（6）：27-29.]

陳惠云，孫志棟，王曉武，葛紅. 2005. 春蘭DNA提取影響因子分析[C]. 長三角現(xiàn)代植物生物學(xué)與農(nóng)業(yè)專題論壇論文集. 上海：中國植物生理與分子生物學(xué)學(xué)會. [Chen H Y，Sun Z D，Wang X W，Ge H. 2005. Analysis of inf-luence factors of DNA extraction from Cymbidium goeringii[C]. The Yangtze River Delta Modern Plant Biology and Agriculture Forum Proceedings. Shanghai：Chinese Society for Plant Biology.]

陳心啟. 2011. 國蘭及其品種全書[M]. 北京：中國林業(yè)出版社. [Chen X Q. 2011. Manual of Chinese Cymbidiums and Their Cultivars[M]. Beijing：China Forestry Publishing House.]

高麗，楊波. 2006a. 春蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，25（3）：305-309. [Gao L，Yang B. 2006a. Establishment of ISSR-PCR reaction system in Cymbi-dium goeringii[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，25（3）：305-309.]

高麗，楊波. 2006b. 湖北野生春蘭資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 生物多樣性，14（3）：250-257. [Gao L，Yang B. 2006b. Genetic diversity of wild Cymbidium goeringii（Orchidaceae） populations from Hubei based on ISSR analysis[J]. Biodiversity Science，14（3）：250-257.]

胡薇，黃儒珠，孫端，饒春榮，李錦鳳. 2007. 均勻設(shè)計優(yōu)化建蘭ISSR-PCR體系[J]. 生命科學(xué)研究，11（1）：58-63. [Hu W，Huang R Z，Sun D，Rao C R，Li J F. 2007. Optimization of ISSR-PCR system of Cymbidium ensifolium by uniform design[J]. Life Science Research，11（1）：58-63.]

胡薇，孫端，潘曉華，黃儒珠. 2004. 建蘭DNA的快速提取[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），20（1）：118-120. [Hu W，Sun D，Pan X H，Huang R Z. 2004. Rapid extraction of DNA in Cymbidium goeringii[J]. Journal of Fujian Normal University（Natural Science Edition），20（1）：118-120.]

李小玲，華智銳. 2014. 商洛野生蕙蘭基因組DNA提取方法的比較[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1（1）：73-76. [Li X L，Hua Z R. 2014. Comparison of methods for genomic DNA extraction from wild Cymbidium faberi Rolfe in Shangluo[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，1（1）：73-76.]

劉菲，李萍，何俊榮，蔣彧，卓碧萍，孫淑霞. 2011. 國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝，（17）：136-139. [Liu F，Li P，He J R，Jiang Y，Zhuo B P，Sun S X. 2011. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system of Chinese Cymbidium[J]. Northern Horticulture，（17）：136-139.]

馬麗婭，孫小琴，賈文杰，李恩香，楊柏云. 2008. 春蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（34）：14912-14914. [Ma L Y，Sun X Q，Jia W J，Li E X，Yang B Y. 2008. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system for Cybidium goeringii[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，36（34）：14912-14914.]

尚小紅，嚴(yán)華兵，曹升，張尚文，謝向譽，王艷，歐昆鵬. 2018. 葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（1）：1-7. [Shang X H，Yan H B，Cao S，Zhang S W，Xie X Y，Wang Y，Ou K P. 2018. Optimization of SCoT-PCR reaction system and primer selection for Puera-ria DC[J]. Journal of Southern Agriculture，49（1）：1-7.]

王朝雯，王云艷，肖春宏，孫小琴，楊柏云. 2014. 臺蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（15）：4583-4586. [Wang Z W，Wang Y Y，Xiao C H，Sun X Q，Yang B Y. 2014. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system for Cymbidium floribundum var. Pumilum[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，42（15）：4583-4586.]

曾碧玉，朱根發(fā)，劉海濤. 2005. 蘭花選育種研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，21（12）：272-276. [Zeng B Y，Zhu G F，Liu H T. 2005. Progress on selecting and breeding of orchid[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，21（12）：272-276.]

周麗，胡春根. 2016. 送春與多花蘭種間雜交后代的ISSR分析[J]. 廣西植物，36（8）：949-955. [Zhou L，Hu C G. 2016.ISSR analysis of interspecific hybrids descendants of Cymbidium cyperifolium var. Szechuanicum and C. floribundum[J]. Guihaia，36（8）：949-955.]

Qian X，Li Q J，Liu F，Gong M J，Wang C X，Tian M. 2014. Conservation genetics of an endangered Ladys Slipper Orchid：Cypripedium japonicum in China[J]. International Journal of Molecular Sciences，15（7）：11578.

Yao X，Li G，Yang B. 2007. Genetic diversity of wild Cymbi-dium goeringii（Orchidaceae） populations from Hubei based on Inter-simple sequence repeats analysis[J]. Frontiers of Biology in China，2（4）：419-424.

Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，20（2）：176-183.

（責(zé)任編輯 陳 燕）